一種制備固定化芳香化酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及制備固定化芳香化酶的方法，具體利用的技術(shù)為表面環(huán)氧基功能化修 飾的介孔娃球吸附法。
【背景技術(shù)】
[0002] 芳香化酶(aromatase)又名〔￥口19，是細(xì)胞色素口450酶系中的一種，是體內(nèi)雌雄激 素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶。它在NADPH存在的條件下，能將雄締二酬和睪酬分別轉(zhuǎn)化為雌酬和雌二 醇，多種對(duì)雌激素有依賴的腫瘤如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、惡性卵巢腫瘤都有芳香化酶的過度 表達(dá)。其中芳香化酶與乳腺癌關(guān)系尤為密切，約60%~70%的乳腺癌的生長(zhǎng)依賴于雌激素。 芳香化酶抑制劑使芳香化酶失去作用，雄激素?zé)o法轉(zhuǎn)化為雌激素，從而阻斷了雌激素作用 下腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。由于芳香化酶只催化雌激素合成的最后一步反應(yīng)，抑制芳香化酶并不 會(huì)影響到體內(nèi)其他激素的合成，因此芳香化酶是預(yù)防和治療激素依賴型乳腺癌的一個(gè)重要 祀點(diǎn)。近年來，芳香化酶抑制劑的問世使得乳腺癌治療邁入了新的階段，并逐漸成為治療絕 經(jīng)后婦女乳腺癌的一線藥物，如來曲挫，依西美坦等。
[0003] 對(duì)芳香化酶抑制劑結(jié)構(gòu)改造和從天然產(chǎn)物中篩選芳香化酶抑制劑的工作是新藥 開發(fā)的研究熱點(diǎn)，但由于種種原因，目前已有的篩選模型已不能滿足國(guó)內(nèi)外新藥開發(fā)產(chǎn)業(yè) 對(duì)于高通量的芳香化酶的活性篩選方法的需求。目前篩選芳香化酶抑制劑的模型主要有兩 種:一種是細(xì)胞株培養(yǎng)法，另一種是W胎盤的微粒體作為芳香化酶的酶源，檢測(cè)手段為放射 性標(biāo)記法或者利用試劑盒檢測(cè)反應(yīng)中產(chǎn)生的雌酬濃度，W此測(cè)定芳香化酶抑制劑的活性。 專利CN 103149186 B發(fā)明了一種利用均相時(shí)間分辨巧光技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)芳香化酶抑制活性進(jìn) 行高通量篩選。W胎盤的微粒體中存在的游離芳香化酶為篩選模型存在W下明顯缺陷：（1) 酶源來之不易，每次篩選試驗(yàn)均需要尋找新鮮人體胎盤來制備微粒體作為芳香化酶的酶 源，原材料獲取存在醫(yī)學(xué)倫理問題；（2)經(jīng)人體胎盤提取的微粒體是多種激素轉(zhuǎn)化酶的混合 物，多種酶會(huì)相互競(jìng)爭(zhēng)催化底物轉(zhuǎn)化為不同產(chǎn)物，而且每次提取得到的混合物種芳香化酶 活力均有差異，無(wú)法有效評(píng)價(jià)待篩選藥物；（5)反應(yīng)后的酶與產(chǎn)物分離困難，無(wú)法回收再利 用。
[0004] 上述游離芳香化酶的缺點(diǎn)成為了芳香化酶抑制劑篩選的瓶頸，而固定化酶技術(shù)與 游離酶相比，具有許多優(yōu)點(diǎn)：（1)極易與底物、產(chǎn)物分離；（2)可W在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)使 用，成本降低；（3)能夠提高酶的穩(wěn)定性等。酶的固定化方法有吸附法、共價(jià)鍵合法、交聯(lián)法 和包埋法。但是由于酶的個(gè)體差異，并沒有一種普適的固定化技術(shù)適用于所有的酶，截止到 目前還沒有一種芳香化酶的固定化技術(shù)公布于世，而芳香化酶作為一個(gè)非常重要的乳腺癌 治療祀點(diǎn)，將其固定化后可W構(gòu)建新型的芳香化酶抑制劑的快速篩選技術(shù)平臺(tái)，為新藥開 發(fā)提供有力的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種非常簡(jiǎn)便有效的方法固定化芳香化酶。本發(fā)明的方法是 通過環(huán)氧基功能化修飾的介孔娃球利用吸附法固定芳香化酶。
[0006] 本發(fā)明的固定化芳香化酶的制備方法，包括W下步驟：
[0007] (a)球形介孔娃球用稀鹽酸活化即得固體介質(zhì)A，其中鹽酸濃度為5%~10%。
[0008] (b)制備環(huán)氧基修飾的介孔娃球?yàn)楣腆w介質(zhì)B。
[0009] (C)芳香化酶用憐酸鐘緩沖液稀釋為液體介質(zhì)C，其中酶濃度為lOpmol/mL~ 40pmol/mL。
[0010] (d)將固體介質(zhì)B用憐酸鐘緩沖液洗涂S次后，與液體介質(zhì)C混合，低溫下旋轉(zhuǎn)震搖 SOminW上，離屯、除去上清液，沉淀經(jīng)低溫離屯、洗涂后即得固定化酶。
[0011] 所述步驟(d)中，固體介質(zhì)B的質(zhì)量:液體介質(zhì)C的體積優(yōu)選為lmg:50化，更優(yōu)選為 Img:IOOuL。
[0012] 所述液體介質(zhì)C為水溶液，緩沖液離子強(qiáng)度為50mmol/L~150mmol/L。
[0013] 本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述芳香化酶優(yōu)選來源于桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
[0014] 本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述介孔娃球的粒徑為2~40WH，優(yōu)選為2~lOwn，更優(yōu)選為 2~如m。孔徑為50A~500A，更優(yōu)選為IOOA~300A。
[0015] 本發(fā)明的技術(shù)方案中，步驟(d)中所述的固體介質(zhì)B與液體介質(zhì)C的混合方式為滿 旋或者旋轉(zhuǎn)震搖，若為旋轉(zhuǎn)震搖，轉(zhuǎn)速為10巧m~30巧m。
[0016] 本發(fā)明的制備方法中，將芳香化酶W分子間作用力的形式固定于載體上，運(yùn)種分 子間作用力主要為范德華力、親水或疏水作用力W及靜電力。
[0017] 該發(fā)明中，所述液體介質(zhì)的抑為6~8。
[0018] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，所述環(huán)氧功能化娃球在使用之前需要進(jìn)行預(yù)處理， 預(yù)處理方法為用憐酸鹽緩沖液洗涂，所使用緩沖液的抑在6~8之間，離子強(qiáng)度為50mmol/L ~200mmol/L之間，具體洗涂方法不予特別限定。
[0019] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用上述方法制備的固定化芳香化酶，通過該方法所制 備的固定化酶在連續(xù)催化時(shí)顯示出了比游離酶更好的穩(wěn)定性，可W重復(fù)利用，實(shí)驗(yàn)證明該 固定化酶至少可重復(fù)使用5次。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：
[0021] ①本發(fā)明的固定化酶的制備方法為吸附法，簡(jiǎn)單有效，采用的載體為環(huán)氧基功能 化修飾的介孔娃球，廉價(jià)易得，為首次將芳香化酶固定于多孔硅膠載體上，具有很高的潛在 研究?jī)r(jià)值。
[0022] ②本發(fā)明所制備的固定化酶連續(xù)催化時(shí)穩(wěn)定性較好，游離的芳香化酶在40min后 催化速率有所降低，而固定化酶在SOmin后催化速率才有所降低。并且固定化酶可W重復(fù)利 用，為潛在芳香化酶抑制劑的篩選可提供很好的平臺(tái)。
[0023] 附圖l為環(huán)氧基功能化介孔娃球化xopy-Si02)與固定化酶（Immobilizeden巧me) 的紅外光譜圖對(duì)比。
[0024] 附圖2為固定化酶催化反應(yīng)完成后上清液中產(chǎn)物(①雌酬)與底物(②雄締二酬)分 離的高效液相色譜圖。
[0025] 附圖3環(huán)氧基功能化介孔娃球(A)與固定化酶(B)的掃描電鏡(SEM)對(duì)比圖。
[0026] 附圖4為不同濃度的酶溶液參與固定化后固定化酶的酶活力上升曲線。
[0027] 附圖5為游離酶隨反應(yīng)時(shí)間增加時(shí)產(chǎn)物雌酬的生成效率。
[0028] 附圖6為固定化酶隨反應(yīng)時(shí)間增加時(shí)產(chǎn)物雌酬的生成效率。
【具體實(shí)施方式】：
[0029] 下述非限制性實(shí)施例可W使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不W 任何方式限制本發(fā)明。
[0030] 實(shí)施例1
[0031 ] (1)稱取4g介孔娃球（sepax細(xì)IP-si 1 ica;扣m，300A )，加入IOOmL 10 %鹽酸，9〇°C 攬拌下回流8小時(shí)，隨后用大量去離子水清洗至中性，15(TC真空干燥。得到活化的介孔娃球 載體。
[0032] (2)稱取500mg步驟（1)所得到的活化介孔娃球分散于20mL無(wú)水甲苯中，逐滴加入 25化L 丫-縮水甘油酸氧丙基S甲氧基硅烷化H-560)，于90°C攬拌回流12h，隨后依次用甲 苯和丙酬洗涂=次，60°C真空干燥，保存于4°C，得到環(huán)氧基修飾的功能化介孔娃球巧xopy-Si〇2)。
[0033] (3) lOOmmol/L憐酸鐘緩沖液(pH7.4)的配制：稱取4.56g K2HPO4溶于200mL去離子 水為A液，稱取2.72g K出K)4溶于200mL去離子水為B液，A與BW (A: B)80.2:19.8混合即得。
[0034] (4)雄締二酬儲(chǔ)備液與工作液的配制:稱取2mg雄締二酬與ImL容量瓶中，用DMSO稀 釋至刻度，-20°C保存，即為2mg/血的儲(chǔ)備液;取扣L儲(chǔ)備液與95化憐酸鐘緩沖液（IOOmmol/ 1，口^.4)混合，即為10化邑/1111的雄締二酬工作液。
[0035] (5)固定化所用酶溶液的配制：將來自桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的芳香化酶 (corning,美國(guó)）用憐酸鐘緩沖鹽（100111111〇1凡，口^.4)分別稀釋至10口1]1〇1/111]^，20口111〇1/1111^， SOpmo1/mL，40pmo1/mL。
[0036] (S)NADPH工作液的配制：稱取8.33mg的NADPH(BI0SHARP公司）加入ImL容量瓶中， 用憐酸鐘緩沖液稀釋至刻度，混勻，保存于4°C冰箱中即得。
[0037] (7)稱取5mg步驟(2)所得到的環(huán)氧基修飾的功能化介孔娃球用0.5mL憐酸鐘緩沖 液(lOOmmol/L，抑7.4)洗涂S次后，加入步驟(4)所制得的酶溶液0.5血，4°C旋轉(zhuǎn)震搖30min W上，低溫高速離屯、后，沉淀用0.5mL憐酸鐘緩沖液(100mmol/L，pH7.4)洗涂3次，測(cè)酶活力。
[0038] (8)固定化酶的活力測(cè)定方法為:在5mg步驟(6)所制得固定化酶中加入17扣L憐酸 鐘緩沖液（lOOmmol/L，pH7.4)，扣L雄締二酬工作液，滿旋混合均勻后，37°C恒溫震蕩5min 后，加入20化NADPH工作液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，反應(yīng)20min，隨后4°C高速離屯、，上清液取50化進(jìn)入高效 液相色譜分析。沉淀用〇.5mL憐酸鐘緩沖液(100臟〇1八，9^.4)洗