一種利用固定化乳糖酶制備無(wú)乳糖乳制品的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開(kāi)了一種利用固定化乳糖酶制備無(wú)乳糖乳制品的方法，屬于無(wú)乳糖乳制品制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]無(wú)乳糖是指用某種工藝(乳糖酶)去除了奶中的乳糖，乳糖酶分泌過(guò)少的人應(yīng)該食用無(wú)乳糖的奶制品。
[0003]乳糖是動(dòng)物乳汁中一種特有雙糖，不能被人體直接吸收，必須經(jīng)過(guò)乳糖酶水解成半乳糖和葡萄糖，而亞洲人由于沒(méi)有日常飲用乳的習(xí)慣，很大一部分人群體內(nèi)缺乏乳糖酶，喝牛奶后的典型表現(xiàn)是拉肚子，即乳糖不耐癥。另外發(fā)酵乳在發(fā)酵的過(guò)程中，雖然一部分乳糖被分解，但是還有一定量的乳糖殘留，乳糖不耐癥嚴(yán)重者飲食發(fā)酵乳也會(huì)發(fā)生不適反應(yīng)，同時(shí)，未有癥狀的乳糖不耐癥患者，對(duì)發(fā)酵乳營(yíng)養(yǎng)的吸收也大打折扣。因此，研發(fā)一種低乳糖甚至無(wú)乳糖的發(fā)酵乳具有重要的意義。
[0004]目前傳統(tǒng)方法在制備無(wú)乳糖乳制品時(shí)，采用將乳糖酶加入鮮牛奶中將乳糖水解為葡糖糖和半乳糖，然后再接種發(fā)酵劑制得發(fā)酵乳，或者是將乳糖酶加入牛奶中并同時(shí)接種發(fā)酵劑制得低乳糖發(fā)酵乳，雖然該方法降低了發(fā)酵乳中乳糖的含量，但乳糖含量降低仍未達(dá)到國(guó)標(biāo)規(guī)定的無(wú)乳糖限量，對(duì)乳糖不耐癥患者嚴(yán)重的人仍然不適用，而且由于酸奶發(fā)酵過(guò)程中PH會(huì)持續(xù)降低，在中性奶中適用的乳糖酶在發(fā)酵階段酶活性會(huì)降低甚至失效，導(dǎo)致酶解效率大幅降低，即使在配料過(guò)程中加大乳糖酶的使用量也無(wú)法制得國(guó)標(biāo)限定的無(wú)乳糖發(fā)酵乳。
[0005]除此以外，目前乳糖酶并未在中國(guó)食品和乳制品工業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用，主要原因是:(I)乳糖酶的單位產(chǎn)量較低；(2)市場(chǎng)上銷售的乳糖酶多為胞內(nèi)酶，酶的耐熱性差、適用范圍窄，且這種酵母來(lái)源的胞胞內(nèi)酶，需破碎細(xì)胞才能得到，提取、純化工藝繁雜，另外生活中適用的乳糖酶往往為游離酶，不僅成本高、適用范圍窄，而且不能滿足食品和乳制品工業(yè)多方面的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題:針對(duì)目前在制備無(wú)乳糖乳制品的過(guò)程中，往往使用游離的乳糖酶對(duì)原料乳進(jìn)行酶解，導(dǎo)致在發(fā)酵階段酶活性會(huì)降低甚至失效，酶解效率大幅度降低，即使加大乳糖酶的使用量也無(wú)法制得國(guó)標(biāo)限定的無(wú)乳糖發(fā)酵乳的現(xiàn)狀，提供了一種通過(guò)脆壁克魯維酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)制得粗酶液，經(jīng)鹽析、脫鹽制得純化乳糖酶，將其用戊二醛交聯(lián)固定在凹凸棒土上，制得固定化乳糖酶，再將其用于原料乳的酶解中，從而得到利用固定化乳糖酶制備無(wú)乳糖乳制品的方法。該方法操作簡(jiǎn)便，不僅利用固定化乳糖酶提高了酶的穩(wěn)定性，降低了發(fā)酵乳中乳糖的含量，達(dá)到了國(guó)家規(guī)定的無(wú)乳糖標(biāo)準(zhǔn)，而且制得的無(wú)乳糖發(fā)酵乳產(chǎn)品口味極佳、營(yíng)養(yǎng)豐富，容易被人體吸收，適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。
[0007 ]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是: (1)按接種量為10%將脆壁克魯維酵母菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基上，移入恒溫箱中于30?35°C下培養(yǎng)3?4天，用棉簽刮下孢子移入200?300mL滅菌后的質(zhì)量濃度為0.9%的鹽水中，放置在漩渦振蕩儀中，以30?40W功率振蕩分散30?40min制得孢子懸液，通過(guò)滅菌后的漏斗過(guò)濾，得孢子；
(2)再按IX 14?2X 14個(gè)/mL的接種量，將上述所得的孢子轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25?35°C條件下培養(yǎng)7?8天后過(guò)濾，得到發(fā)酵液，再用雙層濾紙抽濾去除多余孢子，即得粗酶液；
(3)量取300?400mL得到的粗酶液，向里加入10?12g硫酸銨，于4?6°C的冰水浴中靜置鹽析12?14h后用高速離心機(jī)以10000?12000r/min轉(zhuǎn)速離心分離得到沉淀，最后用pH為5.5的醋酸和醋酸鈉緩沖液洗滌脫鹽后即得純化乳糖酶，備用；
(4)稱取100?200g凹凸棒土用研缽研磨后過(guò)100目標(biāo)準(zhǔn)篩，分別用濃度為0.lmol/L鹽酸和0.3mol/L氫氧化鈉溶液搖床振蕩浸漬10?12h，再放入馬弗爐于300?400 °C下煅燒3?4h，得固定化酶載體；
(5)稱取10?20g固定化酶載體裝入IL錐形瓶中，加入400?500mLpH為7.0由磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉組成的磷酸緩沖液，靜置10?12h后，再加入I?2g備用的純化乳糖酶，移入4?6 °C冰水浴中，用磁力攪拌機(jī)以300?400r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌；
(6)在攪拌的過(guò)程中再加入50?60mL質(zhì)量濃度為2%戊二醛溶液，升高水浴溫度至30?35 V，繼續(xù)攪拌交聯(lián)反應(yīng)4?6h后，過(guò)濾得濾渣，移入布氏漏斗中用pH為7.0磷酸緩沖液反復(fù)抽濾洗滌3?5遍后，即得固定化乳糖酶；
(7)稱取I?2L原料乳、I?2g果膠、3?5g木糖醇和2?3g上述制得的固定化乳糖酶混合均勻后倒入酶解罐，設(shè)置酶解溫度為35?40°C，保溫酶解10?12h后，過(guò)濾回收固定化乳糖酶，將得到的酶解乳制品瞬時(shí)高溫滅菌后即得利用固定化乳糖酶制備的無(wú)乳糖乳制品。
[0008]所述的馬鈴薯培養(yǎng)基是由200?300g馬鈴薯、20?30g葡萄糖、15?20g瓊脂和IL蒸餾水復(fù)配制得。
[0009]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基是由5?1g果膠、20?30g玉米、15?20g豆柏粉、2?3g硝酸銨、10?12g磷酸氫二鉀和IL蒸餾水復(fù)配制得。
[0010]本發(fā)明的應(yīng)用方法是:本發(fā)明利用固定化乳糖酶制備的無(wú)乳糖乳制品無(wú)需冷藏，早上食用早餐時(shí)，飲用200?300mL本發(fā)明制得的無(wú)乳糖乳制品，連續(xù)堅(jiān)持食用20?25天，可明顯感覺(jué)人體抵抗力得到提高，睡眠得到改善，且口味極佳、營(yíng)養(yǎng)豐富，容易被人體吸收。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明方法獨(dú)特新穎，利用固定化乳糖酶代替?zhèn)鹘y(tǒng)游離乳糖酶，不僅提高了酶的穩(wěn)定性，降低了發(fā)酵乳中乳糖的含量，而且使得制得的無(wú)乳糖乳制品達(dá)到了國(guó)家規(guī)定的無(wú)乳糖標(biāo)準(zhǔn)；
(2)本發(fā)明制得的無(wú)乳糖乳制品口味極佳、營(yíng)養(yǎng)豐富，容易被人體吸收，具有較好的市場(chǎng)前景，可大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0012]首先按接種量為10%將脆壁克魯維酵母菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基上，移入恒溫箱中于30?35°C下培養(yǎng)3?4天，用棉簽刮下孢子移入200?300mL滅菌后的質(zhì)量濃度為0.9%的鹽水中，放置在漩渦振蕩儀中，以30?40W功率振蕩分散30?40min制得孢子懸液，通過(guò)滅菌后的漏斗過(guò)濾，得孢子;然后再按I X 14?2X 14個(gè)/mL的接種量，將上述所得的孢子轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25?35°C條件下培養(yǎng)7?8天后過(guò)濾，得到發(fā)酵液，再用雙層濾紙抽濾去除多余孢子，即得粗酶液;接下來(lái)量取300?400mL得到的粗酶液，向里加入10?12g硫酸銨，于4?6°C的冰水浴中靜置鹽析12?14h后用高速離心機(jī)以10000?12000r/min轉(zhuǎn)速離心分離得到沉淀，最后用PH為5.5的醋酸和醋酸鈉緩沖液洗滌脫鹽后即得純化乳糖酶，備用；之后稱取100?200g凹凸棒土用研缽研磨后過(guò)100目標(biāo)準(zhǔn)篩，分別用濃度為0.1 mo I/L鹽酸和
0.3mol/L氫氧化鈉溶液搖床振蕩浸漬10?12h，再放入馬弗爐于300?400°C下煅燒3?4h，得固定化酶載體；隨后稱取10?20g固定化酶載體裝入IL錐形瓶中，加入400?500mL pH為7.0由磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉組成的磷酸緩沖液，靜置10?12h后，再加入I?2g備用的純化乳糖酶，移入4?6 °C冰水浴中，用磁力攪拌機(jī)以300?400r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌;在攪拌的過(guò)程中再加入50?60mL質(zhì)量濃度為2%戊二醛溶液，升高水浴溫度至30?35°C，繼續(xù)攪拌交聯(lián)反應(yīng)4?6h后，過(guò)濾得濾渣，移入布氏漏斗中用pH為7.0磷酸緩沖液反復(fù)抽濾洗滌3?5遍后，即得固定化乳糖酶;最后稱取I?2L原料乳、I?2g果膠、3?5g木糖醇和2?3g上述制得的固定化乳糖酶混合均勻后倒入酶解罐，設(shè)置酶解溫度為35?40°C，保溫酶解10?12h后，過(guò)濾回收固定化乳糖酶，將得到的酶解乳制品瞬時(shí)高溫滅菌后即得利用固定化乳糖酶制備的無(wú)乳糖乳制品。其中所述的馬鈴薯培養(yǎng)基是由200?300g馬鈴薯、20?30g葡萄糖、15?20g瓊脂和IL蒸餾水復(fù)配制得，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基是由5?1g果膠、20?30g玉米、15?20g豆柏粉、2?3g硝酸銨、10?12g磷酸氫二鉀和IL蒸餾水復(fù)配制得。
[0013]實(shí)例I
首先按接種量為10%將脆壁克魯維酵母菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基上，移入恒溫箱中于30°C下培養(yǎng)3天，用棉簽刮下孢子移入200mL滅菌后的質(zhì)量濃度為0.9%的鹽水中，放置在漩渦振蕩儀中，以30W功率振蕩分散30min制得孢子懸液，通過(guò)滅菌后的漏斗過(guò)濾，得孢子;然后再按I X 14個(gè)/mL的接種量，將上述所得的孢子轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25°C條件下培養(yǎng)7天后過(guò)濾，得到發(fā)酵液，再用雙層濾紙抽濾去除多余孢子，即得粗酶液;接下來(lái)量取300mL得到的粗酶液，向里加入1g硫酸銨，于4°C的冰水浴中靜置鹽析12h后用高速離心機(jī)以lOOOOr/min轉(zhuǎn)速離心分離得到沉淀，最后用pH為5.5的醋酸和醋酸鈉緩沖液洗滌脫鹽后即得純化乳糖酶，備用；之后稱取10g凹凸棒土用研缽研磨后過(guò)100目標(biāo)準(zhǔn)篩，分別用濃度為
0.lmol/L鹽酸和0.3mol/L氫氧化鈉溶液搖床振蕩浸漬10h，再放入馬弗爐于300°C下煅燒3h，得固定化酶載體;隨后稱取1g固定化酶載體裝入IL錐形瓶中，加入400mL pH為7.0由磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉組成的磷酸緩沖液，靜置1h后，再加入Ig備用的純化乳