一種用于叉頭轉(zhuǎn)錄因子o1基因突變檢測(cè)的試劑及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)及臨床分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種用于叉頭轉(zhuǎn)錄 因子Ol(FOXOl)基因突變檢測(cè)的試劑、PCR檢測(cè)方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Wnt信號(hào)通路廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中，是一類在物種進(jìn)化過(guò)程中高 度保守的信號(hào)通路。Wnt信號(hào)在動(dòng)物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其它生理過(guò)程 中，具有至關(guān)重要的作用。如果運(yùn)條信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白發(fā)生突變或者異常表達(dá)，導(dǎo)致信 號(hào)異?；罨?，就可能誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生。Wnt信號(hào)通路包括經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路與非經(jīng)典的Wnt 信號(hào)通路，在經(jīng)典通路即Wnt-0-catenin信號(hào)通路中，Wnt因子通過(guò)激活細(xì)胞膜上的 F;rizzle/LRP5/6協(xié)同受體后抑制細(xì)胞內(nèi)游離0-catenin蛋白的憐酸化和降解，細(xì)胞質(zhì)中的 0-catenin蛋白水平升高后將發(fā)生0-catenin蛋白的核移位，導(dǎo)致細(xì)胞核中0-catenin蛋白 升高，胞核中e-catenin蛋白能夠聯(lián)合巧go2、Bd-9W及化xMl蛋白共同與TCF/LEF-1轉(zhuǎn)錄因 子家族形成復(fù)合體并激活Wnt信號(hào)通路下游祀基因的轉(zhuǎn)錄激活。
[0003] FOXO1蛋白是Wnt信號(hào)通路中0-caten in下游重要成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激 狀態(tài)下，F(xiàn)OXOs能夠競(jìng)爭(zhēng)性地與0-catenin結(jié)合，減少后者與TCF的結(jié)合，從而影響Wnt信號(hào)通 路的傳導(dǎo)。目前越來(lái)越多的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在很多腫瘤中FOXOl蛋白均呈現(xiàn)不同程度的突 變。
[0004] 目前研究核屯、信號(hào)通路的核屯、分子調(diào)控機(jī)制，W及某些重要成員在細(xì)胞中的表達(dá) 水平，已經(jīng)成為治療腫瘤的一種關(guān)鍵手段。近年來(lái)Wnt信號(hào)通路在癌癥中的研究，W及FOXOl 蛋白作為Wnt信號(hào)通路重要成員其突變水平的研究，已經(jīng)成為研究開(kāi)發(fā)腫瘤藥物急需解決 的重要問(wèn)題，尤其是在FOXOl轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域中發(fā)生的突變，對(duì)FOXOl蛋白發(fā)揮功能啟動(dòng)非 常重要的作用，例如在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中檢測(cè)出R609CS突變，前列腺癌細(xì)胞中檢測(cè)出D624N 突變等。
[0005] 膚核酸(peptide nucleic acids，PNA)是一類W多膚骨架取代糖憐酸主鏈的DNA 類似物。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎(chǔ)上，通過(guò)計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)構(gòu)建并最終人工合成的 第S代反義試劑，是一種全新的DNA類似物，即W中性的膚鏈酷胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代 了DNA中的戊糖憐酸二醋鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可W通過(guò)Watson-化ick堿基配對(duì)的 形式識(shí)別并結(jié)合DNA或RNA序列，形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。由于PNA不帶負(fù)電荷，與DNA和RNA 之間不存在靜電斥力，因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA間的 雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠(yuǎn) 優(yōu)于DNA/DNA或DNA/RNA，表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異序列識(shí)別能力、不被核酸酶 和蛋白酶水解。
[0006] 本方法采用特異序列的PNA寡聚物作為探針。由于PNA是一種人工合成的核酸的類 似物，并且為非手性、不帶電荷的分子，避免了寡核巧酸與其祀基因結(jié)合時(shí)因電荷相互排斥 所導(dǎo)致的雜交不穩(wěn)定性，結(jié)合不易受雜交液離子強(qiáng)度的影響，從而顯示出極強(qiáng)的雜交優(yōu)勢(shì)， 大大提高了檢測(cè)靈敏度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中如何確定Wnt信號(hào)通路中核屯、的信號(hào)分子FOXOl 基因突變情況，W及如何解釋核屯、分子FOXOl在腫瘤細(xì)胞中的突變水平變化的困難，提供了 一種檢巧UWnt信號(hào)通路中FOXOl基因突變檢測(cè)試劑、PCR檢測(cè)方法及應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種用于叉頭轉(zhuǎn)錄因子01F0X01基因突變檢測(cè)的試劑，包括 用于阻斷野生型FOXOl基因擴(kuò)增的野生型PNA序列、用于特異性擴(kuò)增R609C、D624N突變型 FOXOl基因序列的一組引物對(duì)及突變型PNA巧光探針：
[0009] 所述檢測(cè)FOXOl基因 R609C突變正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1;
[0010] 所述檢測(cè)FOXOl基因 R609C突變反向引物如序列表中沈Q ID NO.2;
[00川所述檢測(cè)FOXOl基因 D624N突變正向引物如序列表中沈Q ID NO.3;
[001^ 所述檢測(cè)FOXOl基因 D624N突變反向引物如序列表中沈Q ID NO.4;
[0013] 所述檢測(cè)FOXOl基因 R609C突變PNA巧光探針如序列表中SEQ ID NO.5;
[0014] 所述檢測(cè)FOXOl基因 D624N突變PNA巧光探針如序列表中SEQ ID NO.6;
[0015] 所述特異性結(jié)合包含F(xiàn)OXOl基因609密碼子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.7；
[0016] 所述特異性結(jié)合包含F(xiàn)OXOl基因624密碼子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.8；
[0017] 所述PNA巧光探針的5'端的巧光報(bào)告基團(tuán)為:FAM、皿乂^61\1〇6、￥1(：、1?0乂、切3或 〔75,3'端的澤滅基團(tuán)為：14134、6。11986、8冊(cè)1、8冊(cè)2、8冊(cè)3或048(：化。
[0018] 本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑還包括PCR反應(yīng)液、609密碼子和624密碼子突變型參考品、 609密碼子和624密碼子野生型參考品，其中PCR反應(yīng)液包括:DEPC水、具有5 ' 一3 '外切活性 的DNA聚合酶、dNTPs、10 X PCR Buffer、RNASIN、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、01 igo (肌)和含Mg離子的溶 液。
[0019] 所述609密碼子突變型參考品為含SEQ NO.9的重組質(zhì)粒DNA;
[0020] 所述609密碼子野生型參考品為含SEQ NO. 10的重組質(zhì)粒DNA;
[0021] 所述624密碼子突變型參考品為含SEQ NO. 11的重組質(zhì)粒DNA;
[0022] 所述624密碼子野生型參考品為含SEQ NO. 12的重組質(zhì)粒DNA;
[0023] 所述具有5 ' 一3 '外切活性的DNA聚合酶為化q酶；
[0024] 所述PCR反應(yīng)液各組分在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度為：Taq酶0.0 IU/化~ 0.0抓AiUdNTPs 0.2~0.6mM，10XPCR Buffer IX ,RNASIMOU/化~60UAiL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄 酶20011/化~3201]/化，]\%(：12 1.5~5.01111，溶劑為肥?(：水。
[0025] 具體地，所述正向引物的終濃度為0.05~0.9測(cè)，所述反向引物的終濃度為0.05~ 0.9咖，所述oligo(dT)終濃度為0.05~0.9測(cè)，所述互補(bǔ)PNA序列終濃度為0.05~0.9咖，所 述巧光探針的終濃度為0.05~0.9iiM。
[0026] 本發(fā)明所述的試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)?42°C逆轉(zhuǎn)錄20min;94°C 預(yù)變性，2min; 95 °C變性，30s，58 °C，45s川欠集巧光），進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
[0027] 本發(fā)明的原理是通過(guò)構(gòu)建與FOXOl基因野生型互補(bǔ)的一段膚核酸PNA序列，當(dāng)膚核 酸PM序列與FOXOl基因互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，任一突變均可導(dǎo)致PNA/DNA產(chǎn)生錯(cuò)配，從而使得溶解溫 度發(fā)生改變。進(jìn)而根據(jù)FOXOl基因突變型設(shè)計(jì)特異性的膚核酸PNA探針W及引物對(duì)FOXOl突 變型基因進(jìn)行巧光定量PCR擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)一輪的PCR擴(kuò)增后，即可將FOXOl基因突變型與野生型 進(jìn)行區(qū)分開(kāi)來(lái)。
[0028] 進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了所述的試劑在制備檢測(cè)癌細(xì)胞的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用， 所述癌細(xì)胞為宮內(nèi)膜癌、前列腺癌。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：FOXOl基因是Wnt信號(hào)通路中0-catenin蛋白上游發(fā)揮著重要功能的基因，本發(fā)明提供了直接檢測(cè)Wnt信號(hào)通路中FOXOl基 因突變檢測(cè)的試劑，借助于所述檢測(cè)試劑能夠通過(guò)實(shí)時(shí)巧光定量PCR法在轉(zhuǎn)錄水平快速檢 測(cè)出FOXOl基因的突變，而與普通實(shí)時(shí)巧光定量PCR不同的是，本發(fā)明設(shè)計(jì)野生型PNA序列， 可有效抑制野生型基因組擴(kuò)增，只富集突變型基因擴(kuò)增，大大提高了檢測(cè)特異性，我們使用 的突變型PNA巧光探針更加靈敏，本發(fā)明為抗癌藥物的篩選，新祀向藥物的機(jī)制研究都提供 了非常有力的工具。
[0030] 同時(shí)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)體系可W在任何一臺(tái)實(shí)時(shí)巧光定量PCR儀器上進(jìn)行，上述引物 置于八聯(lián)管中，進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，結(jié)果重復(fù)性，敏感性 好，是研究腫瘤相關(guān)藥物作用機(jī)理及基礎(chǔ)科學(xué)研究的一種重要手段。
【附圖說(shuō)明】
[0031 ]圖1是本發(fā)明實(shí)施例中所述膚核酸質(zhì)譜圖；
[0032] 圖2是樣品、R609C突變型和野生型參考品PCR擴(kuò)增圖；
[0033] 圖3是樣品、D624N突變型和野生型參考品PCR擴(kuò)增圖；
【具體實(shí)施方式】
[0034] 通過(guò)W下詳細(xì)說(shuō)明結(jié)合附圖可W進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施 例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說(shuō)明，而不W任何方式限制本發(fā)明掲示的其余內(nèi)容。
[0035] 本發(fā)明通過(guò)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞進(jìn)行舉例說(shuō)明，但是本發(fā)明不局限于子宮內(nèi)膜癌細(xì) 胞，本發(fā)明所述檢測(cè)試劑還可W應(yīng)用于前列腺癌。
[0036] 實(shí)施例中的有關(guān)DNA和RNA基本操作均參考《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室操作指南》(金冬雁 等譯，科學(xué)出版社，北京（1998))和《精編分子生物學(xué)指南》（顏?zhàn)幼g，科學(xué)出版社，北京 (1998))。
[0037] 本發(fā)明中IsWkawa(人子宮內(nèi)膜癌Ish化awa細(xì)胞系)購(gòu)自美國(guó)ATCC，培養(yǎng)細(xì)胞所使 用的RPMI-1640培養(yǎng)基及10%胎牛血清均購(gòu)自英俊公司，其他試劑主要購(gòu)自寶生物工程(大 連)有限公司。
[0038] 【實(shí)施例1】引物探針設(shè)計(jì)
[0039] 根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中屯、（National Center for Biotechnology Information，NCBI) (http : //www. ncbi . nlm. nih . gov)報(bào)道的FOXOl mRNA序列（NCBI Ref erence Sequence : NM_002015.3)，使用Appl ied Biosystems公司開(kāi)發(fā)的Primer Express Software for Real-Time PCR軟件設(shè)計(jì)特異的FOXOl引物與探針。
[0040] FOXOl R609C：
[0041 ] FOXOl-F: 5' -CCTTCTCCACCAGGAGAAGCTC-3';(沈Q NO. I)
[0042] FOXOI-R: 5' -CTTGACACTGTGTGGGAAGCTT-3';(沈Q NO. 2)
[0043] 突變型尸0乂01。臟）斗：5,施-167^41764616(：7^64(：-8冊(cè)3'；（沈9^.5)
[0044] 野生型F0X01-PNA: 5 ' -TGTTCATTGAGCGCTTAG-3 ' ；（SEQ NO. 7)
[0045] 突變型祀序列：
[0046]
[0化引 W上:F:fo;rward，正向;FOXOl-F表示用于檢測(cè)核酸的正向引物。
[0化9] R:reverse，反向;FOXOl-R表示用于檢測(cè)核酸的反向引物。
[0060] P:probe，巧光探針;FOXOl-P表示用于檢測(cè)核酸的巧光探針，該巧光探針為化qMan 巧光探針。
[0061 ]在本發(fā)明實(shí)施例中，修飾巧光探針的5 '端的巧光報(bào)告基團(tuán)可W為:FAM，皿X，TET， 106，￥1(：，1?0乂，切3或切5;修飾巧光探針的3'端的澤滅基團(tuán)可^為^411?4,6。11936,8朋1， B冊(cè)2，BHQ3或DABCTL，該巧光報(bào)告基團(tuán)與澤滅基團(tuán)不影響巧光定量PCR的擴(kuò)增，只需根據(jù)探 針的