短雙歧桿菌及牛奶中多種抗生素殘留的檢測方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生命科學(xué)和食品安全領(lǐng)域;設(shè)及一株短雙歧桿菌及利用該菌株進行牛 奶中抗生素殘留的快速檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛奶安全不僅關(guān)系到廣大人民群眾的健康，也是乳品企業(yè)的命脈。牛奶中抗生素 殘留是牛奶安全的一個重要問題。隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，奶產(chǎn)量大幅度提高。為預(yù)防 疾病和治療乳房炎等疾病，抗生素類獸藥在畜牧業(yè)的應(yīng)用日益廣泛，在應(yīng)用抗生素治療奶 牛疾病在取得效果的同時，不規(guī)范使用抗生素如增加使用劑量和延長治療期，甚至給泌乳 期奶牛長期應(yīng)用抗生素預(yù)防疾病等使牛奶中不僅存在抗生素殘留，而且往往是殘留抗生素 含量較高。
[0003] 我國許多乳制品不符合需進口國家和地區(qū)的要求，其中抗生素殘留超標是重要限 制因素。牛奶中抗生素殘留不僅給牛奶生產(chǎn)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)帶來損失，同時也對消費者的身體 健康帶來諸多潛在的危害。隨著人民生活水平的提高和對生物安全和食品安全的重視，抗 生素殘留已成為牛奶食品安全中全社會關(guān)注的重點。為適應(yīng)國內(nèi)外日益嚴格的要求，W及 市場和進出口快速通關(guān)的需要，建立一種簡單、快速、有效檢測牛奶中多種抗生素殘留的方 法具有重要意義。
[0004] 有關(guān)文獻或方法中多種抗生素藥物殘留的檢測方法基本上是對每一類藥物進行 分別檢測，分析方法包括色譜法、色/質(zhì)聯(lián)用法、薄層色譜、免疫測定法和微生物抑制法等。 我國常用橫胺類、哇諾酬類、e-內(nèi)酷胺類、四環(huán)素類、氯霉素類共5大類33種獸藥的藥物，其 化學(xué)分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)差異較大，不易同時檢測。同時對牛奶中多種抗生素殘留進行檢 測有一定困難，目前我國食品衛(wèi)生標準(GB/T 4789.27-2008)中規(guī)定TTC法檢測牛奶中抗生 素殘留，該法設(shè)備簡單、費用低，但靈敏度低、易假陽性，在檢測青霉素和氯霉素上敏感度與 枯草桿菌紙片法大致相等，但對鏈霉素不太敏感，對新霉素不敏感，消毒劑可干擾試驗。
[0005] 微生物抑制法操作簡便，儀器設(shè)備和人員要求均不高，樣品前處理簡單，檢測時間 短等特點，一直被用于大批量樣品的過篩。本發(fā)明主要應(yīng)用對e-內(nèi)酷胺類、大環(huán)內(nèi)醋類、四 環(huán)素類敏感的益生菌，建立一種快速篩檢和定量檢測青霉素、紅霉素和四環(huán)素的微生物抑 制法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是篩選出不易被雜菌污染影響并對殘留抗生素敏感的雙歧桿菌菌 株，并由此建立一種簡單、快速、靈敏的W該菌株為工作菌株進行牛奶中抗生素殘留檢測的 篩選和定量檢測方法，該方法采用殘留抗生素對菌株的生長抑制作用來確認牛奶中是否有 抗生素殘留是否超過國家標準，可有效檢測牛奶中殘留抗生素存在狀況及含量。
[0007] 本發(fā)明提供一株對0內(nèi)酷胺類抗生素敏感的并應(yīng)用于牛奶中抗生素殘留檢測的短 雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)DSQH-l。
[000引本發(fā)明的短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve)DSQH-l，于2013年12月13日保藏 在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，其簡稱為CGMCC(地址:北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為短雙歧桿菌 (Bifidobacterium breve),保藏編號為CGMCC No.8579。
[0009] 本發(fā)明的短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)DSQH-1分離自一名浙江省母乳喂 養(yǎng)兒童(男性)糞便。
[0010] 本發(fā)明的短雙歧桿菌DSQH-I菌株具有W下微生物學(xué)特征：
[0011] (1)菌落形態(tài):短雙歧桿菌DSQH-I菌株在TPY固體平板上的菌落直徑1.2-1.5mm、圓 形、凸起、邊緣整齊、乳白色、不透明，具有光澤，質(zhì)地柔軟、細膩；
[0012] (2)菌體形態(tài):革蘭染色陽性無芽抱桿菌，菌體呈棒桿狀，一端或兩端膨大，有彎曲 或分叉現(xiàn)象，形成特有的"Y"、"V"形結(jié)構(gòu)。
[0013] (3)生理生化特征:觸酶陰性，分解葡萄糖、薦糖、麥芽糖、果糖和半乳糖，不分解淀 粉、纖維二糖、心阿拉伯糖、木糖、海藻糖、菊糖，硝酸鹽還原陰性，說基質(zhì)試驗陰性。
[0014] (4)培養(yǎng)特征:厭氧生長良好，有氧不生長。最適生長溫度37°C-42°C，最低生長溫 度25°C，最高生長溫度45°C ;最適P冊.5-7.0，pH低于5.0或高于8.0不生長。
[0015] 本發(fā)明還提供一種牛奶中抗生素殘留的快速檢測方法，所述方法包括W下步驟：
[0016] (1)菌株活化:將權(quán)利要求1所述的短雙歧桿菌DSQH-I菌株接種于TPY固體培養(yǎng)基， 37 °C培養(yǎng)24-4化；
[0017] (2)菌懸液制備：取步驟（1)所得的短雙歧桿菌DSQH-I菌株TPY液體中，37 °C、 200rpm震蕩培養(yǎng)4-5小時，3000rpm離屯、5分鐘，用PBS調(diào)整菌液0D600的值為0.15-0.20，4°C 保存；
[001引（3)篩檢培養(yǎng)基制備：W重量計，取蛋白腺，2.5g，酵母浸膏3.Og,葡萄糖4.Og,可溶 性淀粉l.Og，氯化鋼l.Og，牛肉膏l(xiāng).0g，K2HP04 0.6g，K此P04 0.6g，吐溫-80 O.lmL，蒸饋水 I OOmL。加入黃豆浸液300血，調(diào)節(jié)pH至6.5-6.8,分裝每管10ml，包裝后115 °C高壓滅菌15-20 分鐘，冷卻后置4 C保存、備用；
[0019] (4)定量檢測培養(yǎng)基制備，W重量計，取蛋白腺lOg，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，乙酸 鋼5g，K2HP〇4 2g，MgS〇4.7出0 0.5g，MnS〇4.4此0 0.2g，低聚果糖3g，巧樣酸二錠2g，吐溫-80 IML，用1000 mL蒸饋水溶解，調(diào)節(jié)抑至6.5-6.8，分裝每管19.5血，包裝后115 °C高壓滅菌15-20分鐘，冷卻后置4 C保存、備用；
[0020] (5)標準管制備:取青霉素、四環(huán)素和紅霉素標準儲備液，用抑8.0憐酸鹽緩沖液稀 釋配制成不同濃度的抗生素標準工作液;氨節(jié)青霉素10化g/L、50yg/L、4化g/L、20yg/L、l化 邑/1、5蛇/1、4蛇/1、2蛇/1、1雌/1的標準工作液；四環(huán)素500蛇/1、45化旨/1、400蛇/1、35化邑/ 1^、300蛇/1、250蛇/1、200蛇/1、15化旨/1、100蛇/1、50蛇/1的標準工作液;紅霉素100蛇/1、80 iig/L、60iig/L、40iig/L、20iig/L、1 Oiig/L的標準工作液;4 °C 冷藏備用；
[0021] (6)標準曲線制備:取步驟(3)制備的定量檢測培養(yǎng)基，分別加入步驟(5)不同濃度 的抗生素標準工作液40化L，W化g/L為生長對照?；靹蚝蠹尤氩襟E(2)制備的菌液10化L，混 勻后40°C、厭氧培養(yǎng)12-16小時;測定600nm波長下各濃度檢測管的吸光度值，W標準系列管 中加入抗生素濃度值為縱坐標，吸光度值為橫坐標，繪制標準曲線；
[0022] (7)樣品準備:取樣品IOmL于無菌試管中，80°C水浴30分鐘；
[0023] (8)樣品檢測:篩檢取步驟(7)所得的樣品，等體積加入到步驟(4)所得的篩檢檢測 管中，加入步驟(2)所得的菌液，40°C厭氧培養(yǎng)6-8小時；牛奶出現(xiàn)凝固或出現(xiàn)紅色為抗生素 殘留低于國家標準，不凝固、呈黃色為抗生素殘留超標。定量檢測取步驟(7)所得的樣品，加 入到步驟(4)所得的檢測管中，加入步驟(2)所得的菌液，40°C厭氧培養(yǎng)12-16小時；W培養(yǎng) 基調(diào)零，測定樣品管陰性對照管的0D600,從標準曲線上讀取抗生素濃度值(iig/L)。
[0024] 本發(fā)明的工作菌株為短雙歧桿菌DSQH-I，保藏編號為CGMCC No.8579。
[0025] 本發(fā)明所述的牛奶樣品包括:液態(tài)乳、復(fù)原乳。
[0026] 本發(fā)明所述的氨節(jié)青霉素標準曲線是通過下述方法得到:利用氨節(jié)青霉素儲備液 配制濃度分別為 1 〇〇yg/L、50yg/L、40yg/L、20yg/L、10yg/L、扣g/L、化g/L、化g/L、化 g/L的標 準工作液，W化g/L為陰性對照。取各濃度的氨節(jié)青霉素標準工作液40化L加入到19.5mL的 定量檢測培養(yǎng)基中混勻，再加入檢測菌液10化L，40°C厭氧培養(yǎng)12-1化，測定600nm波長下各 濃度檢測管的吸光度值，W抗生素濃度值為縱坐標，吸光度值為橫坐標，繪制標準曲線。得 到標準曲線回歸方程為Y = -166.72X+95.431(Y:樣品中氨節(jié)青霉素濃度iig/L，X:反應(yīng)管的 0D600值），線性范圍為l-100yg/L，R2為0.9941。
[0027] 本發(fā)明所述的四環(huán)素標準曲線是通過下述方法得到:利用四環(huán)素儲備液配制濃度 分別為50yg/L、100yg/L、150yg/L、200yg/L、250yg/L、300yg/L、350yg/L、400yg/L、450yg/L、 500yg/L的四環(huán)素標準工作液，W〇yg/L為陰性對照。方法同前，得到標準曲線回歸方程為Y 二-858.84X+461.7(Y:樣品中四環(huán)素濃度yg/L，X:反應(yīng)管的0D600值），線性范圍為50-500y g/L，R2 為0.9944。
[0028] 本發(fā)明所述的紅環(huán)素標準曲