多種改進(jìn)型橙/紅色熒光蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多種改進(jìn)型橙/紅色熒光蛋白，通過對(duì)來自珊瑚蟲Discosoma sp.紅色熒光蛋白DsRed氨基酸序列的改造，獲得的新型熒光蛋白與野生型具有不同的特點(diǎn)。本發(fā)明獲得了一種與mOrange2類似但更亮的單體結(jié)構(gòu)橙色熒光蛋白，其熒光亮度比mOrange2高2.0倍。本發(fā)明還獲得了一種新型的紫紅色熒光蛋白，該熒光蛋白具有特異性的最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。本發(fā)明還涉及將改進(jìn)型的熒光蛋白用于多領(lǐng)域的研究，采用將熒光蛋白融合在靶標(biāo)蛋白N端或C端，在細(xì)胞系或活體動(dòng)物中表達(dá)該融合蛋白，可對(duì)靶標(biāo)蛋白進(jìn)行細(xì)胞、亞細(xì)胞和活體組織內(nèi)的定位，示蹤，功能展示等多種進(jìn)行分析。
【專利說明】
多種改進(jìn)型橙/紅色熒光蛋白
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一些改進(jìn)型的橙/紅色焚光蛋白，通過對(duì)來自珊瑚蟲Discosoma sp.紅色熒光蛋白DsRed序列的改造，所得新型熒光蛋白與野生型具有明顯不同的顏色（激 發(fā)光譜和發(fā)射光譜）、熒光強(qiáng)度等特點(diǎn)。本發(fā)明還涉及上述熒光蛋白基因的克隆、表達(dá)及其 可與蛋白在N端或在C端融合，在細(xì)胞系或活體動(dòng)物中表達(dá)，可對(duì)靶標(biāo)蛋白進(jìn)行細(xì)胞、亞細(xì) 胞和活體組織內(nèi)的定位，示蹤，功能展示等進(jìn)行多種分析。
【背景技術(shù)】
[0002] 熒光蛋白作為分子標(biāo)簽，在分析生物技術(shù)和細(xì)胞內(nèi)分子示蹤方面具有廣泛的應(yīng) 用。尤其是在細(xì)胞分子影像的應(yīng)用方面，可以通過融合蛋白技術(shù)，將熒光蛋白融合到細(xì)胞內(nèi) 的某個(gè)靶標(biāo)蛋白上，以標(biāo)記和分析靶標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位、分布和運(yùn)動(dòng)以及與其他細(xì)胞 內(nèi)分子的相互作用。熒光標(biāo)簽眾多，如何選擇熒光蛋白更好的顯示靶標(biāo)蛋白的示蹤和功能， 主要考慮以下幾個(gè)方面：1)焚光蛋白表達(dá)殼度尚，無毒性；2)焚光蛋白具有很好的光穩(wěn)定 性；3)不能選擇多聚體的熒光蛋白；4)熒光蛋白不能對(duì)表達(dá)細(xì)胞或組織環(huán)境因素敏感；5) 要有多通道，不相互干擾的熒光蛋白。
[0003] 紅色焚光蛋白 drFP583 (DsRed)是從 Discosoma sp?分離得到的（Matz et al.， Nature Biotech. 17 ：969-973(1999), Gross et al. , Proc. Nat ' LAcad. Sci. USA 97 ： 11990-11995(2000))，其優(yōu)點(diǎn)顯而易見：可與GFP系列熒光蛋白共用，且激發(fā)和發(fā)射波長更 長，細(xì)胞內(nèi)成像背景低，能夠與現(xiàn)有的共聚焦和寬視場顯微鏡濾光片等具有很好的包容性， 紅光的穿透性尤其適用于對(duì)活體動(dòng)物組織的成像，因而紅色熒光蛋白顯得尤為重要。在哺 乳動(dòng)物細(xì)胞中，無論是自發(fā)熒光還是對(duì)紅光區(qū)的光吸收都大為減少，因此紅色熒光探針的 發(fā)展對(duì)于檢測厚標(biāo)本和活體動(dòng)物成像都是非常重要的。在后續(xù)的熒光使用中，逐漸在熒光 蛋白的單體化，適應(yīng)多細(xì)胞區(qū)域表達(dá)，熒光穩(wěn)定性等多方面對(duì)紅色熒光蛋白有了更多的需 求，而DsRed為4聚體蛋白，高度聚集的形式不利于與蛋白融合表達(dá)來觀察蛋白的表達(dá)定 位，功能等的能力，因此開展了更大規(guī)模的紅色熒光蛋白突變體篩選工作。但將DsRed突變 為單體后，其光穩(wěn)定性大大縮短，無法滿足共聚焦的成像要求，并且由于改變了發(fā)光體的結(jié) 構(gòu)，容易形成更多不同顏色差異的紅色熒光蛋白。因此，目前紅色熒光蛋白進(jìn)化的焦點(diǎn)集中 在兩個(gè)目標(biāo)上，第一完善當(dāng)前己有的單體紅色熒光蛋白，使得它們的熒光特性或穩(wěn)定性等 特征進(jìn)一步優(yōu)化；第二是開發(fā)能發(fā)紅光的熒光蛋白，甚至是發(fā)射波段處于遠(yuǎn)紅外區(qū)的熒光 蛋白。短短數(shù)年，對(duì)紅色熒光蛋白的一系列研究，極大地豐富了熒光蛋白的光譜多樣性，為 細(xì)胞內(nèi)的多色標(biāo)記提供了更多的熒光標(biāo)簽。
[0004] m0range2為從DsRed蛋白基礎(chǔ)上突變獲得橙紅色的熒光突變體，其激發(fā)光譜為 549nm，發(fā)射光譜為565nm。既可在紅色熒光下發(fā)紅光，也可以在橙色熒光下發(fā)橙色的光。相 對(duì)于DsRed紅色焚光蛋白，m0range2形成了更有利于蛋白融合表達(dá)的單體形式，并且蛋白 成熟速度快，但熒光強(qiáng)度雖略有下降，其光穩(wěn)定性雖比DsRed四聚體差，但相對(duì)于大多數(shù)單 體紅色焚光蛋白，其光穩(wěn)定性完全可以保證共聚焦的成像要求（表1)。由于m0range2明 顯的光穩(wěn)定優(yōu)勢，與其融合表達(dá)的蛋白可以在高強(qiáng)度的共聚焦顯微鏡下清晰的顯示蛋白在 細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)表達(dá)的焚光圖像（Nathan C.Shaner等，Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 2008 ；5 (6)： 545-551) 〇
[0005] 表1 :紅色熒光蛋白的熒光特性
[0007] 本發(fā)明欲以DsRed的序列為模板，對(duì)其熒光結(jié)構(gòu)的構(gòu)建位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變，并 且增加了隨機(jī)突變的文庫來篩選單體結(jié)構(gòu)，熒光強(qiáng)度高，光穩(wěn)定性強(qiáng)等特性的紅色熒光 蛋白，即在保證單體結(jié)構(gòu)適于與靶標(biāo)蛋白融合表達(dá)的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)優(yōu)化其亮度和光穩(wěn)定 性。本發(fā)明獲得了 3株突變?yōu)椴煌伾母吡炼葻晒獾鞍?，其中一株橙紅色熒光蛋白 OFPSpark(sRFPlO)的亮度明顯增強(qiáng)，可以更好的增強(qiáng)蛋白融合后的熒光蛋白亮度。另一株 SRFP2蛋白為一新激發(fā)波長的熒光蛋白，相對(duì)于常見的紅色熒光蛋白，該熒光蛋白的激發(fā)和 發(fā)射波長更長，具有一定的特色。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種新的熒光蛋白OFPSpark(sRFPlO)，該熒光蛋白是 由DsRed紅色熒光蛋白突變而來，其特征在于由SEQ. ID. N0 :7所示氨基酸序列中包含了 E10P，R17H，E32V，H41F，Q64H，K83L，F(xiàn)99Y，T147S，L150M，E160K，L225Q 位置上由相應(yīng)的氨 基酸替換。所述熒光蛋白激發(fā)峰是549nm，發(fā)射峰是566nm，呈橙紅色，可以分別在橙色和紅 色激發(fā)光譜下反射焚光。與親本蛋白相比（DsRed的激發(fā)峰為558nm，發(fā)射峰為583nm)，所 述熒光蛋白為單體形式，并且保留了很強(qiáng)的熒光亮度，可在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能獲得良 好表達(dá)，激發(fā)出明顯的熒光。
[0009] 本發(fā)明的又一方面，提供了 一種由SEQ.ID.N0 :5所示氨基酸序列的熒光蛋白 sRFP2,該熒光蛋白是由DsRed紅色熒光蛋白突變而來，其中包含如下氨基酸替換：E10Q， V16I，R17Y，E32V，R36K，H41T，K47Q，A64H，C116T，F(xiàn)117L，K121H，M141L，A145P，L150N，I161N， K163M，V175C，Q188K，Y193H，S197Y，I210V，G219A，L225Q。與親本蛋白比，其光譜范圍紅移， 所述熒光蛋白激發(fā)峰是577nm，發(fā)射峰是602nm，呈一種很漂亮的紫紅色。
[0010] 本發(fā)明的又一方面，提供了 一種由SEQ.ID.N0 :9所示氨基酸序列的熒光蛋白 SRFP12,該熒光蛋白是由DsRed紅色熒光蛋白突變而來，其中包含如下氨基酸替換：E10P， R17H，E32V，R36K，K47Q，K83C，L85A，I210Y，L225Q。與親本蛋白比，所述熒光蛋白激發(fā)峰是 547nm，發(fā)射峰是565nm，呈一種很漂亮的玫紅色。
[0011] 本發(fā)明的又一方面，還提供了 OFPSpark和sRFP2熒光蛋白與表達(dá)于多種細(xì)胞器中 靶標(biāo)蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，可檢測細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)蛋白的表達(dá)、定位，及標(biāo)記相互作用蛋白等多種 用途。即將OFPSpark熒光蛋白基因序列放在靶標(biāo)蛋白的N端或C端融合在一起后，裝載到 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體中，將表達(dá)載體采用不同的方式轉(zhuǎn)染細(xì)胞或活體組織，轉(zhuǎn)染24~ 120小時(shí)后，可在專業(yè)熒光成像設(shè)備下觀察熒光圖像。
【附圖說明】
[0012] 圖1 :高純度的3株紅色突變克隆蛋白溶液，sRFP2, OFPSpark(sRFPlO)和SRFP12 的顏色分別為紫紅，橙紅色和玫紅；
[0013] 圖2 :紅色熒光突變蛋白的熒光光譜測定，其中橫軸為波長，縱軸為熒光強(qiáng)度，結(jié) 果顯示sRFP2的最大激發(fā)波長578nm，最佳發(fā)射波長602nm ;0FPSpark (sRFPIO)的最大激發(fā) 波長549nm，最佳發(fā)射波長566nm ;sRFP12的最大激發(fā)波長548nm，最佳發(fā)射波長565nm ;
[0014] 圖 3 :pCMV3-sRFP2, pCMV3-sRFP10 和 pCMV3-sRFP12 在 293H 細(xì)胞中表達(dá)熒光蛋白 強(qiáng)度，在范圍為532. 5~587. 5nm波長通道激發(fā)光下出紅色熒光，sRFPIO的熒光強(qiáng)度最亮， SRFP12的熒光強(qiáng)度次之，sRFP2的熒光強(qiáng)度最弱；
[0015] 圖 4 :pCMV3-0FPSpark(sRFP10)和 pCMV3-m0range2 在 293H 細(xì)胞和 Hela 細(xì)胞中 表達(dá)熒光蛋白強(qiáng)度，在范圍為532. 5~587. 5nm波長通道激發(fā)光下出紅色熒光，在2種細(xì)胞 中，OFPSpark比m0range2的亮度明顯增強(qiáng)；在范圍為503. 5~547. 5nm波長通道激發(fā)光下 出橙色熒光；在293H細(xì)胞中，OFPSpark比m0range2的亮度明顯增強(qiáng)。
[0016] 圖5 :m0range2和OFPSpark的SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳檢測；
[0017] 圖 6 :m0range2 (圖 A)和 OFPSpark (圖 B)的 SEC-HPLC 檢測；
[0018] 圖7 :m0range2和OFPSpark的pH穩(wěn)定性測定，OFPSpark的pH穩(wěn)定性略優(yōu)于 m0range2 ；
[0019] 圖8 :m0range2 (上圖）和OFPSpark(下圖）的焚光消光系數(shù)檢測，m0range2蛋白 的熒光消光系數(shù)為50000M km \ OFPSpark蛋白的熒光消光系數(shù)為84000M km S
[0020] 圖9 :m0range2和OFPSpark的發(fā)射光波譜，在相同的蛋白濃度下，m0range2的 發(fā)射光的波譜面積為122736, OFPSpark的發(fā)射光的波譜面積為216142,其發(fā)射光光譜比 m0range2 強(qiáng) 1. 8 倍；
[0021] 圖10A :0FPSpark和m0range2蛋白在紫外強(qiáng)光下的光穩(wěn)定特性檢測，其結(jié)果類似； 圖10B為在共聚焦顯微鏡下，561nm紅光光譜的高強(qiáng)度光刺激下OFPSpark和m0range2的光 穩(wěn)定性檢測，其結(jié)果也顯示類似；
[0022] 圖11 :0FPSpark與目的基因融合表達(dá)載體示意圖，圖A為OFPSpark放在目的基因 N端表達(dá)的載體不意圖，圖B為OFPSpark放在目的基因C端表達(dá)的載體不意圖；
[0023] 圖12 :pCMV-TUBB-〇FPSpark微管蛋白TUBB融合蛋白在Hela細(xì)胞中表達(dá)圖，激發(fā) 光為56lnm波長通道激發(fā)光下出紅色熒光；
[0024] 圖13 :pCMV-G0LMl-0FPSpark高爾基體蛋白G0LM1融合蛋白在Hela細(xì)胞中表達(dá)， 激發(fā)光為561nm波長通道激發(fā)光下出紅色熒光；
[0025] 圖14 :pCMV-ACTB-〇FPSpark胞質(zhì)骨架蛋白ACTB融合蛋白在Hela細(xì)胞中表達(dá)，激 發(fā)光為56lnm波長通道激發(fā)光下出紅色焚光；
[0026] 圖15 :pCMV-LAMPl-〇FPSpark溶酶體蛋白LAMP1融合蛋白在Hela細(xì)胞中表達(dá)，激 發(fā)光為56lnm波長通道激發(fā)光下出紅色焚光；
[0027] 圖16 :PCMV-CCNEl-sRFP2細(xì)胞核蛋白CCNE1融合蛋白在Hela細(xì)胞中表達(dá)，激發(fā)光 為561nm波長通道激發(fā)光下出紅色熒光。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 實(shí)施例1. DsRed突變文庫的構(gòu)建：
[0029] 通過Discovery studio4. 0軟件對(duì)DsRed (氨基酸序列見SEQ. ID. N0 :1)蛋白結(jié)構(gòu) 的分析，找出可能影響DsRed結(jié)構(gòu)的48個(gè)位點(diǎn)，這48個(gè)位點(diǎn)是：R2, S4, K5, E10, V16, R17， T21，E32, R36, H41，N42, V44, K47, Q64, F65, Q66, V71，V73, K83, L85, F91，E99, C117, F118， F124, 1125, V127, T147, L150, R153, V156, E160, 1161，H162, K163, A164, L174, V175, F177， S179, 1180, Y192, Y194, S197, 1210, T217, G219, L225,將這 48 個(gè)點(diǎn)錯(cuò)開分成 12 組（表 2)， 分別對(duì)每組每個(gè)位點(diǎn)的氨基酸做飽和突變，這樣得到了 12組飽和突變的基因庫；另外用易 錯(cuò)PCR方法對(duì)DsRed基因進(jìn)行隨機(jī)突變，得到一組突變基因庫；將這13組突變基因應(yīng)用DNA Shuffling的方法進(jìn)行隨機(jī)重組，插入pQE30載體，建立pQE30-DsRed-DS文庫，以期獲得熒 光光譜變異的突變型。
[0030] 表2 :13組DsRed的突變庫
[0031]
[0032] 分別在DsRed基因的首尾設(shè)計(jì)引物，并加入可以連接進(jìn)入載體的BamHI和PstI位 點(diǎn)，上游引物序列是 RFP-Bam-F :5' GGAGGATCCATGGATAGCACTGAGAACGTCA 3'（SEQ. ID. N0 : 2)，下游引物序列為 RFP-Pst-R :5' GGACTGCAGCTACTGGAACAGGTGGTGGC 3'（SEQ. ID. NO :3)。 中間突變點(diǎn)處正向飽和引物設(shè)計(jì)是"NNK"，反向飽和引物設(shè)計(jì)是"NNM"，這樣每組基因需要 設(shè)計(jì)4對(duì)突變引物，以質(zhì)粒pcDNA3-D SRed為模板分段擴(kuò)增，然后用重疊PCR法以首尾引物 組合成完整的DsRed-ml~DsRed-ml2突變基因庫。
[0033] 同樣用RFP-Bam-F/RFP-Pst-R引物以質(zhì)粒pcDNA3-DsRed為模板進(jìn)行易錯(cuò)PCR 擴(kuò)增全長DsRed隨機(jī)突變基因庫，隨機(jī)引入突變位點(diǎn)，易錯(cuò)PCR條件為：6mM MgCljP 5mM MnCl2存在下，將dATP，dGTP，dCTP，dTTP按不同比例混合，進(jìn)行易錯(cuò)PCR，PCR循環(huán)條件為： 94°(：，51^11;941€3〇8,551€3〇8,72 1€5〇8,30個(gè)循環(huán)；721€5111111，形成〇81^(11113突變庫。
[0034] 分別取 10 y gDsRed-ml ~DsRed-ml2 和 10 y g 易錯(cuò) PCR 產(chǎn)物 DsRed-ml3 混合后 用DNasel完全消化成小于300bp的條帶，瓊脂糖凝膠回收50-200bp間的條帶。取200ng 膠回收純化的 50-200bp 的 DNA 混合物，加入 5 y 1 lOxTaq buffer，2 y 1 dNTP，0? 5 y 1 taq 酶，進(jìn)行拼接，循環(huán)條件為：94°C 5min ;94°C 30s，50°C 30s，72°C 50s，25 個(gè)循環(huán)；72°C，5min。 取 10yl 上面的PCR 產(chǎn)物，其為模板，加入 10yl 10xTaqbuffer，4yl dNTP，lyl taq酶 和首尾引物2 y 1 10 y M RFP-Bam-F/RFP-Pst-R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)條件為：94°C，5min ; 94°〇3〇8,6〇1€3〇8,721€5〇8,30個(gè)循環(huán)；72°(：，5111111。擴(kuò)增完成后，膠回收純化68(^?條帶， 經(jīng)BamHI+PstI雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的pQE30載體進(jìn)行連接反應(yīng)，電轉(zhuǎn)XLl-Blue細(xì)胞， 加入lml S0C培養(yǎng)基于37°C，180rmp培養(yǎng)40min復(fù)蘇細(xì)胞，取500 y 1涂LB-AT (Amp與Tet 抗性）平皿，平均5 y 1涂一塊平皿，37°C培養(yǎng)14h拿出平皿，放室溫觀察。剩余部分菌液加 入甘油于_20°C保存，DsRed-DS文庫制備完成。
[0035] 實(shí)施例2. DsRed突變克隆的篩選：
[0036] 將DsRed-DS文庫均勻的涂板于ZYM-AT自誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板（1%胰蛋白胨，0. 5% 酵母提取物，25禮似2即04,251111 腿2?04,501111 順4(：1，51111似2504,0.5%甘油，0.05%葡萄 糖，0? 2% a-乳糖，2mM MgS04,0. 2x微量元素，1%瓊脂和50 y g/mLAmp)上，30°C培養(yǎng)過夜， DsRed-DS文庫中的單克隆表達(dá)突變熒光蛋白，呈現(xiàn)不同亮度和顏色。觀察平皿，將較亮的 紅色菌落用記號(hào)筆圈出來。下步配制ZYM-AT自誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基，于96孔深孔板中每孔加 入200 y 1 ZYM-AT液體培養(yǎng)基中。然后將這些較亮的紅色菌落挑出來接種至96孔板中，共 挑1820個(gè)克隆，所有深孔板放入30°C，200rpm搖床培養(yǎng)16h進(jìn)行熒光蛋白表達(dá)。將過夜表 達(dá)菌液用PBS稀釋5倍（20 y 1菌液+80 y 1 PBS)，用微孔板檢測系統(tǒng)SpectraMax M5進(jìn)行 檢測，先用波長掃描對(duì)96孔板樣品進(jìn)行粗略掃描，掃描結(jié)果顯示，所有突變體的激發(fā)峰在 530-590nm之間，發(fā)射峰在550-610nm之間，記下每孔的激發(fā)峰和發(fā)射峰值，每個(gè)孔用相應(yīng) 的激發(fā)峰和發(fā)射峰進(jìn)行檢測，測定每個(gè)樣品的熒光值。經(jīng)過大量篩選，挑選了 3株可穩(wěn)定激 發(fā)不同顏色的高熒光值紅色熒光蛋白的克隆，分別命名為81^?2、81^?10、81^?12，序列見表 3〇
[0037] 將 pQE30-sRFP2、pQE30-sRFP 10、pQE30-sRFP 12 單克隆挑于 LB 細(xì)菌培養(yǎng)基中 37 °C， 200印111培養(yǎng)過夜，按0.5%接種于2001111 2￥11-41'自誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基中，37°(：，240印111搖床培 養(yǎng) 20h 后，離心收獲菌液，收獲菌體（BECKMAN COULTER Avanti@J-26XPI，6500RPM/15min)， 按菌體：緩沖液1 : 20加入裂解緩沖液BufferA(50Mm Tris，pH8. 0,500mM NaCl)，攪拌 混勻，高壓均質(zhì)機(jī)破碎（ATS，200Pa兩次，800pa每次），離心收集上清（BECKMAN COULTER AllegraTM 64R Centrifuge，12000RPM/30min)，0? 45 ym 濾膜過濾，得到澄清的上清液，將 樣品用恒流栗上Ni柱，（提前用bufferA，3柱體積平衡），同時(shí)打開UV燈，在線監(jiān)測，樣 品上完后，用buffer A將UV平衡至基線，分步階段洗脫，10 % B，15 % B，20 % B，50 % B， 100% B(buffer B:50mM Tris，pH8.0,500mM NaCl，500mM Imidazole)，分別收集各個(gè)洗脫 峰。變性電泳監(jiān)測純度，將純度合格的組分過S印hadex G-25Fine柱脫鹽至PBS。圖1顯 示3種突變RFP蛋白的肉眼觀察顏色，其中sRFP2為紫紅色，sRPFlO為橙紅色，SRPF12為 玫紅色。檢測這三種蛋白的發(fā)射峰和激發(fā)峰：具體方式為：1)發(fā)射波長設(shè)為0,掃描激發(fā)光 譜A(設(shè)激發(fā)波長掃描范圍為200~700nm) ;2)熒光發(fā)射光譜：找出吸收最強(qiáng)（或次強(qiáng)）對(duì) 應(yīng)的波長作為激發(fā)波長，掃描發(fā)射光譜（設(shè)發(fā)射波長掃描范圍為激發(fā)波長+5nm~700nm); 3)熒光激發(fā)光譜：找出吸收最強(qiáng)（或次強(qiáng)）對(duì)應(yīng)的波長作為發(fā)射波長，掃描激發(fā)光譜。圖 2顯示sRFP2、sRFPIO、SRFP12的熒光光譜，其中sRFP2的最大激發(fā)波長577nm，最佳發(fā)射 波長602nm ;sRFP10的最大激發(fā)波長549nm，最佳發(fā)射波長566nm ;sRFP12的最大激發(fā)波長 547nm，最佳發(fā)射波長565nm (見表3)。
[0038] 表3 :突變紅色克隆的特性及序列
[0040] 實(shí)施例3. sRFP突變型熒光蛋白和m0range2熒光蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表 達(dá)：
[0041] 用引物 sRFP-inf-F :5' GGTACCGCTAGCGGATCCATGGATAGCACTGAGAACGTCA 3'（SEQ. ID. N0 :10)和 sRFP-inf-R :5'GGCCGCTCTAGACTCGAGCTACTGGAACAGGTGGTGGC 3'（SEQ. ID. N0 : 11)分別以這3株突變型為模板擴(kuò)增sRFP2, sRFPIO和sRFP12基因，經(jīng)infusion酶連入到真 核表達(dá)載體PCMV3中，鑒定得到正確的質(zhì)粒pCMV3-sRFP2，pCMV3-sRFP10和pCMV3-sRFP12。 純化獲得轉(zhuǎn)染級(jí)純度的pCMV3-sRFP2, pCMV3-sRFP10和pCMV3-sRFP12質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293H細(xì)胞。 具體步驟為：29311細(xì)胞用含10%胎牛血清的01^11培養(yǎng)基，在37°(：及5%二氧化碳條件下培 養(yǎng).轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞按1 X 105細(xì)胞/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24h后用于轉(zhuǎn)染，細(xì) 胞密度為70%~90%。2ygDNA與一定量PEI (按PEI : DNA = 5 : 1的比例添加）各用 50yL稀釋緩沖液（25mmol/L Ifepes，150mmol/L NaCl，pH 7. 1)稀釋到終濃度。將稀釋后 的PEI溶液逐滴加入DNA溶液中，立即振蕩混勻，室溫靜置30min后，將混合液加到鋪有細(xì) 胞的24孔板中，搖動(dòng)混勻后于5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)。分別于24h、48h、72h用 熒光顯微鏡觀察熒光，挑選最亮的時(shí)間段拍攝照片（圖3)。其結(jié)果顯示，在范圍為532. 5~ 587. 5nm波長通道激發(fā)光下，sRFPIO的表達(dá)最亮，該蛋白的顏色為橙紅色，并且其熒光光譜 也與m0range2 -致，因此將該蛋白命名為OFPSpark。
[0042] 用引物 m0range2-inf-F :5' GGTACCGCTAGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG 3'（SEQ. ID. N0 :12)和 m0range2-inf-R :5' GGCCGCTCTAGACTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCC ATGC 3'（SEQ.ID.N0 :13)擴(kuò)增獲得m0range2的核苷酸序列。經(jīng)infusion酶連入到真 核表達(dá)載體PCMV3中，鑒定得到正確的質(zhì)粒pCMV3-m0range2 (SEQ. ID. N0 :14)。提取獲 得 pCMV3-mOrange2 和 pCMV3-sRFP10 (OFPSpark)的轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染 293H 和 Hela 細(xì)胞。 具體步驟同前文，挑選最亮的時(shí)間段拍攝照片（圖4)。其結(jié)果顯示，在范圍為532. 5~ 587. 5nm波長通道激發(fā)光下為高亮度的紅色熒光，OFPSpark在2種細(xì)胞中的表達(dá)明顯強(qiáng)于 m0range2,在范圍為503. 5~547. 5nm波長通道激發(fā)光下為橙色熒光，OFPSpark表達(dá)也強(qiáng) 于 m0range2〇
[0043] 實(shí)施例4. OFPSpark熒光蛋白性質(zhì)的測定：
[0044] 1. OFPSpark 和 m0range2 焚光蛋白的生產(chǎn)：
[0045] 具體方法同前，采用 pQE30_sRFP10(0FPSpark)、pQE30_m0range2 兩種表達(dá)質(zhì)粒 培養(yǎng)1L表達(dá)產(chǎn)物，離心破菌得到澄清的上清液，Ni柱純化獲得高純度的熒光蛋白，脫鹽至 PBS。OFPSpark和m0range2蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖5,蛋白條帶結(jié)果顯示m0range2 比OFPSpark分子量略大，均在28~30kD，與其理論分子量相吻合。純化蛋白采用SDS-PAGE 分析蛋白的分子量大小，采用SEC-HPLC分析熒光蛋白的顆粒大小，分子量略大的m0range2 的HPLC出峰時(shí)間為17. 768分鐘，分子量略小的OFPSpark的HPLC的出峰時(shí)間為18. 468分 鐘（圖6)。該結(jié)果顯示OFPSpark蛋白和m0range2蛋白一樣，均為單體的結(jié)構(gòu)。
[0046] 2. OFPSpark pH值穩(wěn)定性測定
[0047] pH值穩(wěn)定性測定方法為：配置pH3至pH12的緩沖液備用，用配置好的緩沖液將熒 光蛋白稀釋至20 μg/ml，用熒光蛋白的最大激發(fā)波長激發(fā)，用最大發(fā)射波長檢測熒光信號(hào)； 記錄相應(yīng)pH值下的熒光信號(hào)值，將熒光信號(hào)最強(qiáng)的值定義為100%，計(jì)算出相應(yīng)pH值下的 熒光強(qiáng)度百分比，將50%熒光強(qiáng)度下的pH值定義為pKa。圖7顯示m0range2的pKa為6. 8， OFPSpark的pKa為6. 2。OFPSpark的pH耐受能力要略好于m0range2。pH值穩(wěn)定性越低， 表明蛋白可以更好的適應(yīng)多環(huán)境系統(tǒng)的表達(dá)，保證其應(yīng)用范圍不受限制。
[0048] 3. OFPSpark消光系數(shù)的測定
[0049] 依據(jù)消光系數(shù)的計(jì)算公式：e = A/bc其中e為消光系數(shù)；A為吸光度；c為溶液中 物質(zhì)的濃度；b為光在溶液中的光程。利用BCA法檢測生產(chǎn)的熒光蛋白的濃度，依據(jù)測定的 濃度，將樣品用 pH8. 0 的緩沖液稀釋至 10 y g/ml，20 y g/ml，40 y g/ml，80 y g/ml 和 160 y g/ ml在lcm光程比色皿中檢測吸光值；依據(jù)檢測的吸光值和對(duì)應(yīng)熒光蛋白的摩爾濃度作圖， 擬合直線，從計(jì)算公式中讀取消光系數(shù)值。圖8顯示m0range2的消光系數(shù)為50000M icm \ OFPSpark的消光系數(shù)為84000M icm i。該結(jié)果表明OFPSpark的光吸收性能是m0range2的 1.7 倍。
[0050] 4. OFPSpark量子產(chǎn)率測定
[0051] 本研究通過參比法檢測熒光蛋白量子產(chǎn)率，依據(jù)公式：Yu = Ys*Fu/Fs*As/Au ;Yu、 Ys為待測物質(zhì)和參比物質(zhì)的量子產(chǎn)率；Fu、Fs為待測物質(zhì)和參比物質(zhì)的積分熒光強(qiáng)度；Au， As為待測物質(zhì)和參比物質(zhì)在選定激發(fā)波長下（為548nm)的吸光值（A = ebc)。熒光樣品用 PH8. 0的緩沖液稀釋至20 y g/ml在選定的激發(fā)波長條件下，用lcm光程比色皿中檢測吸光 值，其中OFPSpark在548nm激發(fā)波長下的吸光值為0. 035, m0range2在548nm激發(fā)波長下 的吸光值為0.023;同時(shí)將該樣品在選定波長條件下，進(jìn)行波譜掃描，導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)數(shù)值，整理 后作圖，進(jìn)行波譜積分。將檢測獲得的吸光值，積分熒光強(qiáng)度，參比物的量子產(chǎn)率值帶入公 式計(jì)算獲得待測物質(zhì)的量子產(chǎn)率。分析獲得的熒光發(fā)射光譜面積見圖9, OFPSpark (光譜面 積為216142)的激發(fā)光譜強(qiáng)度比m0range2(光譜面積為122736)強(qiáng)1.8倍。根據(jù)量子產(chǎn)率 計(jì)算公式，參考文獻(xiàn)中的mOrange2的量子產(chǎn)率，計(jì)算得到OFPSpark的量子產(chǎn)率為0. 69,略 高于 m0range2 為 0.60 的量子產(chǎn)率（Nathan C.Shaner 等，Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 2008 ；5 (6)： 545-551) 〇
[0052] 5. OFPSpark 亮度檢測
[0053] 熒光亮度為蛋白的消光系數(shù)與量子產(chǎn)率的乘積，即熒光蛋白的光能量吸收轉(zhuǎn)換為 發(fā)射光的能量強(qiáng)度。根據(jù)該公式計(jì)算，OFPSpark的熒光亮度為58,而m0range2的熒光亮度 為29. 4。OFPSpark的亮度比m0range2高2.0倍。該結(jié)果也與這兩種熒光細(xì)胞在細(xì)胞中的 表達(dá)水平的差異結(jié)果相吻合。
[0054] 6. OFPSpark光穩(wěn)定性檢測
[0055] 本研究將50 y g/ml的m0range2和OFPSpark同時(shí)放置于紫外強(qiáng)光條件下照射， 不同時(shí)間點(diǎn)取樣檢測熒光強(qiáng)度；以最初的熒光強(qiáng)度為100%，計(jì)算不同時(shí)間的熒光強(qiáng)度百 分比，以時(shí)間和熒光強(qiáng)度百分比作圖分析熒光蛋白的失活速率。圖10A顯示m0range2和 OFPSpark的光穩(wěn)定性質(zhì)相似，都保留了相對(duì)較好的光穩(wěn)定性。
[0056] 將 pCMV3-m0range2 和 pCMV3-0FPSpark (sRFPIO)的轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞。具 體步驟同前文，轉(zhuǎn)染48h挑選最亮細(xì)胞用于光漂白檢測。使用NikonAl激光掃描共聚焦顯 微鏡進(jìn)行熒光蛋白光漂白檢測。物鏡為CFI Apo TIRF 60x，數(shù)值孔徑（N.A.)為1.49 ;激光 選用561nm通道（紅光光譜），光電倍增光（photomultiplier)電壓為80V;讀值區(qū)域面積 (R0I)為15600 y m2 (130 y m*120 y m)。漂白過程中每隔1. 55s讀取一次熒光值，共讀取25 次。以熒光漂白時(shí)間為橫坐標(biāo)和熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，分析m0range2和OFPSpark的熒 光強(qiáng)度隨漂白時(shí)間的變化。圖10B顯示OFPSpark和m0range2的在較強(qiáng)激光漂白下的熒光 強(qiáng)度變化趨勢相似，顯示OFPSpark與m0range2有相近的光穩(wěn)定特性。
[0057] 實(shí)施例5. OFPSpark熒光蛋白融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)：
[0058] 將微管蛋白TUBB，胞質(zhì)骨架蛋白ATCB，溶酶體蛋白LAMP1和高爾基體蛋白G0LM1 的0RF(無終止密碼子）基因序列用各自的特異引物擴(kuò)增出來，并在上下游引物上分別引 入 HindllI 和 Nhel ID. NO :15)，TUBB-R，5，ACCATGGATCCGCTAGCGGCCTCCTCTTCGGCCT 3，（SEQ. ID. NO : 16)， G0LM1-F，5 ' GGCCGCCACCAAGCTTATGGTGGACCTCCAGACACGG 3，（SEQ. ID. NO : 17)，G0LM1-R， 5' ACCATGGATCCGCTAGCGAGTGTATGATTCCGCTTTTCACG 3r (SEQ. ID. NO ：18),LAMP1-F,5r GG CCGCCACCAAGCTTATGGCTGCCCCCGGCAG 3r (SEQ. ID. NO ： 19),LAMP1-R,5r CCATGGATCCGCTAGC CATGCTGTTCTCGTCCAGCAGACA 3，（SEQ.ID.N0:20)，ActB-F，5' GGCCGCCACCMGCTTATGGATGA TGATATCGCCGC 3，（SEQ. ID. NO :21)，ActB-R，5，CCATGGATCCGCTAGCGAAGCATTTGCGGTGGACG 3' (SEQ. ID. NO :22)。通過PCR獲得4條基因需要表達(dá)的基因序列。通過HindllI+Nhel雙酶 切構(gòu)建到pCMV3-N-0FPSpark或pCMV3-C-0FPSpark載體中（圖11)，使之與OFPSpark形成融 合表達(dá)形式，獲得 pCMV3-LAMPl-0FPSpark，pCMV3-ACTB-0FPSpark，pCMV3-G0LMl-0FPSpark， pCMV3-TUBB-0FPSpark表達(dá)載體（見表4)。將這些融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同上。 表達(dá)48h后檢測，用Confocal共聚焦熒光顯微鏡觀察熒光，激發(fā)光為561nm(紅光范圍），并 拍攝照片。試驗(yàn)顯示：〇FPSpark能夠與這些基因融合表達(dá)，能應(yīng)用于真核細(xì)胞的定位，而且 對(duì)融合表達(dá)目的基因的折疊沒有影響（圖12,13,14,15)。
[0059] 表4 :0FPSpark融合蛋白序列
[0061] sRFP2熒光蛋白融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)：將核蛋白CCNE1的0RF(無終 止密碼子）基因序列用各自的特異引物擴(kuò)增出來，并在上下游引物上分別引入Hindlll和 Nhel 位點(diǎn)，CCNE1-F，5 ' GGCCGCCACCAAGCTTATGCCGAGGGAGCGCAGG 3 ' （SEQ. ID. N0 :31)， CCNE1-R，5 ' CCATGGATCCGCTAGCCGCCATTTCCGGCCCGC 3 ' （SEQ. ID. NO :32)。通過 PCR 獲得 CCNE1條基因需要表達(dá)的基因序列。通過Hindlll+Nhel雙酶切構(gòu)建到pCMV3-C-sRFP2載體 中，使之與OFPSpark形成融合表達(dá)形式，獲得pCMV3-CCNEl-sRFP2表達(dá)載體（見表5)。將 該融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同上。表達(dá)48h后檢測，用Confocal共聚焦焚光顯微 鏡觀察熒光，激發(fā)光為561nm(紅光范圍），并拍攝照片。試驗(yàn)顯示：sRFP2能夠與CCNE1基 因融合表達(dá)能發(fā)出漂亮的紅色熒光，可應(yīng)用于細(xì)胞核的定位，而且對(duì)融合表達(dá)目的基因的 折疊沒有影響（圖16)。
[0062] 表5 : sRFP2融合蛋白序列
[0063]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種熒光增強(qiáng)型的橙/紅色熒光蛋白，其特征在于： a) 核苷酸序列為SEQ. ID. NO :6,其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ. ID. NO :7 ; b) 氨基酸序列與SEQ. ID. NO :7有95%同源性的突變體； c) 為珊瑚蟲Discosoma sp.紅色焚光蛋白DsRed的突變體； d) 包含 E10P，R17H，E32V，H41F，Q64H，K83L，F(xiàn)99Y，T147S，L150M，E160K，L225Q 位點(diǎn)氨 基酸突變的橙/紅色熒光蛋白； e) 包含E10P，R17H，E32V，K83L，L225Q任一或組合位點(diǎn)氨基酸突變的橙/紅色熒光蛋 白； f) 該熒光蛋白在范圍為503. 5~547. 5nm波長通道激發(fā)光下為橙色熒光，在范圍為 532. 5~587. 5nm波長通道激發(fā)光下為高亮度的紅色熒光。2. -種新型紅色熒光蛋白，其特征在于： a) 核苷酸序列為SEQ. ID. NO :4,其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ. ID. NO :5 ; b) 氨基酸序列與SEQ. ID. NO :5有95%同源性的突變體； c) 為珊瑚蟲Discosoma sp.紅色焚光蛋白DsRed的突變體； d) 包含 E10Q，V16I，R17Y，E32V，R36K，H41T，K47Q，A64H，C116T，F(xiàn)117L，K121H，M141L， A145P，L150N，I161N，K163M，V175C，Q188K，Y193H，S197Y，I210V，G219A，L225Q 位點(diǎn)氨基酸 突變的紅色熒光蛋白； e) 該熒光蛋白在范圍為532. 5~587. 5nm波長通道激發(fā)光下為高亮度的紅色熒光。3. -種定位目的蛋白在細(xì)胞、動(dòng)物活體表達(dá)的方法，該方法包括： a) 采用基因工程技術(shù)將目的蛋白基因和權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)型橙/紅色熒光蛋白基 因（核苷酸序列為SEQ. ID. NO :6)融合； b) 將融合蛋白的基因序列插入到適合的表達(dá)載體中； c) 將融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞或動(dòng)物活體，并在上述細(xì)胞和活體的最適培養(yǎng)條件 下培養(yǎng)合適的時(shí)間，獲得包含SEQ. ID. NO :7氨基酸序列的橙/紅色熒光蛋白融合蛋白的表 達(dá)； d) 在權(quán)利要求1所述熒光蛋白的最佳激發(fā)光譜下觀察目的蛋白在細(xì)胞、動(dòng)物活體中的 表達(dá)定位。4. 權(quán)利要求3所述的方法中，增強(qiáng)型橙/紅色熒光蛋白基因序列可以放在目的基因的 C端或N端進(jìn)行融合表達(dá)。5. 權(quán)利要求3所述的方法中，適用的表達(dá)載體包含但不限于哺乳動(dòng)物真核表達(dá)載體 PCMV3,還包含細(xì)菌，昆蟲，酵母和慢病毒表達(dá)載體，其載體的特征在于： a) 包含表達(dá)宿主所需要的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域； b) 包含權(quán)利要求1所包含的橙/紅色熒光蛋白的核苷酸序列； c) 包含表達(dá)宿主所需要的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。6. 權(quán)利要求3所述的方法中，適用的表達(dá)細(xì)胞系包含但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì) 胞，酵母細(xì)胞和細(xì)菌。7. 權(quán)利要求3所述的方法可以用于檢測目的蛋白的表達(dá)定位，蛋白間的相互作用，表 達(dá)元件的功能，細(xì)胞器指示功能。8. -種表達(dá)增強(qiáng)型橙/紅色熒光蛋白的細(xì)胞或活體，其特征在于： a) 包含權(quán)利要求1所述的橙/紅色熒光蛋白的基因表達(dá)載體； b) 包含權(quán)利要求1所述的橙/紅色熒光蛋白的融合蛋白的基因表達(dá)載體； c) 上述表達(dá)載體可游離或重組于細(xì)胞或活體的基因組中； d) 可以用于細(xì)胞、活體的示蹤或功能分析。9. 一種定位目的蛋白在細(xì)胞、動(dòng)物活體表達(dá)的方法，該方法包括： a) 采用基因工程技術(shù)將目的蛋白基因和權(quán)利要求2所述的增強(qiáng)型紅色熒光蛋白基因 (核苷酸序列為SEQ. ID. NO :4)在基因的N端或C端融合； b) 將融合蛋白的基因序列插入到適合的表達(dá)載體中； c) 將融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞或動(dòng)物活體，并在上述細(xì)胞和活體的最適培養(yǎng)條件下 培養(yǎng)合適的時(shí)間，獲得包含SEQ. ID. NO :5氨基酸序列的紅色熒光蛋白融合蛋白的表達(dá)； d) 在權(quán)利要求2所述熒光蛋白的最佳激發(fā)光譜下觀察目的蛋白在細(xì)胞、動(dòng)物活體中的 表達(dá)定位。
【文檔編號(hào)】C12N15/867GK105820227SQ201510003374
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2015年1月6日
【發(fā)明人】孫春昀, 謝良志, 饒木鼎, 趙淑環(huán), 徐明明, 陳軍
【申請(qǐng)人】北京義翹神州生物技術(shù)有限公司