快速鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點的分子標記引物及應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于甘蔗分子生物學及甘蔗抗性鑒定技術(shù)領(lǐng)域。更具體涉及一個與甘蔗抗褐銹病基因位點緊密連鎖的分子標記鑒定方法，同時還涉及該分子標記在甘蔗抗褐銹病育種中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]甘蔗是世界上最重要的糖料作物和重要的低碳經(jīng)濟作物，蔗糖長期占世界食糖總產(chǎn)72%以上，其光合效率為C4作物之首，具有高光效特性、生長巨型性、可多年宿根栽培和大量固定CO2等特性，在適宜條件下畝產(chǎn)糖可高達I噸以上，也是迄今生物量最高的栽培作物。我國為世界第三產(chǎn)糖國和第二食糖消費國，蔗糖占我國食糖總產(chǎn)92%以上，甘蔗對保證我國食糖安全和發(fā)展低碳經(jīng)濟有不可替代的作用。根據(jù)ISSCT統(tǒng)計，甘蔗品種改良的科技貢獻率高達60%。但是，隨著甘蔗褐銹病的爆發(fā)和流行，致使一些豐產(chǎn)高糖當家品種如Co475、T34362和CP78-1247被淘汰，極大地影響了蔗糖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。
[0003]由黑頂柄銹菌(Puccinamelanocephala H.Sydow & P.Sydow)引起的甘鹿褐銹病是一種重要的世界性甘蔗病害，嚴重危害甘蔗生長，對蔗農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟損失。該病自1890年在爪哇首次被發(fā)現(xiàn)以來，隨后迅速擴散到世界上多數(shù)植蔗國家和地區(qū)，在古巴、牙買加、澳大利亞、美國、墨西哥、印度、泰國和毛里求斯等植蔗國家和地區(qū)普遍發(fā)生，并多次暴發(fā)流行。我國臺灣1977年首次發(fā)生甘蔗銹病，1982年首次在中國大陸云南甘蔗種植區(qū)發(fā)現(xiàn)該病害，之后在福建、廣東、四川、江西和廣西等蔗區(qū)先后報道。目前，該病在國內(nèi)蔗區(qū)普遍發(fā)生和蔓延危害，造成甘蔗種質(zhì)退化、產(chǎn)量降低。發(fā)病田塊一般減產(chǎn)15%?30%，嚴重地塊減產(chǎn)幅度可達40%以上，蔗糖含量降低10%?36%。尤其近年，我國蔗區(qū)主栽的一批豐產(chǎn)高糖品種如“桂糖15”、“桂糖17”、“桂引9號”和主推品種“粵糖60號”和“德蔗03-83”等也因高度感染銹病而面臨淘汰。
[0004]甘蔗銹病的流行與品種抗病性密切相關(guān)，大面積種植感病品種是病害流行的重要原因，選育和種植抗病品種是防治該病最經(jīng)濟有效的措施。而抗病種質(zhì)資源的發(fā)掘利用是抗病育種的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。目前，我國對甘蔗銹病抗病資源的篩選鑒定和評價還停留在人工接種表型觀察選擇，尚未開展抗銹病基因標記選擇研究。傳統(tǒng)的人工接種表型選擇抗病性的方法耗時、低效，鑒定結(jié)果易受病原和環(huán)境因素影響，難以滿足育種家對抗病育種要求。因此，為了保證國家的甘蔗產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的進行，提高我國甘蔗生產(chǎn)技術(shù)水平，迫切需要建立一種簡便、快速、準確、靈敏的鑒定甘蔗抗褐銹病方法，是甘蔗抗褐銹病分子育種最關(guān)鍵的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種快速鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點的分子標記引物及應用，鑒定或輔助鑒定甘蔗抗褐銹病的方法及其在甘蔗抗褐銹病育種中的應用。
[0006]本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定甘蔗抗褐銹病的方法，包括如下步驟:分別以待鑒定甘蔗和P0J2878的基因組DNA為模板，用由引物1、引物2、引物3、引物4的四條單鏈DNA組成的PCR引物對進行PCR擴增，將擴增的PCR產(chǎn)物利用限制性核酸內(nèi)切酶HaeIII進行酶切，通過電泳檢測擴增產(chǎn)物，按照如下方法確定待鑒定甘蔗對褐銹病的抗性:
如果待鑒定甘蔗的PCR擴增產(chǎn)物電泳條帶有與P0J2878帶型相同的條帶，且大小為389 bp和606 bp則待鑒定甘鹿為抗褐銹病甘鹿或候選為抗褐銹病甘鹿，如果待鑒定甘鹿的PCR擴增產(chǎn)物電泳條帶沒有與POJ2878帶型相同的條帶，則待鑒定甘蔗為非抗褐銹病甘蔗為或為候選非抗褐銹病甘蔗;如果待鑒定甘蔗的PCR擴增產(chǎn)物電泳條帶只有兩條中任意一條電泳條帶與POJ2878帶型相同的條帶，則待鑒定甘蔗為抗褐銹病基因位點交換株，應為圖位克隆抗褐銹病基因重要實驗材料。
[0007]具體為:
包括如下步驟:分別以待鑒定甘蔗和“P0J2878”的基因組DNA為模板，PCR擴增體系:2XPremix Ex TaqMix PCR Buffer 12.5yL，lOymol/L引物1、引物2、引物3和引物4各0.5yL，25 ng/yL模板DNA 2yL，加滅菌雙蒸水使總體積為25yL;擴增程序如下:94 °C 5 min ；940C 30 S，56 °C 30 S，72 °C 40 S，34個循環(huán);72 °C 7 min。
[0008]將擴增的PCR產(chǎn)物利用限制性核酸內(nèi)切酶HaeIII進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，按照如下方法確定待鑒定甘蔗對褐銹病的抗性:如果待鑒定甘蔗的酶切產(chǎn)物電泳條帶有與P0J2878帶型相同的條帶，則待鑒定甘蔗為抗褐銹病甘蔗，如果待鑒定甘蔗的酶切產(chǎn)物電泳條帶沒有與P0J2878帶型相同的條帶，則待鑒定甘蔗為非抗褐銹病甘蔗。酶切產(chǎn)物經(jīng)過膠回收及測序，該抗性片段大小為389 bp，其余條帶為非特異性擴增。
[0009]所述引物I為:F-1033-5’- AGGTTTGTCTGGTGGGAACT -3’；
所述引物2為:R-1638-5’- CTTACCCTGTGTGCAATGGG -3’；
所述引物3為:29-5 ’ -TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT-3 ’ ；
所述引物4為:417-5 ’ - CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC-3 ’。
[0010]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
本發(fā)明的引物對是與Brul基因位點緊密連鎖的標記，分別位于Brul基因兩側(cè)(0.28 cm和0.14 cm)，由于甘蔗基因組序列龐大，染色體交換頻率低等原因，目前無法圖位克隆抗病基因。本發(fā)明所建立的分子標記方法是基于PCR和酶切技術(shù)產(chǎn)生的共顯性標記，因而可靠且使用方便，與以往的抗褐銹病標記相比，具有與目標基因Brul緊密連鎖、準確性高、成本低廉、檢測效率尚等優(yōu)點。
[0011]1.緊密連鎖:實驗證明，利用本方法對甘蔗育種材料輔助鑒定的結(jié)果與抗性鑒定結(jié)果完全一致，表明該方法用于甘蔗抗褐銹病育種的分子標記輔助選擇。
[0012]2.準確性高:與以往的抗褐銹病標記相比，該檢測方法克服假陽性高、穩(wěn)定性差等問題。
[0013]3.成本低廉:本研究使用限制性內(nèi)切酶HaeIII屬于廉價的四堿基內(nèi)切酶，而其他方法使用是昂貴的六堿基核酸內(nèi)切酶RsaI。
[0014]4.檢測效率高:與以往的抗褐銹病標記相比，本研究將2對引物分別進行PCR擴增和一個酶切反應縮減為一個雙重PCR和一個酶切反應;僅僅只用I次瓊脂糖凝膠電泳分析，克服了以往檢測需要2次電泳的缺點，極大地提高檢測效率。
[0015]本發(fā)明通過對甘蔗抗褐銹病基因的定位，開發(fā)與其緊密連鎖的分子標記方法，該方法可用于抗病基因的圖位克隆和分子標記輔助選擇，通過檢測抗褐銹病基因位點來預測甘蔗對褐銹病的抗性，可以在甘蔗的實生苗階段進行淘汰選擇，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高選擇效率，進而加速甘蔗抗褐銹病育種進程。
【附圖說明】
[0016]圖1PCR擴增后直接進行電泳分析結(jié)果。M: Marker, 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.分別代表甘蔗樣品編號為甘蔗品種P0J2878，云蔗91-510，云蔗03-194，柳城05-136，粵甘35號，崖城05-179和割手密福建89-1-1，云南合慶割手密，云南83-215，貴州78-2-04。
[0017]圖2PCR產(chǎn)物利用RsaI酶切后進行電泳分析結(jié)果。M: Marker, 1,2,3,4,5,6,7,8,9，10.分別代表甘鹿樣品編號為甘鹿品種P0J2878，云鹿91-510，云鹿03-194，柳城05-136，粵甘35號，崖城05-179和割手密福建89-1-1，云南合慶割手密，云南83-215，貴州78-2-04。
[0018]圖3PCR產(chǎn)物利用HaeIII酶切后進行電泳分析結(jié)果。M: Marker, 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.分別代表甘蔗樣品編號為甘蔗品種P0J2878，云蔗91-510，云蔗03-194，柳城05-136，粵甘35號，崖城05-179和割手密福建89-1-1，云南合慶割手密，云南83-215，貴州78-2-04ο
[0019]圖4 24個不同甘蔗品種經(jīng)過PCR擴增后電泳結(jié)果。Μ: Marker,其中1_24分別代表甘蔗樣品編號為閩糖98-730，桂糖97-40，湛蔗37，湛蔗39，福農(nóng)04-0127，粵糖97-20，桂糖98-295，湛蔗34，湛蔗，31，閩糖96-1409，H0CP93-750，CP88-1762，贛蔗75-65，CP94-1100，閩糖96-1027，福農(nóng)98-1103，L75-20，川糖89-103，CP94_1340，R0C28，川蔗57-416，云蔗91-510，F(xiàn)R93-435，CP94-1528。
[0020]圖5 24個不同甘蔗品種經(jīng)過PCR擴增后利用RsaI酶切的電泳結(jié)果。M: Marker,其中1-24分別代表甘蔗樣品編號為閩糖98-730，桂糖97-40，湛蔗37，湛蔗39，福農(nóng)04-0127，粵糖97-20，桂糖98-295，湛蔗34，湛蔗，31，閩糖96-1409，H0CP93-750，CP88-1762，贛蔗75-65，CP94-1100，閩糖96-1027，福農(nóng)98-1103，L75-20，川糖89-103，CP94_1340，R0C28，川蔗57