一種液相制備阿托西班的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域，特別涉及一種液相制備阿托西班的方法。
技術(shù)背景
[0002]阿托西班(atosiban)是子宮內(nèi)及蛻膜、胎膜上受體的環(huán)狀肽催產(chǎn)素競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，在臨床上使用其醋酸鹽治療早產(chǎn)。阿托西班可劑量相關(guān)性地抑制宮縮，并使環(huán)狀肽催產(chǎn)素介導(dǎo)的前列腺素分泌減少，從而達(dá)到保胎的目的。醋酸阿托西班注射液(AtosibanAcetateInject1n)由輝凌公司(Ferring AB)研制，2000年3月首次在奧地利上市。
[0003]阿托西班是一條由9個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀多肽，肽鏈中包含3個(gè)非天然氨基酸D-Tyr(Et)、Mpa和Orn以及在Mpa與Cys之間形成的一對(duì)二硫鍵，C端為酰胺的形式，其結(jié)構(gòu)式為:c[Mpa-D-Tyr(Et)-1Ie-Thr-Asn-Cys]-Pro-0rn-Gly-NH2。
[0004]關(guān)于阿托西班的制備方法，大多采用固相合成或固液結(jié)合:如美國(guó)專(zhuān)利US4504469采用Boc策略固相合成線性肽，用液氨切肽，再經(jīng)液相氧化、純化得醋酸阿托西班，操作復(fù)雜，不利于工業(yè)生產(chǎn)；國(guó)內(nèi)專(zhuān)利CN200810043347.9XN200910008880.6均采用固相合成法，將氨基酸逐個(gè)連接到樹(shù)脂上，再用樹(shù)脂上碘氧化的方法形成二硫鍵，解決了空氣液相氧化中溶解性差反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)的技術(shù)問(wèn)題;CN201310411997.5先采用固相合成法合成線性肽，再使用I %TFA/DCM去除Cys(Trt)上的保護(hù)基Trt，接下來(lái)加氧化試劑固環(huán)得到環(huán)肽樹(shù)脂，最后裂解得到阿托西班，解決了現(xiàn)有空氣液相氧化帶來(lái)大量廢液，生產(chǎn)落后，效能不高以及碘作為氧化劑氧化的副產(chǎn)物多的技術(shù)問(wèn)題;CN201010604790.6采用固相合成線性粗肽，再將線性阿托西班溶于乙腈水溶液中，用過(guò)氧化氫氧化法形成二硫鍵的方法進(jìn)行阿托西班的合成，該方法解決了線性阿托西班難溶問(wèn)題，最大可能的縮小了反應(yīng)體積及減少了反應(yīng)時(shí)間。
[0005]以上方法均需要使用多肽固相合成專(zhuān)用設(shè)備，而且大量的樹(shù)脂和洗滌溶劑使得合成成本很高，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)。
[0006]專(zhuān)利CN201310129543.9使用液相合成法合成五肽中間體H-1Ie-ThHBzD-Asn-CyMBzD-Pro-OH，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)阿托西班的液相合成，雖然解決了固相合成法設(shè)備復(fù)雜、成本高、不適宜大規(guī)模生產(chǎn)的問(wèn)題，但是使用該中間體需要分3段合成線性肽，工序復(fù)雜，所用的芐基保護(hù)基Bzl需用氫解或液氮/鈉處理除去，反應(yīng)條件苛刻，而且在安全性方面存在隱患，對(duì)生產(chǎn)操作有較大的限制。
[0007]綜上所述，從成本上來(lái)看，液相合成法比固相合成法成本低、更適宜大規(guī)模生產(chǎn)，但是使用芐基作為側(cè)鏈保護(hù)基的液相合成法在操作難度上限制了生產(chǎn)操作，而且分3段合成線性肽工序復(fù)雜，因此，仍然需要找到一種工序簡(jiǎn)單、操作難度低的液相合成方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供一種全液相合成方法，先分別合成片段四肽Mpa(Trt)-D-Tyr(Et)-1le-Thr(tBu)-0H 和片段五肽 Mfe-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Mfe,然后將兩個(gè)片段相連接、裂解除去側(cè)鏈保護(hù)基得到阿托西班線性粗肽，再進(jìn)行液相氧化、純化、凍干得到阿托西班。
[0009 ]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0010]—種液相制備阿托西班的方法，包括以下步驟:
[0011](1)、!^811-0!1和三氟乙酸酐反應(yīng)制備了€3-4811-0!1;
[0012](2)、液相條件下，Tfa-Asn-OH和H-Cys(Trt)-0H、H-Pro-0H、H-0rn(Boc)-0H、H-Gly_NH2 依次偶聯(lián)，合成片段 Tf a-Asn-Cy s (Trt)-Pro-Orn (Boc)-Gly_NH2，脫去 N端 Tf a 保護(hù)基，得五肽片段[5-9 ]: Mfe-Asn-Cys (Trt)-Pro-Orn (Boc)-GIy-Mfe ；
[0013](3)、液相條件下，Mpa(Trt)-OH 和 H-D-Tyr(Et)-0H、H-1le-0H、H-Thr(tBu)-0H 依次偶聯(lián)，合成四肽片段[1-4]: Mpa (Trt)-D-Tyr (Et)-1 I e-Thr (tBu)-OH ；
[0014](4)、液相條件下四肽片段[1-4]和五肽片段[5-9]偶聯(lián)得側(cè)鏈保護(hù)基的全保護(hù)肽鏈:Mpa(Trt)-D-Tyr(Et)-1Ie-Thr(tBu)-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Mfe ；
[0015](5)、將步驟(4)中肽鏈經(jīng)裂解、沉降、分離得阿托西班線性粗肽:Mpa-D-Tyr(Et)-1Ie-Thr-Asn-Cys-Pro-0rn-Gly-NH2 ；
[0016](6)、將步驟(5)中的粗肽經(jīng)液相氧化、制備液相純化、濃縮凍干后得阿托西班精肽:c[Mpa-D-Tyr(Et)-1Ie-Thr-Asn-Cys]-Pro-0rn-Gly-NH2。
[0017]上述步驟(I)中Tfa-Asn-OH的制備方法為:將H-Asn-OH溶解于三氟乙酸中，-10°C的條件下加入三氟乙酸酐，升溫到10°c，攪拌30分鐘，30°C減壓濃縮，加入熱甲苯，放置，過(guò)濾收集結(jié)晶，干燥后重結(jié)晶，即得Tf a-Asn-OH，其中H-Asn-OH和三氟乙酸酐的摩爾比為1:1?1.2。
[0018]上述步驟(2)中片段Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Mfe 的制備方法為:
[0019](2a)、Tfa-Asn-Cys(Trt)-OH的制備
[0020]將步驟(I)中制備的Tfa-Asn-OH和HOSu溶于有機(jī)溶劑中，加入DCC，室溫反應(yīng)，經(jīng)過(guò)濾、濃縮、石油釀析晶得Tf a-Asn-OSu ；
[0021 ] 將Tfa-Asn-OSu加入H-Cys(Trt)-OH的堿性鹽溶液中，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，調(diào)節(jié)溶液pH2?3，乙酸乙酯萃取，經(jīng)濃縮、石油醚析晶、干燥、重結(jié)晶得Tfa-Asn-Cys (Trt)-OH;
[0022](2b)、Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-OH的制備
[0023]將步驟(2a)中制備的Tfa-Asn-Cys(Trt)-OH和HOSu溶于有機(jī)溶劑中，加入DCC，室溫反應(yīng)，經(jīng)過(guò)濾、濃縮、石油醚析晶得Tfa-Asn-Cy s (Trt) -OSu ；
[0024]將Tfa-Asn-Cys(Trt)-OSu加入H-Pro-OH的堿性鹽溶液中，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，調(diào)節(jié)溶液pH值2?3，乙酸乙酯萃取，經(jīng)濃縮、石油醚析晶、干燥、重結(jié)晶得Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-OH；
[0025](2 c)、Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-OH的制備
[0026]將步驟(2b)中制備的Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-OH和HOSu溶于有機(jī)溶劑中，加入DCC，室溫反應(yīng)，經(jīng)過(guò)濾、濃縮、石油醚析晶得Tf a-Asn-Cys (Trt)-Pro-OSu;
[0027]將Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-OSu 加入 H-Orn(Boc)-OH 的堿性鹽溶液中，TLC 檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，調(diào)節(jié)溶液PH值至2?3，乙酸乙酯萃取，經(jīng)濃縮、石油醚析晶、干燥、重結(jié)晶得Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-OH；
[0028](2d) 'Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Mfe的制備[0029 ]將步驟(2C)中制備的 Tfa-Asn-Cys (Trt) -Pro-Orn (Boc) -OH 和 HOSu 溶于有機(jī)溶劑中，加入DCC，室溫反應(yīng)，經(jīng)過(guò)濾、濃縮、石油醚析晶得Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-OSu ；
[0030]將Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-OSu加入H-Gly_NH2.HCl的喊性鹽溶液中，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，調(diào)節(jié)溶液pH值至2?3，乙酸乙酯萃取，經(jīng)濃縮、石油醚析晶、干燥、重結(jié)晶得Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Mfe ；
[0031 ]其中反應(yīng)步驟(2a)、(2b)、(2c)、(2d) *:Tfa-Asn-OH、Tfa-Asn-Cys(Trt)_OH、Tfa-Asn-Cy s (Trt)-Pro-OH、Tfa-Asn-Cy s (Trt)-Pro-Orn(Boc)-OH 分別與 HOSu 和 DCC 的摩爾比為1:1?I.1:1?I.I ；H-Cys(Trt)-OH^H-Pro-OH^H-Orn(Boc)-OH^H-Gly-NH2.HCl分別與堿性鹽的摩爾比為1:1?2;Tfa-Asn-Osu與H-Cys(Trt)-OH、Tfa-Asn-Cys(Trt)-Osu與H-Pro-OH、Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Osu與H-Orn(Boc)-OH、Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Osu與H-Gly-NH2.HCl的摩爾比為 1:0.8?1.2。
[0032]上述步驟(2)中脫去N端Tfa保護(hù)基的方法為:將片段Tfa-Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-NH2加入到IM的哌啶水溶液中溶解，攪拌反應(yīng)20?24h，調(diào)溶液pH值至2?3，乙酸乙酯萃取，濃縮、石油醚析晶、干燥、重結(jié)晶得五肽片段[5-9] [NH2_Asn-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-NH2Jo
[0033]上述步驟(3)中四肽片段[1-4][Mpa(Trt)-D-Tyr (Et)-1le-Thr(tBu)-OH]的制備方法為:
[0034](3a)、Mpa(Trt)-D-Tyr(Et)-OH的制備:
[0035]將Mpa (Trt) -OH和HOSu溶于有機(jī)溶劑中，加入DCC，室溫反應(yīng)，經(jīng)過(guò)濾、濃縮、石油醚析晶得Mpa(Trt)-OSu；
[0036]將Mpa(Trt)-OSu加入H-D-Tyr(Et)-OH.HCl的堿性鹽溶液中，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，調(diào)節(jié)溶液pH值至2?3，乙酸乙酯萃取，經(jīng)濃縮、石油醚析晶、干燥、重結(jié)晶得Mpa (Trt) -D-Tyr(Et)-OH；
[0037](3b)、Mpa(Trt)-D-Tyr(Et)-1le-0H的制備:
[0038]將步驟(3a)中制備的Mpa(Trt)-D-Tyr(Et)-0H和HOSu溶于有機(jī)溶劑中，加入DCC，室溫反應(yīng)，經(jīng)過(guò)濾、濃縮、石油醚析晶得Mpa (Trt) -D-Tyr (Et) -OSu ；
[0039