RRP-5、DRRP-9和DRRP-10的下胚軸平均長(zhǎng)度分別為0.48cm、0.51cm和0.52cm，分別為野 生型的1.21倍、1.31倍和1.33倍。ZmDRRP基因在PEG模擬的干旱環(huán)境中表達(dá)量升高。表明，干 旱環(huán)境可以誘導(dǎo)ZmDRRP基因的表達(dá)，來提高植物的抗旱性。
【附圖說明】
[0069] 圖1為干旱脅迫前后轉(zhuǎn)ZmDRRP基因植株的生長(zhǎng)狀況及存活率。其中，A為植株的生 長(zhǎng)狀況，B為存活率。
[0070] 圖2為干旱脅迫前后轉(zhuǎn)ZmDRRP基因植株花青苷含量的變化情況。
[0071 ]圖3為野生型和過表達(dá)ZmDRRP轉(zhuǎn)基因植株在甘露醇豎板上的根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)。
[0072] 圖4為不同干旱時(shí)間處理下ZmDRRP基因的表達(dá)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0073]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0074] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0075] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0076] 下述實(shí)施例中的玉米齊319(Hao et al.A proposed selection criterion for drought resistance across multiple environments in maize.Breeding Science. 2011.61:101-108)公眾可從申請(qǐng)人處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí) 驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0077]下述實(shí)施例中的載體pCHF3 (王愛萍，景蕊蓮，楊武德，董琦.小麥TaMyb2基因轉(zhuǎn)化 擬南芥表達(dá)載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào).2008.14:750-752.)經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè) 科學(xué)院作物科學(xué)研究所景蕊蓮老師同意后公眾可從申請(qǐng)人處獲得該生物材料，該生物材料 只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0078]下述實(shí)施例中的農(nóng)桿菌GV3101-pMP為北京博邁德基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目 錄號(hào)為BC304-01。
[0079] 下述實(shí)施例中的玉米自交系鐵7922 (Hao et a 1 ? A proposed se 1 ect ion criterion for drought resistance across multiple environments in maize .Breeding Science. 2011.61:101-108)公眾可從申請(qǐng)人處獲得，該生物材料只為重 復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0080] 實(shí)施例1、利用ZmDRRP基因抗旱轉(zhuǎn)基因擬南芥
[0081] 本實(shí)施例提供了來源于玉米齊319的ZmDRRP基因，其核苷酸序列如序列表中序列2 所不，編碼序列1所不的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的名稱為ZmDRRP。
[0082] 一、轉(zhuǎn)ZmDRRP基因擬南芥的構(gòu)建
[0083] 1、重組載體和重組農(nóng)桿菌的構(gòu)建
[0084] 通過載體pCHF3的Sma I識(shí)別序列在載體pCHF3的Sma I識(shí)別序列處的插入序列2所示 的DNA分子（即ZmDRRP基因）得到重組載體，將該重組載體命名為pCHF3-ZmDRRP，pCHF3-ZmDRRP與載體pCHF3的差別僅在于:pCHF3-ZmDRRP為在載體pCHF3的Sma I識(shí)別序列處插入 序列2所示的DNA分子得到的重組載體。pCHF3-ZmDRRP表達(dá)序列1所示的ZmDRRP。
[0085] 分別將載體pCHF3與pCHF3-ZmDRRP導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101-pMP中，分別得到含有載體 PCHF3的重組農(nóng)桿菌與含有pCHF3-ZmDRRP的重組農(nóng)桿菌，將其分別命名為GV3101-pCHF3與 GV3101-pCHF3-ZmDRRP〇
[0086] 2、重組農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化擬南芥
[0087] 1)用接種針沾取經(jīng)步驟1的pCHF3-ZmDRRP，在含有抗生素的固體培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基 為向YEB培養(yǎng)基中加入利福平、慶大霉素和卡那霉素得到的固體培養(yǎng)基，其中，利福平的濃 度為30yg/mL，慶大霉素的濃度為30yg/mL，卡那霉素的濃度為50yg/mL)劃線，28°C暗培養(yǎng)2-4天；
[0088] 2)挑取1)的單菌落接種于2-3mL含有抗生素的液體培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基為向YEB培養(yǎng) 基中加入利福平、慶大霉素和卡那霉素得到的液體培養(yǎng)基，其中，利福平的濃度為30yg/mL， 慶大霉素的濃度為30yg/mL，卡那霉素的濃度為50yg/mL)，28°C210rpm/min培養(yǎng)過夜；
[0089] 3)取lmL步驟2)得到的菌液接種于200mL步驟2)所述的含有抗生素的液體培養(yǎng)基 中，28°C210rpm/min培養(yǎng)過夜至菌液呈現(xiàn)橘黃色；
[0090] 4)將步驟3)得到的菌液倒入滅菌的離心杯中，室溫，5000rpm，15min離心收集菌 體；
[0091] 5)將步驟4)得到的菌體懸浮于1 OOmL的轉(zhuǎn)化滲透液(轉(zhuǎn)化滲透液為向1 /2MS中加入 蔗糖和siLwet得到的液體，轉(zhuǎn)化滲透液中蔗糖的濃度為5g/100mL，siLwet的濃度為0.02 % (體積百分比濃度）中，得到農(nóng)桿菌懸浮液；
[0092] 6)將野生型哥倫比亞生態(tài)型擬南芥（大部分的擬南芥的花蕾處于即將開花狀態(tài)） 整個(gè)花序進(jìn)入步驟5)得到的農(nóng)桿菌懸浮液中30s后放于托盤中，黑暗保濕培養(yǎng)24h，然后放 于正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)(擬南芥侵染1周后根據(jù)擬南芥的生長(zhǎng)狀態(tài)可再次侵染以提高轉(zhuǎn)化 效率），得到T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥，將該T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥命名為T0代轉(zhuǎn)ZmDRRP基因擬南芥。 收獲T1代轉(zhuǎn)ZmDRRP基因種子。將T1代轉(zhuǎn)ZmDRRP基因種子在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩 選，將具有卡那霉素抗性的植株在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，收獲T2代轉(zhuǎn)ZmDRRP基因種子。將T2 代轉(zhuǎn)ZmDRRP基因種子在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，將具有卡那霉素抗性的植株在 正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，得到T2代轉(zhuǎn)ZmDRRP基因植株，收獲T3代轉(zhuǎn)ZmDRRP基因種子。
[0093] 按照步驟1 )-6)的方法，將pCHF3-ZmDRRP替換為載體pCHF3，其他步驟均不變，將得 到的轉(zhuǎn)基因擬南芥命名為轉(zhuǎn)空載體擬南芥，按照步驟6)的方法進(jìn)行篩選得到T3代轉(zhuǎn)空載體 植株。
[0094] 3、轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定
[0095] 3.1基因組水平上的鑒定
[0096] 提取T3代轉(zhuǎn)ZmDRRP基因植株的基因組DNA，用引物01?1^-003(01?1^〇(18?:5'- ATGGCGATGGCGTACAAG-3 ' ； DRRPcdsR: 5 ' -CGCAGCGGGGGCCTCATT-3 '）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到三個(gè) PCR產(chǎn)物中含有目的條帶的株系，分別命名為DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10。
[0097] 3.2RNA水平的鑒定
[0098] 提取步驟2的T3代轉(zhuǎn)空載體植株、DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10的RNA，進(jìn)行定量PCR檢 測(cè)植株體內(nèi)ZmDRRP基因的表達(dá)情況，用到的引物為01?1^-1?1'(01^8以？：5'-TGCTCAGTAGTCAGTAGTC-3 ' ； DREBrtR: 5 ' -ACCCATCAACATCAACAC-3 '），內(nèi)參為GAPDH基因（甘油 醛-3-磷酸脫氫酶基因），內(nèi)參的引物為GAPDHF: 5 ' -CATCACCACGGACTACAT-3 ' ； GAPDHR: 5 ' -GACTCCACGACATACTCA-3 '），結(jié)果顯示，DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10 中均有ZmDRRP基因的表達(dá)， T3代轉(zhuǎn)空載體植株中無ZmDRRP基因的表達(dá)。
[0099]二、轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性分析
[0100] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的具體步驟如下：
[0101] 1、干旱脅迫處理
[0102] 將處于兩葉期的野生型擬南芥、步驟一的T3代轉(zhuǎn)空載體植株以及DRRP-5、DRRP-9 和DRRP-10分別移栽至蛭石與營(yíng)養(yǎng)土為3:1的混合土中，每個(gè)株系81株。每個(gè)株系移栽前澆 足水，移栽1周后停止?jié)菜?6h光/8h暗(長(zhǎng)日照），22 °C下干旱脅迫3周，3周后復(fù)水3天。 [0103] 野生型擬南芥(1!')、01?^-5、01?1^-9和01?1^-10干旱脅迫前后的結(jié)果如圖1所示，在 干旱脅迫后，野生型擬南芥與T3代轉(zhuǎn)空載體植株的葉片均枯萎卷曲，而DRRP-5、DRRP-9和 DRRP-10的葉片仍硬挺；復(fù)水三天后，野生型擬南芥與T3代轉(zhuǎn)空載體植株均全部死亡，而 DRRP-5、DRRP-9和DRRP-10的死亡率均低于20% (存活率均超8