甲烷的微生物轉(zhuǎn)化的制作方法
【專利說(shuō)明】甲燒的微生物轉(zhuǎn)化
[0001 ] 政府權(quán)益
[0002] 美國(guó)政府依據(jù)在美國(guó)能源部與可持續(xù)能源聯(lián)盟有限責(zé)任公司（國(guó)家再生能源實(shí)驗(yàn) 室的管理者和操縱者)之間的合同號(hào)DE-AC36-08G028308對(duì)本發(fā)明具有權(quán)益。
[0003] 本發(fā)明是在政府扶持下依據(jù)美國(guó)能源部援助協(xié)議號(hào)DE-AR0000350、C抑A號(hào)81，135 得W完成。政府對(duì)本發(fā)明有某些權(quán)益。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明設(shè)及一種從含甲燒的原料產(chǎn)生至少一種產(chǎn)物的方法。所述方法包括向包含 至少一種嗜甲燒微生物于液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器中提供包含014和化的 氣態(tài)底物，W產(chǎn)生至少一種產(chǎn)物，如脂質(zhì)和氨基酸。
【背景技術(shù)】
[0005] 全球能源危機(jī)已使人們對(duì)制造燃料的替代方法的興趣增大。運(yùn)輸用生物燃料為汽 油的有吸引力的替代物并且作為低濃度共混物快速滲透著燃料市場(chǎng)。源于生物質(zhì)的生物燃 料制造已經(jīng)出現(xiàn)，作為增加替代能源的產(chǎn)量并且減少溫室氣體排放的主要方法。從生物質(zhì) 制造生物燃料可實(shí)現(xiàn)能源獨(dú)立性，并且已顯示會(huì)增強(qiáng)農(nóng)村地區(qū)的發(fā)展與可持續(xù)的經(jīng)濟(jì)發(fā) 展。
[0006] 傳統(tǒng)的液體生物燃料利用碳水化合物原料，如淀粉、薦糖、玉米、油菜巧、大豆、棟 桐和植物油。第一代原料受到許多明顯的挑戰(zhàn)。運(yùn)些碳水化合物原料的成本受其作為人的 食物或動(dòng)物飼料的價(jià)值的影響，而栽培淀粉或薦糖生產(chǎn)作物來(lái)制造乙醇并非在所有地域都 在經(jīng)濟(jì)上可持續(xù)。持續(xù)使用運(yùn)些原料作為生物燃料的來(lái)源將不可避免地對(duì)可耕地和水資源 造成大的壓力。因此，感興趣的是開發(fā)將較低成本和/或較富足的碳資源轉(zhuǎn)化成燃料的技 術(shù)。
[0007] 第二代生物燃料為從纖維素和海藻制得的那些。由于快速的生長(zhǎng)速率和海藻消耗 二氧化碳并產(chǎn)生氧的能力，因此選擇海藻來(lái)產(chǎn)生脂質(zhì)。
[000引還已經(jīng)證明可W通過(guò)含一氧化碳的合成氣的微生物轉(zhuǎn)化來(lái)產(chǎn)生生物燃料。產(chǎn)乙酸 細(xì)菌，如來(lái)自醋桿菌屬、穆爾氏菌屬、梭菌屬、瘤胃球菌屬、醋桿菌屬、真桿菌屬、酪酸桿菌 屬、產(chǎn)醋桿菌屬、甲燒八疊球菌屬、甲燒八疊球菌屬和脫硫腸狀菌屬的那些可W用于通過(guò)一 氧化碳和/或氨和二氧化碳的厭氧發(fā)酵來(lái)產(chǎn)生乙酸、乙酸醋和其它產(chǎn)物如乙醇。運(yùn)些細(xì)菌通 過(guò)Wood-Uungdahl路徑(其中乙酷基輔酶A合成酶為關(guān)鍵酶)將合成氣轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。例如，從 合成氣產(chǎn)生乙酸醋和乙醇的梭狀桿菌的各種菌株描述于WO 00/68407、EP 117309、美國(guó)專 利5，173,429、5,593,886和6,368,819、胖0 98/00558和胖0 02/08438中。
[0009] -個(gè)可見(jiàn)活力增強(qiáng)的領(lǐng)域?yàn)闃?gòu)成生物燃料制造所需的原料的脂質(zhì)的微生物合成。 大量研究證明了通過(guò)對(duì)不同底物如工業(yè)甘油、乙酸、污水污泥、去蛋白乳清（whey permeate)、薦糖蜜和稻桿水解產(chǎn)物使用油脂酵母來(lái)積累脂質(zhì)的能力。而且，運(yùn)些第二代生 物燃料技術(shù)已經(jīng)遇到由高制造成本W(wǎng)及與原料運(yùn)輸和存放相關(guān)的成本所造成的問(wèn)題。
[0010] 甲燒在美國(guó)是由人類活動(dòng)所排出的第二普遍的溫室氣體。雖然甲燒的壽命比二氧 化碳短得多，但是其在俘獲福射方面比二氧化碳更有效，因此在20年的時(shí)期內(nèi)，甲燒對(duì)氣候 變化的對(duì)比影響要比二氧化碳大70倍W上。天然氣和石油系統(tǒng)是甲燒的最大工業(yè)來(lái)源，接 著是由農(nóng)業(yè)和填埋廢棄物產(chǎn)生的那些。利用甲燒/減少排放的現(xiàn)行策略已經(jīng)集中于使用天 然氣中的甲燒，W及從各種工業(yè)過(guò)程所回收的甲燒，作為可行的燃料來(lái)源。
[0011] 已知各種嗜甲燒細(xì)菌遍布自然界，其在好氧條件下能夠組合氧與甲燒W通過(guò)酶： 甲燒單加氧酶和甲醇脫氨酶來(lái)形成甲醒。甲醒然后通過(guò)RuMP路徑（I型嗜甲燒菌）或絲氨酸 路徑QI型嗜甲燒菌）引入有機(jī)化合物中。已經(jīng)定義了十一種嗜甲燒菌屬，也即甲基球菌屬、 甲基單胞菌屬、甲基微菌屬、甲基桿菌屬、甲基暖菌屬、甲基卵菌屬(methylovulum)、甲基海 洋分枝桿菌屬(methyIomarinum)、甲基海洋生菌屬(methyIomarinov皿）、甲基熱菌屬、甲基 抱囊菌屬和甲基彎曲菌屬。
[0012] 目前，嗜甲燒細(xì)菌的商業(yè)應(yīng)用是受限的。SemrauJ.0.(2011)討論了嗜甲燒菌對(duì)于 污染地點(diǎn)的生物修復(fù)，例如氯化控類如S氯乙締的降解的用途。WO 09/154683描述了嗜甲 燒菌在燃料電池中的用途，其中甲燒被燃料電池內(nèi)的微生物氧化W產(chǎn)生電子。美國(guó)公布 2005/0221465和美國(guó)專利7，799，550描述了水解的、均化的嗜甲燒細(xì)菌生物質(zhì)作為發(fā)酵用 營(yíng)養(yǎng)素原料的用途。EP1641475描述了來(lái)自嗜甲燒細(xì)菌的脂質(zhì)用于減少膽固醇的用途。美國(guó) 公布2003/0138878和EP 1320579B1描述了嗜甲燒細(xì)菌生物質(zhì)作為蛋白質(zhì)來(lái)源的用途。美國(guó) 公布2006/0057726描述了 一組通過(guò)同源重組對(duì)Cl代謝細(xì)菌中的染色體突變進(jìn)行陽(yáng)性選擇 的基因工具。Kalyuzhnaya等（2011)的綜述描述了嗜甲燒細(xì)菌的生物技術(shù)方面并且概述了 將利用甲燒的微生物用于制造依克多因（ectoine)的前景。Shoda等（1975)的研究概述了對(duì) 于在分批培養(yǎng)物中培育利用甲燒的細(xì)菌最優(yōu)的氧氣和甲燒分壓。
[0013] 在本領(lǐng)域中仍需要從包含甲燒的氣態(tài)底物產(chǎn)生有價(jià)值的產(chǎn)物，如生物燃料。本發(fā) 明的目的在于提供從包含甲燒的氣態(tài)底物制造適用產(chǎn)物如脂質(zhì)和氨基酸的新方法，并且向 公眾提供減少對(duì)環(huán)境的甲燒排放的新方法，或者至少向公眾提供適用的選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明對(duì)本領(lǐng)域中的需求作出反應(yīng)。第一方面，提供一種通過(guò)對(duì)氣態(tài)底物進(jìn)行微 生物轉(zhuǎn)化來(lái)產(chǎn)生至少一種產(chǎn)物的方法，所述方法包括：
[0015] (a)向包含至少一種嗜甲燒微生物于液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器提 供包含CH4和化的氣態(tài)底物；W及
[0016] (b)將氣態(tài)底物在發(fā)酵條件下微生物轉(zhuǎn)化成至少一種在細(xì)胞生物質(zhì)中的選自脂 質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸和其混合物W及分泌的脂肪酸的產(chǎn)物。
[0017] 在第一方面的具體實(shí)施方案中，所述方法產(chǎn)生脂質(zhì)或氨基酸，或者其混合物。在具 體的實(shí)施方案中，脂質(zhì)可包括但不限于脂肪酸、糖脂、銷脂、醋脂、聚酬、固醇脂、蕾燒類、憐 脂和異戊締醇脂質(zhì)或其混合物。在具體的實(shí)施方案中，氨基酸可包括但不限于脯氨酸、5-氧 脯氨酸、丙氨酸、天口冬氨酸鹽、谷氨酷胺和谷氨酸鹽，或其混合物。
[0018] 在具體的實(shí)施方案中，由所述方法產(chǎn)生的脂質(zhì)可轉(zhuǎn)化成至少一種化學(xué)燃料或燃料 組分。例如，脂質(zhì)可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的手段轉(zhuǎn)化成選自可再生柴油、生物柴油燃料、柴油燃 料、柴油燃料組分、脂肪酸甲醋(FAME)和脂肪酸乙醋(FAEE)的化合物。
[0019] 第二方面，提供一種通過(guò)對(duì)氣態(tài)底物進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化來(lái)產(chǎn)生至少一種產(chǎn)物的方 法，所述方法包括：
[0020] (a)向含有液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和至少一種嗜甲燒微生物的培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器提供 包含CH4和化的氣態(tài)底物；
[0021] (b)微生物轉(zhuǎn)化氣態(tài)底物W產(chǎn)生至少一種在微生物的細(xì)胞生物質(zhì)中的產(chǎn)物；W及
[0022] (C)從微生物的細(xì)胞生物質(zhì)提取至少一種產(chǎn)物。
[0023] 在具體的實(shí)施方案中，將液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基連續(xù)地饋送到生物反應(yīng)器中。在具體的 實(shí)施方案中，使液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基飽和含有化，隨后饋送到生物反應(yīng)器中。在具體的實(shí)施方案 中，對(duì)液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基加壓并且使其飽和含有化，隨后饋送到生物反應(yīng)器中。
[0024] 在具體的實(shí)施方案中，未轉(zhuǎn)化的氣態(tài)底物和/或任何由微生物所產(chǎn)生的氣體的至 少一部分從氣體出口離開生物反應(yīng)器。在具體的實(shí)施方案中，排氣的至少一部分回收到生 物反應(yīng)器中W進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。在具體的實(shí)施方案中，將排氣的至少一部分用作燃料。
[0025] 在具體的實(shí)施方案中，將至少一種微生物的培養(yǎng)物懸浮于液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。在 具體的實(shí)施方案中，將液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基維持在約6至約11的pH值范圍內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，將液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基維持在約8至約9.5的pH值。在具體的實(shí)施方案中，將液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基 的溫度維持在約5°C與約6(TC之間。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基維持在約25°C 至約35°C的溫度下。
[0026] 在具體的實(shí)施方案中，一種或多種微生物為選自W下項(xiàng)的嗜甲燒細(xì)菌：甲基球菌 屬、甲基單胞菌屬、甲基微菌屬、甲基桿菌屬、甲基八疊球菌屬、甲基暖菌屬、甲基海洋分枝 桿菌屬、甲基海洋生菌屬、甲基熱菌屬、甲基卵菌屬、甲基抱囊菌屬和甲基彎曲菌屬。在具體 的實(shí)施方案中，嗜甲燒細(xì)菌選自芙膜甲基球菌、甲燒甲基單胞菌、甲基單胞菌屬、甲基彎菌、 海洋甲基細(xì)菌(MethyIobacter marinus )、藤黃甲基細(xì)菌(MethyIobacter Iuteus )、甲燒氧 化菌和嗜堿甲基微菌(Methylomicrobium buryatense)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，嗜甲燒細(xì)菌 為嗜堿甲基微菌。
[0027] 在具體的實(shí)施方案中，嗜甲燒細(xì)菌為天然存在的菌株。在替代性實(shí)施方案中，嗜甲 燒細(xì)菌為工程化菌株。在具體的實(shí)施方案中，嗜甲燒細(xì)菌為選擇的菌株。在具體的實(shí)施方案 中，選擇的嗜甲燒菌株為甲基微菌屬菌株5GB1。
[0028] 在具體的實(shí)施方案中，所述方法包括從至少一種微生物的細(xì)胞膜提取至少一種產(chǎn) 物的步驟。在具體的實(shí)施方案中，提取步驟包括濕法提取程序。在具體的實(shí)施方案中，提取 步驟在獨(dú)立反應(yīng)器中發(fā)生，直到轉(zhuǎn)化步驟。在具體的實(shí)施方案中，包含至少一種產(chǎn)物和/或 至少一種微生物的產(chǎn)物流從反應(yīng)器來(lái)到提取模塊。
[0029] 在具體的實(shí)施方案中，提取步驟包括細(xì)胞破碎步驟，所述步驟使用高壓均化、化學(xué) 或物理預(yù)處理，如(但不限于)酸或堿預(yù)處理生物質(zhì)，W及加熱到高于蛋白質(zhì)變性溫度(在約 50°C與約200°C之間，優(yōu)選地在約75°C與約90°C之間）。在具體的實(shí)施方案中，提取步驟進(jìn)一 步包括溶劑萃取步驟。在具體的實(shí)施方案中，溶劑萃取步驟將產(chǎn)物流分成包含一種或多種 產(chǎn)物和溶劑的輕相W及包含廢生物質(zhì)的重相。
[0030] 在具體的實(shí)施方案中，溶劑為非極性燒控或短鏈醇或其任何組合。在優(yōu)選的實(shí)施 方案中，溶劑為與微生物脂質(zhì)組合物相容的己燒或替代性短鏈燒控(例如戊燒、庚燒)或短 鏈醇，例如下醇、異下醇、叔下醇、戊醇或任何其它溶劑(或溶劑系統(tǒng)組合）?？傻梦⑸锂a(chǎn)物 的性質(zhì)越具極性，應(yīng)選擇越具極性的溶劑體系。
[0031] 在具體的實(shí)施方案中，至少一種所提取的產(chǎn)物進(jìn)一步來(lái)到產(chǎn)物加工模塊。在具體 的實(shí)施方案中，將至少一種所提取的產(chǎn)物升級(jí)到可再生柴油、生物柴油燃料、柴油燃料、柴