一種胰島素衍生物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明針對現(xiàn)有胰島素衍生物制備過程中使用等電沉淀法所存在的產(chǎn)率不高的問題，提供了一種胰島素衍生物的制備方法，該方法在胰島素部分與修飾基團部分的偶聯(lián)反應(yīng)完成后，在反應(yīng)液中加入二價或三價金屬離子，從而能將胰島素衍生物或胰島素衍生物前體的粗產(chǎn)物從反應(yīng)液中徹底沉淀出來，殘留在上清液中的產(chǎn)物損失量可以降低至對照例（未加金屬離子）的7%以下，有些甚至可以降至1%以下或者檢測不到，大幅度提高產(chǎn)品收率。
【專利說明】
一種胰島素衍生物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種胰島素衍生物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病。近年來全世界糖尿病的患病率都在增長， 在中國，隨著人民生活方式的改變和老齡化進程的加速，糖尿病的患病率更有迅猛增長的 趨勢，目前中國糖尿病人數(shù)患者已超過1. 14億，給個人、家庭和社會都帶來沉重的負(fù)擔(dān)。
[0003] 糖尿病患者一般都存在相對或絕對的胰島素分泌不足，故胰島素治療一直被當(dāng)作 是治療糖尿病并使血糖得到良好控制的重要手段。上世紀(jì)70年代，人們通過基因工程技術(shù) 開發(fā)出了重組人胰島素。后來，為了獲得速效或長效等不同作用時間曲線的藥物，人們又相 繼開發(fā)出了一系列的胰島素類似物和衍生物。其中胰島素類似物是指增加、刪除或改變胰 島素序列中的一個或多個氨基酸后所得到的胰島素類產(chǎn)品，胰島素衍生物是指在胰島素或 胰島素類似物的一個或多個位置上引入例如長鏈脂肪酸、聚乙二醇、烷基鏈等修飾基團后 所得到的胰島素類產(chǎn)品。胰島素衍生物相較于普通人胰島素具有更長的作用時間，藥動學(xué) 曲線也更為平穩(wěn)，更接近生理條件下基礎(chǔ)胰島素的分泌模式。目前已知的胰島素衍生物有 例如諾和諾德公司開發(fā)的地特胰島素、德谷胰島素，禮來公司開發(fā)的?；葝u素、聚乙二醇 化胰島素等。
[0004] 在制備方法上，胰島素類似物由于只涉及胰島素氨基酸序列上的變化，一般通過 設(shè)計核酸序列就可直接通過基因工程獲得。但是，胰島素衍生物需要在胰島素序列外連接 其他修飾基團，而這部分修飾基團如果不是蛋白質(zhì)或多肽，通常不能與胰島素部分一起通 過基因工程獲得。因此，現(xiàn)有的胰島素衍生物的制備方法通常是通過以下步驟來實現(xiàn)：先分 別獲得胰島素部分和修飾基團部分，然后將修飾基團部分與胰島素部分通過相應(yīng)的化學(xué)反 應(yīng)進行偶聯(lián)，得到胰島素衍生物粗品或胰島素衍生物前體的粗品。由于該偶聯(lián)反應(yīng)的溶液 體積一般較大，反應(yīng)產(chǎn)物濃度相對較低，因此在偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，通常需要先將反應(yīng)產(chǎn)物從 反應(yīng)溶液中沉淀分離出來，甚至干燥后，才能再進行后續(xù)的制備步驟，例如進行進一步的純 化，或是先脫除掉胰島素和/或修飾基團上的保護基團，再進行純化等等。
[0005] 上述制備方法中所述的沉淀分離步驟，在現(xiàn)有技術(shù)中通常是利用胰島素等電沉淀 的原理進行，即，將溶液的pH值調(diào)節(jié)到胰島素衍生物的等電點附近，使其沉淀，然后離心收 集沉淀。但是，這種等電沉淀的方法并不能使反應(yīng)產(chǎn)物沉淀完全，仍會有相當(dāng)多的胰島素衍 生物或胰島素衍生物前體沒有沉淀下來而留在上清液中，致使在該步驟中損失很多反應(yīng)產(chǎn) 物，直接影響最終的產(chǎn)品收率。例如，在專利200480021733. 8的實施例4中，其胰島素衍生 物的終產(chǎn)率只有12%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)在制備胰島素衍生物方法中存在的問題，本發(fā)明提供了一種胰島素 衍生物的制備方法，該方法在胰島素部分與修飾基團部分的偶聯(lián)反應(yīng)（以下簡稱"偶聯(lián)反 應(yīng)"）完成后，能夠?qū)⒁葝u素衍生物或胰島素衍生物前體的粗品從反應(yīng)液中徹底沉淀出來， 大幅度提_廣品收率。
[0007] 具體的說，本發(fā)明提供一種胰島素衍生物的制備方法，該制備方法包括在胰島素 部分與修飾基團部分的偶聯(lián)反應(yīng)完成后，在反應(yīng)液中加入二價或三價金屬離子的步驟。
[0008] 進一步的，本發(fā)明提供一種胰島素衍生物的制備方法，包括： 1. 分別獲得胰島素衍生物的胰島素部分和修飾基團部分； 2. 將胰島素部分與修飾基團部分進行偶聯(lián)反應(yīng)； 3. 在步驟2的偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液的pH值調(diào)節(jié)至反應(yīng)產(chǎn)物的等電點附近； 4. 在步驟3的反應(yīng)液中加入二價或三價金屬離子； 5. 收集步驟4獲得的沉淀。
[0009] 不同的胰島素衍生物由于其胰島素氨基酸序列的不同或是修飾基團種類的不同， 其合成策略也會有所差別。有些胰島素衍生物，在偶聯(lián)反應(yīng)完成后即可得到胰島素衍生物 的粗品；而有些胰島素衍生物，需要在偶聯(lián)反應(yīng)之前將胰島素部分和/或修飾基團部分中 干擾偶聯(lián)反應(yīng)的一些基團保護起來，在偶聯(lián)反應(yīng)后先得到胰島素衍生物前體的粗品，然后 再將保護基團脫除掉，得到胰島素衍生物的粗品。針對這兩種不同的合成策略，本發(fā)明提供 的胰島素衍生物的制備方法如下(具體流程圖參見圖1)。
[0010] -方面，本發(fā)明提供一種胰島素衍生物的制備方法，包括： 1. 分別獲得胰島素衍生物的胰島素部分和修飾基團部分； 2. 將胰島素部分與修飾基團部分進行偶聯(lián)反應(yīng)； 3. 在步驟2的偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液的pH值調(diào)節(jié)至反應(yīng)產(chǎn)物的等電點附近； 4. 在步驟3的反應(yīng)液中加入二價或三價金屬離子； 5. 收集步驟4獲得的沉淀，得到胰島素衍生物粗品。
[0011] 另一方面，本發(fā)明提供一種胰島素衍生物的制備方法，包括： 1. 分別獲得胰島素衍生物的胰島素部分和修飾基團部分，其中所述胰島素部分和/或 修飾基團部分帶有一個或多個保護基團； 2. 將胰島素部分與修飾基團部分進行偶聯(lián)反應(yīng)； 3. 在步驟2的偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液的pH值調(diào)節(jié)至反應(yīng)產(chǎn)物的等電點附近； 4. 在步驟3的反應(yīng)液中加入二價或三價金屬離子； 5. 收集步驟4獲得的沉淀； 6. 對步驟5獲得的沉淀進行脫保護反應(yīng)，得到胰島素衍生物粗品。
[0012] 優(yōu)選的，本發(fā)明的制備方法進一步包括在得到胰島素衍生物粗品后，對胰島素衍 生物粗品進行后處理，得到胰島素衍生物純品的步驟。
[0013] 本發(fā)明所述"胰島素衍生物"，是指在胰島素或胰島素類似物主鏈的一個或多個位 置上引入修飾基團所形成的胰島素類產(chǎn)品。
[0014] 本發(fā)明所述"胰島素部分"，是指胰島素衍生物結(jié)構(gòu)中的胰島素或胰島素類似物部 分，其序列可為全部或部分人胰島素的序列，或是其中氨基酸有增加、刪除或改變的全部或 部分胰島素類似物序列。本發(fā)明的胰島素部分可以通過商購獲得，也可以采用任何一種本 領(lǐng)域公知的肽/蛋白質(zhì)合成技術(shù)制備，例如固相合成法、基因工程法、DNA重組法等。
[0015] 本發(fā)明所述"修飾基團部分"，是指胰島素衍生物結(jié)構(gòu)中通過化學(xué)鍵連接到胰島素 部分的基團，其實例包括但不限于脂肪酸鏈、聚乙二醇鏈、烷基鏈等，優(yōu)選為脂肪酸鏈。本發(fā) 明的修飾基團部分可以通過商購獲得，也可以根據(jù)修飾基團部分的結(jié)構(gòu)，采用任何一種本 領(lǐng)域公知的技術(shù)制備。
[0016] 本發(fā)明所述"偶聯(lián)反應(yīng)"，是指將胰島素部分和修飾基團部分通過化學(xué)鍵連接起來 的化學(xué)反應(yīng)。根據(jù)胰島素部分和修飾基團部分中進行化學(xué)鍵連接的反應(yīng)基團不同，本發(fā)明 所使用的偶聯(lián)反應(yīng)的實例包括但不限于酯化反應(yīng)、?；磻?yīng)、烷基化反應(yīng)、還原反應(yīng)等，優(yōu) 選為酰化反應(yīng)。
[0017] 本發(fā)明所述"二價或三價金屬離子"，是指任何具有水溶性的二價或三價金屬離 子，包括但不限于 Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Mn 2+、Fe2+、Sr2+、Sn2+、Fe3+、Al 3+。優(yōu)選為 Cu2+、Co2+、 Ni2+、Zn2+、Fe3+。
[0018] 在本發(fā)明中，二價或三價金屬離子的加入量以胰島素部分的使用量為基準(zhǔn)。本發(fā) 明中所述的二價或三價金屬離子的加入量是指二價或三價金屬離子與胰島素部分的摩爾 t匕，該數(shù)值可在〇. 1-10:1的范圍內(nèi)，優(yōu)選〇. 8-8:1，更優(yōu)選0. 8:1、2:1、4:1、8:1。
[0019] 本發(fā)明所述"脫保護反應(yīng)"，是指將胰島素衍生物前體上的保護基團脫除掉的反 應(yīng)。脫保護反應(yīng)是多肽/蛋白質(zhì)合成中的常規(guī)反應(yīng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本領(lǐng)域公知常 識選擇保護基團、脫保護試劑和反應(yīng)條件。
[0020] 本發(fā)明所述"后處理"，是指在獲得胰島素衍生物粗品后，通過一個或多個本領(lǐng)域 常用的處理步驟，例如萃取、洗滌、干燥、純化等以得到胰島素衍生物純品。
[0021] 現(xiàn)有技術(shù)中的等電點沉淀法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的用于沉淀分離蛋白質(zhì)的 方法。其原理是：在等電點時，蛋白質(zhì)分子的凈電荷為零（即正負(fù)電荷相等），蛋白質(zhì)分子 在溶液中沒有因相同電荷產(chǎn)生的相互排斥作用，分子間更容易相互碰撞而產(chǎn)生沉淀。因此 蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最小，容易沉淀。
[0022] 但是，等電點沉淀法只是消除了蛋白質(zhì)分子間的電荷排斥作用，并沒有實際給予 蛋白質(zhì)分子相互聚集的力量。因此，僅僅使用等電點沉淀法，并不能有效地把溶液中所有蛋 白質(zhì)分子都沉淀出來，其溶解度還是相對較高，在離心后，仍然會有一大部分蛋白質(zhì)溶解在 上清液中，這直接導(dǎo)致了終產(chǎn)品收率的低下。
[0023] 令人驚奇地，在制備過程中加入二價或三價金屬離子，能顯著地降低胰島素分子 的溶解度，使胰島素分子從溶液中沉淀出來。在本發(fā)明中，在偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后加入二價或三 價金屬離子，然后離心收集沉淀，殘留在上清液中的產(chǎn)物損失量可以降低至對照例（未加金 屬離子）的7%以下，有些甚至可以降低至對照例的1%以下，或者根本檢測不到上清液中有 產(chǎn)物殘留，這使得胰島素衍生物的產(chǎn)品收率大大提高。在其他條件相同的情況下，產(chǎn)品收率 可提高5倍左右。而且，在對胰島素衍生物粗品進行純化后可將金屬離子去除，得到的胰島 素衍生物純品中并不含有金屬離子，不影響后續(xù)產(chǎn)品的使用，例如配制制劑等。
[0024] 在目前的胰島素制劑中，也存在一些制劑配方中含有二價鋅離子的情況。制劑中 含有二價鋅離子可以使胰島素分子形成六聚體復(fù)合物，但是這種六聚體復(fù)合物并不會從溶 液中沉淀出來，制劑溶液仍然是澄清狀態(tài)。由于胰島素分子只有在單體或二聚體的形式下 才能發(fā)揮降血糖作用，所以胰島素制劑中含有二價鋅離子的目的是為了延緩胰島素的釋放 速度，延長作用時間，并不會降低胰島素分子的溶解度，更不涉及胰島素分子的制備。
【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明胰島素衍生物制備方法的流程示意圖。
【具體實施方式】
[0026] 實施例1 不加金屬離子制備德谷胰島素(對照例)。
[0027] 原料Des(B30)_人胰島素根據(jù)中國專利94193852. 2實施例11中所述方法制備。
[0028] 原料叔丁基十六烷二酰基-Glu (OSu) -OtBu根據(jù)中國專利200480021733. 8實施例 4中所述方法制備。
[0029] 在 10-15°C下將 des(B30)人胰島素（500 mg，0. 088 mmol)加入至 137. 5ml 的 50禮/1似110)3的乙腈/水混合溶液中（乙腈：水=1:1)，再加入3.〇11115%恥 20)3(￥/^) 水溶液調(diào)節(jié)溶液至澄清（pH=10_ll)。另將叔丁基十六烷二?；?Glu(0Su)-0tBu(lllmg， 0. 176mmol)溶于5ml乙腈中，隨后在10-15°C加入到上述des(B30)人胰島素溶液中進行 偶聯(lián)反應(yīng)。反應(yīng)1小時。
[0030] 偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用HC1將pH調(diào)節(jié)至6-7,離心收集沉淀，凍干，得德谷 胰島素前體粗品117. 5 mg。將離心后的上清液進行色譜分析，通過外標(biāo)法測得上清液中殘 留德谷胰島素前體170. 7 mg。
[0031] 將上述凍干產(chǎn)物在10_15°C溶于95% (V/V)三氟乙酸（15ml)中攪拌進行脫保護反 應(yīng)，反應(yīng)1小時后，將反應(yīng)液倒入至150 ml甲基叔丁基醚中，通過離心收集沉淀，晾干，得德 谷胰島素粗產(chǎn)物122 mg。
[0032] 通過質(zhì)譜測得分子量為6104. 3,計算值為6103. 97。
[0033] 實施例2 加入Zn2+離子制備德谷胰島素（Zn 2+與胰島素摩爾比為0. 8:1)。
[0034] 按照實施例1的方法將des(B30)人胰島素和叔丁基十六烷二酰 基-Glu (OSu) -OtBu進行偶聯(lián)反應(yīng)。
[0035] 偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用HC1將pH調(diào)節(jié)至6-7,再加入2 ml ZnCl2水溶液 (ZnCl2濃度為4. 8 mg/mL，Zn 2+與胰島素摩爾比為0. 8:1)沉淀，通過離心收集沉淀，凍干，得 德谷胰島素前體粗品566 mg。將離心后的上清液進行色譜分析，通過外標(biāo)法測得上清液中 殘留德谷胰島素前體12. 0 mg。與對照例實施例1相比，殘留在上清液中的德谷胰島素前體 的損失量為對照例的7% (12. 0 mg/170. 7 mg)。
[0036] 將上述德谷胰島素前體按照實施例1的方法進行脫保護反應(yīng)，得德谷胰島素粗產(chǎn) 物599 mg。與對照例實施例1相比，粗產(chǎn)物產(chǎn)量高出4. 91倍（599 mg/122 mg)。
[0037] 根據(jù)實施例1的質(zhì)譜方法確認(rèn)產(chǎn)物為德谷胰島素。
[0038] 實施例3 加入Zn2+離子制備德谷胰島素（Zn 2+與胰島素摩爾比為2:1)。
[0039] 按照實施例1的方法將des(B30)人胰島素和叔丁基十六烷二酰 基-Glu (OSu) -OtBu進行偶聯(lián)反應(yīng)。
[0040] 偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用HC1將pH調(diào)節(jié)至6-7,再加入2 ml ZnCl2水溶液 (ZnCl2濃度為12 mg/mL，Zn2+與胰島素摩爾比為2:1)沉淀，通過離心收集沉淀，凍干，得德 谷胰島素前體粗品569 mg。將離心后的上清液進行色譜分析，通過外標(biāo)法測得上清液中殘 留德谷胰島素前體6.0 mg。與對照例實施例1相比，殘留在上清液中的德谷胰島素前體的 損失量為對照例的3. 5% (6.0 mg/170. 7 mg)。
[0041] 將上述德谷胰島素前體按照實施例1的方法進行脫保護反應(yīng)，得德谷胰島素粗產(chǎn) 物602 mg。與對照例實施例1相比，粗產(chǎn)物產(chǎn)量高出4. 93倍。
[0042] 根據(jù)實施例1的質(zhì)譜方法確認(rèn)產(chǎn)物為德谷胰島素。
[0043] 實施例4 加入Zn2+離子制備德谷胰島素（Zn 2+與胰島素摩爾比為4:1)。
[0044] 按照實施例1的方法將des(B30)人胰島素和叔丁基十六烷二酰 基-Glu (OSu) -OtBu進行偶聯(lián)反應(yīng)。
[0045] 偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用HC1將pH調(diào)節(jié)至6-7,再加入2 ml ZnCl2水溶液 (ZnCl^度為24 mg/mL，Zn 2+與胰島素摩爾比為4:1)沉淀，通過離心收集沉淀，凍干，得德 谷胰島素前體粗品573 mg。將離心后的上清液進行色譜分析，通過外標(biāo)法測得上清液中殘 留德谷胰島素前體〇. 07 mg。與對照例實施例1相比，殘留在上清液中的德谷胰島素前體的 損失量為對照例的0.04% (0.07 mg/170. 7 mg)。
[0046] 將上述德谷胰島素前體按照實施例1的方法進行脫保護反應(yīng)，得德谷胰島素粗產(chǎn) 物606 mg。與對照例實施例1相比，粗產(chǎn)物產(chǎn)量高出4. 97倍。
[0047] 根據(jù)實施例1的質(zhì)譜方法確認(rèn)產(chǎn)物為德谷胰島素。
[0048] 將上述德谷胰島素粗產(chǎn)物通過用C8-柱進行RP-HPLC純化，凍干，得到德谷胰島 素純品267 mg，純品收率為50%。通過HPLC評估的純度為99. 8%。鋅在反應(yīng)完成后通過層 析純化除去。按照此方法制備的德谷胰島素純品產(chǎn)率，比專利200480021733. 8的實施例4 (64 mg，收率為 12%)中的產(chǎn)率高出 4. 17 倍（267mg/64mg=4. 17)。
[0049] 實施例5 加入Zn2+離子制備德谷胰島素（Zn 2+與胰島素摩爾比為8:1)。
[0050] 按照實施例1的方法將des(B30)人胰島素和叔丁基十六烷二酰 基-Glu (OSu) -OtBu進行偶聯(lián)反應(yīng)。
[0051] 偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用HC1將pH調(diào)節(jié)至6-7,再加入2 ml ZnCl2水溶液 (ZnCl^度為48 mg/mL，Zn 2+與胰島素摩爾比為8:1)沉淀，通過離心收集沉淀，凍干，得德 谷胰島素前體粗品608 mg。將離心后的上清液進行色譜分析，檢測不到上清液中有德谷胰 島素前體殘留。與對照例實施例1相比，殘留在上清液中的德谷胰島素前體的損失量降為 基本為0。
[0052] 將上述德谷胰島素前體按照實施例1的方法進行脫保護反應(yīng)，得德谷胰島素粗產(chǎn) 物607 mg。與對照例實施例1相比，粗產(chǎn)物產(chǎn)量高出4. 98倍。
[0053] 根據(jù)實施例1的質(zhì)譜方法確認(rèn)產(chǎn)物為德谷胰島素。
[0054] 實施例6 加入Co2+離子制備德谷胰島素（Co 2+與胰島素摩爾比為4:1)。
[0055] 按照實施例1的方法將des(B30)人胰島素和叔丁基十六烷二酰 基-Glu (OSu) -OtBu進行偶聯(lián)反應(yīng)。
[0056] 偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用HC1將pH調(diào)節(jié)至6-7,再加入2 ml檸檬酸鈷水溶液 (二水檸檬酸鈷的濃度為104. 1 mg/mL，Co2+與胰島素摩爾比為4:1)沉淀，通過離心收集沉 淀，凍干，得德谷胰島素前體粗品571 mg。將離心后的上清液進行色譜分析，通過外標(biāo)法測 得上清液中殘留德谷胰島素前體6. 53 mg。與對照例實施例1相比，殘留在上清液中的德谷 胰島素前體的損失量為對照例的3. 8% (6. 53 mg/170. 7 mg)。
[0057] 將上述德谷胰島素前體按照實施例1的方法進行脫保護反應(yīng)，得德谷胰島素粗產(chǎn) 物604 mg。與對照例實施例1相比，粗產(chǎn)物產(chǎn)量高出4. 95倍。
[0058] 根據(jù)實施例1的質(zhì)譜方法確認(rèn)產(chǎn)物為德谷胰島素。
[0059] 實施例7 加入Cu2+離子制備德谷胰島素（Cu 2+與胰島素摩爾比為4:1)。
[0060] 按照實施例1的方法將des(B30)人胰島素和叔丁基十六烷二酰 基-Glu (OSu) -OtBu進行偶聯(lián)反應(yīng)。
[0061] 偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用HC1將pH調(diào)節(jié)至6-7,再加入2 ml CuCl2水溶液 (&1(：12的濃度為23. 7 mg/mL，Cu2+與胰島素摩爾比為4:1)沉淀，通過離心收集沉淀，凍干， 得德谷胰島素前體粗品582mg。將離心后的上清液進行色譜分析，通過外標(biāo)法測得上清液中 殘留德谷胰島素前體2. 05 mg。與對照例實施例1相比，殘留在上清液中的德谷胰島素前體 的損失量為對照例的1. 2% (2. 05 mg/170. 7 mg)。
[0062] 將上述德谷胰島素前體按照實施例1的方法進行脫保護反應(yīng)，得德谷胰島素粗產(chǎn) 物611 mg。與對照例實施例1相比，粗產(chǎn)物產(chǎn)量高出5. 01倍。
[0063] 根據(jù)實施例1的質(zhì)譜方法確認(rèn)產(chǎn)物為德谷胰島素。
[0064] 實施例8 加入Ni2+離子制備德谷胰島素（Ni 2+與胰島素摩爾比為4:1)。
[0065] 按照實施例1的方法將des(B30)人胰島素和叔丁基十六烷二酰 基-Glu (OSu) -OtBu進行偶聯(lián)反應(yīng)。
[0066] 偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用HC1將pH調(diào)節(jié)至6-7,再加入2 ml NiCl2水溶液 (NiCl2 *6H20的濃度為41. 8 mg/mL，Ni2+與胰島素摩爾比為4:1)沉淀，通過離心收集沉淀， 凍干，得德谷胰島素前體粗品572mg。將離心后的上清液進行色譜分析，通過外標(biāo)法測得上 清液中殘留德谷胰島素前體〇. 23 mg。與對照例實施例1相比，殘留在上清液中的德谷胰島 素前體的損失量為對照例的〇. 13% (0. 23 mg/170. 7 mg)。
[0067] 將上述德谷胰島素前體按照實施例1的方法進行脫保護反應(yīng)，得德谷胰島素粗產(chǎn) 物605 mg。與對照例實施例1相比，粗產(chǎn)物產(chǎn)量高出4. 96倍。
[0068] 根據(jù)實施例1的質(zhì)譜方法確認(rèn)產(chǎn)物為德谷胰島素。
[0069] 實施例9 加入Fe3+離子制備德谷胰島素（Fe 3+與胰島素摩爾比為4:1)。
[0070] 按照實施例1的方法將des(B30)人胰島素和叔丁基十六烷二酰 基-Glu (OSu) -OtBu進行偶聯(lián)反應(yīng)。
[0071] 偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用HC1將pH調(diào)節(jié)至6-7,再加入2 ml FeCl3水溶液 (FeCl3&濃度為28. 6 mg/mL，F(xiàn)e 3+與胰島素摩爾比為4:1)沉淀，通過離心收集沉淀，凍干， 得德谷胰島素前體粗品574 mg。將離心后的上清液進行色譜分析，通過外標(biāo)法測得上清液 中殘留德谷胰島素前體4. 64 mg。與對照例實施例1相比，殘留在上清液中的德谷胰島素前 體的損失量為對照例的2. 7% (4.64 mg/170. 7 mg)。
[0072] 將上述德谷胰島素前體按照實施例1的方法進行脫保護反應(yīng)，得德谷胰島素粗產(chǎn) 物606 mg。與對照例實施例1相比，粗產(chǎn)物產(chǎn)量高出4. 97倍。
[0073] 根據(jù)實施例1的質(zhì)譜方法確認(rèn)產(chǎn)物為德谷胰島素。
[0074] 實施例10 加入Zn2+離子制備地特胰島素（Zn 2+與胰島素摩爾比為4:1)。
[0075] 原料Des(B30)_人胰島素根據(jù)中國專利94193852. 2實施例11中所述方法制備。
[0076] 原料肉豆蘧酸N-羥基琥珀酰亞胺酯可以商購，也可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所公 知的方法，以肉豆蘧酸和N-羥基琥珀酰亞胺為原料制備獲得。
[0077] 在 10-15°C下將 des(B30)人胰島素（500 mg，0. 088 mmol)加入至 137. 5ml 的 50 mM/L NaHC03的乙腈/水混合溶液中（乙腈：水=1:1)，再加入3. 0 mL 5% Na 2C03(W/V)水溶 液調(diào)節(jié)溶液至澄清（pH=10_ll)。另將肉豆蘧酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（57 mg，0. 176 mmol) 溶于5ml乙腈中，隨后在10-15°C加入到上述des(B30)人胰島素溶液中進行偶聯(lián)反應(yīng)，反 應(yīng)1小時。
[0078] 偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液等體積均分為兩份。
[0079] 其中一份用HC1將pH調(diào)節(jié)至6-7,離心收集沉淀，凍干，得地特胰島素粗品66 mg。 將離心后的上清液進行色譜分析，通過外標(biāo)法測得上清液中殘留地特胰島素135. 1 mg。
[0080] 另一份用HC1將pH調(diào)節(jié)至6-7,再加入1 ml ZnClyjC溶液（ZnCl 2濃度為24 mg/ mL，Zn2+與胰島素摩爾比為4:1)沉淀，通過離心收集沉淀，凍干，得地特胰島素粗品263 mg。 將離心后的上清液進行色譜分析，檢測不到上清液中有地特胰島素殘留。
[0081 ] 與未加金屬離子的方法相比，殘留在上清液中的地特胰島素的損失量降為基本為 0,地特胰島素粗產(chǎn)物產(chǎn)量高出3. 98倍（263 mg/66 mg)。
[0082] 通過質(zhì)譜測得分子量為5915. 6,計算值為5916. 9。
[0083] 將上述第二份地特胰島素粗產(chǎn)物用C8-柱進行RP-HPLC純化，凍干，得地特胰島 素純品155 mg，純品收率為60%。通過HPLC評估的純度為99. 8%。鋅在反應(yīng)完成后通過層 析純化除去。
[0084] 實施例11 加入Zn2+離子制備A1位連接修飾基團的胰島素衍生物（A1修飾胰 島素)。
[0085] Des(B30)-人胰島素根據(jù)中國專利94193852. 2實施例11中所述方法制備，然后根 據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法，對Des (B30)-人胰島素的B29位氨基酸進行Boc保護。
[0086] 原料肉豆蘧酸N-羥基琥珀酰亞胺酯可以商購，也可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所公 知的方法，以肉豆蘧酸和N-羥基琥珀酰亞胺為原料制備獲得。
[0087] 在 10-15°C下將 B29 位被 Boc 保護的 des(B30)人胰島素（500 mg，0. 086 mmol) 加入至137. 5ml的50 mM/L NaHC03的乙腈/水混合溶液中（乙腈：水=1:1)，再加入3. 0 ml 5% Na2C03 (W/V)水溶液調(diào)節(jié)溶液至澄清（pH=10-ll)。另將肉豆蘧酸N-羥基琥珀酰亞 胺酯（56 mg, 0. 172 mmol)溶于5ml乙腈中，隨后在10-15°C加入到上述胰島素溶液中進行 偶聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)1小時。
[0088] 偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液等體積均分為兩份。
[0089] 其中一份用HC1將pH調(diào)節(jié)至6-7,離心收集沉淀，凍干，得A1修飾胰島素前體粗 品71 mg。將離心后的上清液進行色譜分析，通過外標(biāo)法測得上清液中殘留A1修飾胰島素 前體119 mg。
[0090] 另一份用HC1將pH調(diào)節(jié)至6-7,再加入1 ml ZnClyjC溶液（ZnCl 2濃度為24 mg/ mL，Zn2+與胰島素摩爾比為4:1)沉淀，通過離心收集沉淀，凍干，得A1修飾胰島素前體粗品 262 mg。將離心后的上清液進行色譜分析，通過外標(biāo)法測得上清液中殘留A1修飾胰島素前 體 3. 4 mg〇
[0091] 與未加金屬離子的方法相比，殘留在上清液中的A1修飾胰島素前體的損失量降 為對照例的2. 8% (3. 4 mg/119 mg)，A1修飾胰島素前體粗產(chǎn)物的產(chǎn)量高出3. 69倍（262 mg/71 mg)〇
[0092] 通過質(zhì)譜測得分子量為6015. 8,計算值為6016. 9。
[0093] 本實施例省略脫保護反應(yīng)步驟，直接對A1修飾胰島素前體進行后處理，得到A1修 飾胰島素前體的純品：將上述第二份A1修飾胰島素前體的粗產(chǎn)物用C8-柱進行RP-HPLC 純化，凍干，得A1修飾胰島素前體純品115 mg，純品收率為44. 4%。通過HPLC評估的純度 為99.8%。鋅在反應(yīng)完成后通過層析純化除去。
[0094] 實施例1-11的制備方法所得產(chǎn)品的數(shù)據(jù)對比統(tǒng)計見下表1。
[0095] 表1實施例1-11的產(chǎn)品數(shù)據(jù)對比統(tǒng)計：
【主權(quán)項】
1. 一種胰島素衍生物的制備方法，所述方法包括在胰島素部分與修飾基團部分的偶聯(lián) 反應(yīng)完成后，在反應(yīng)液中加入二價或三價金屬離子的步驟。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，包括以下步驟： (1) 分別獲得胰島素衍生物的胰島素部分和修飾基團部分； (2) 將胰島素部分與修飾基團部分進行偶聯(lián)反應(yīng)； (3) 在步驟2的偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液的pH值調(diào)節(jié)至反應(yīng)產(chǎn)物的等電點附近； (4) 在步驟3的反應(yīng)液中加入二價或三價金屬離子； (5) 收集步驟4獲得的沉淀。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其中所述步驟4獲得的沉淀為胰島素衍生物粗品。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，包括以下步驟： (1) 分別獲得胰島素衍生物的胰島素部分和修飾基團部分，其中所述胰島素部分和/ 或修飾基團部分帶有一個或多個保護基團； (2) 將胰島素部分與修飾基團部分進行偶聯(lián)反應(yīng)； (3) 在步驟2的偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液的pH值調(diào)節(jié)至反應(yīng)產(chǎn)物的等電點附近； (4) 在步驟3的反應(yīng)液中加入二價或三價金屬離子； (5) 收集步驟4獲得的沉淀； (6) 對步驟5獲得的沉淀進行脫保護反應(yīng)，得到胰島素衍生物粗品。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的制備方法，還進一步包括在得到胰島素衍生物粗品 后，對胰島素衍生物粗品進行后處理，得到胰島素衍生物純品的步驟。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的制備方法，其中所述二價或三價金屬離子選自Cu2+、 Co2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+、Fe 2+、Sr2+、Sn2+、Fe3+或 A1 3+。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的制備方法，其中所述二價或三價金屬離子與胰島素 部分的摩爾比為〇. 1-10:1。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其中所述二價或三價金屬離子與胰島素部分的摩 爾比為 0.8:1、2:1、4:1 或 8:1。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的制備方法，其中所述胰島素衍生物選自B29?；?島素及其類似物，或A1?；葝u素及其類似物。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其中所述胰島素衍生物選自德谷胰島素或地特 胰島素。
【文檔編號】C07K14/62GK105820233SQ201510000301
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年1月4日
【發(fā)明人】董長青, 張寧, 張一寧, 孫海瑜, 邵東, 王曉霞, 韓杰麗, 張愫華, 蔡蓮芝, 王沖
【申請人】甘李藥業(yè)股份有限公司