一種油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法，包括如下在步驟：(1)將螺旋藻采用反復(fù)凍融的方法破壁后收集上層清液得到藻藍(lán)蛋白粗提液，(2)再向粗提液中加入油酸聚乙二醇酯和無機(jī)鹽，經(jīng)雙水相萃取后分層，(3)取上相置于截留相對(duì)分子質(zhì)量為5000的透析膜中透析20～30小時(shí)后得藻藍(lán)蛋白水溶液，再于?15～?10℃冷凍干燥8～15小時(shí)得藻藍(lán)蛋白粉末，其中油酸聚乙二醇酯中的PEG平均分子量為1000或2000。本發(fā)明對(duì)藻藍(lán)蛋白的選擇性高，分相容易且速度快，分配系數(shù)高，用設(shè)備常規(guī)，操作簡(jiǎn)便，分離效率高。藻藍(lán)蛋白產(chǎn)品中純度高，回收率91.2％以上。
【專利說明】
一種油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生化分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相萃 取分離藻藍(lán)蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藻藍(lán)蛋白（簡(jiǎn)稱PC)為自然界少見的色素蛋白之一，其色彩亮麗(天藍(lán)色），水溶性 良好，富含人類體內(nèi)所需的八種必需的氨基酸，自身帶有熒光，具有抗輻射、抗氧化、抗腫瘤 以及無毒副作用等優(yōu)勢(shì)，因此在化妝品、食品、染料、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛的關(guān)注與應(yīng)用。螺 旋藻是一種富含蛋白質(zhì)、維生素、必需氨基酸、礦物質(zhì)和必需脂肪酸的絲狀微藻，細(xì)胞壁有 多糖類物質(zhì)構(gòu)成，易于消化吸收，PC在螺旋藻中主要以藻膽蛋白體的形式存在，其在螺旋藻 中的含量高達(dá)10~20%，因此研究螺旋藻中藻藍(lán)蛋白的分離提純具有重大的醫(yī)用和經(jīng)濟(jì)價(jià) 值。
[0003] 藻藍(lán)蛋白傳統(tǒng)分離純化方法包括：（1)破碎細(xì)胞，制備藻藍(lán)蛋白粗提液；（2)應(yīng)用傳 統(tǒng)的分離技術(shù)純化藻藍(lán)蛋白，如離心、硫酸銨沉淀、離子交換層析、凝膠過濾層析、羥基磷灰 石層析等。這些方法耗時(shí)、復(fù)雜，難以大規(guī)模制備藻藍(lán)蛋白。雙水相萃取技術(shù)近年來愈來愈 得到研究者的青睞，其相對(duì)傳統(tǒng)的分離純化技術(shù)具有提純效率高、設(shè)備常規(guī)、操作簡(jiǎn)便，適 于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，且不存在有機(jī)溶劑的殘留問題，易于放大和連續(xù)操作，各種參數(shù)可按 比例放大而產(chǎn)物收率并不降低。雙水相萃取是利用組分在兩個(gè)互不相溶的水相中的溶解度 不同而達(dá)到分離的萃取技術(shù)。雙水相萃取中使用的雙水相是由兩種互不相溶的高分子溶液 或者互不相溶的鹽溶液和高分子溶液組成。在PC的雙水相萃取分離技術(shù)中，聚合物/鹽系統(tǒng) 的分離效果明顯優(yōu)于聚合物/聚合物系統(tǒng)，且聚合物/鹽系統(tǒng)的分相時(shí)間短，體系成本低。
[0004] 中國(guó)專利CN 102993297A將螺旋藻粉懸濁液經(jīng)細(xì)胞破碎后，再經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析 得到藻藍(lán)蛋白粗提液1，加入PEG20000-NaCl進(jìn)一步沉淀出高純度的藻藍(lán)蛋白粗提物，將粗 提物采用磷酸鹽緩沖液溶解后得藻藍(lán)蛋白粗提液2,再將粗提液2經(jīng)PEG20000/Na2S04雙水 相體系萃取，萃取后的下相經(jīng)透析除鹽得藻藍(lán)蛋白精提液，再冷凍干燥得藻藍(lán)蛋白成品。該 法操作在步驟繁多，所用PEG20000成本較高，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。王巍杰(雙水相萃取藻藍(lán) 蛋白的研究，食品工程?技術(shù)，2015，92-95)將螺旋藻細(xì)胞破碎所得粗提液采用PEG/酒石酸 甲鈉雙水相體系分離純化藻藍(lán)蛋白，藻藍(lán)蛋白粗提液加入雙水相體系后，于漩渦混勻器上 混合3min，靜置30min，在2000r/min條件下離心lmin，加速系統(tǒng)分相，并向體系中加入中性 鹽KC1增加藻藍(lán)蛋白的分配系數(shù)和收率。該方法所采用雙水相體系分相困難，分相時(shí)間較 長(zhǎng)，需要采用離心設(shè)備加速分相，增加了操作難度和經(jīng)濟(jì)成本。因此，開發(fā)一種在步驟簡(jiǎn)單， 設(shè)備常規(guī)，分離效果好，分離效率高的雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白方法是亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種雙水相體系分相容易且速度快，分配系數(shù)高的油酸聚乙二醇 酯/無機(jī)鹽雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法。
[0006] 本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:本發(fā)明的一種油酸聚乙二醇酯/無機(jī) 鹽雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法，包括如下在步驟：
[0007] (1)反復(fù)凍融破壁:將螺旋藻粉加入水中浸泡6~8小時(shí)后，于-20°c下冷凍2~5小 時(shí)后，再于25°C融化，如此反復(fù)凍融3~4次破壁，再將所得溶液離心處理，收集上清液即為 含藻藍(lán)蛋白的粗提液，通過冷凍使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)形成冰晶對(duì)細(xì)胞 壁造成機(jī)械破裂，從而使得胞內(nèi)藻藍(lán)蛋白析出，并溶于水中，再通過離心去除不溶物得到含 澡監(jiān)蛋白的粗提液。
[0008] (2)雙水相萃?。合蛟诓襟E(1)所得含藻藍(lán)蛋白的粗提液中加入油酸聚乙二醇酯和 無機(jī)鹽，震蕩混合后，靜置8~15分鐘，收集上相，所述油酸聚乙二醇酯中聚乙二醇PEG的平 均分子量為1000或2000。
[0009] 雙水相萃取體系由互不相溶的油酸聚乙二醇酯和無機(jī)鹽構(gòu)成，利用藻藍(lán)蛋白在油 酸聚乙二醇酯和無機(jī)鹽中的選擇性分配，使其與粗提液中其他雜質(zhì)分離（多糖和其他蛋白 質(zhì)），從而達(dá)到分離純化的目的。雙水相體系中兩相的極性差為分相速度的重要影響因素， 低分子量的PEG有利于藻藍(lán)蛋白分配系數(shù)的增加，但是雙水相系統(tǒng)對(duì)藻藍(lán)蛋白的選擇性會(huì) 降低，同時(shí)低分子量的PEG與無機(jī)鹽的極性差較低，因此導(dǎo)致體系分相困難，分相速度較慢； 高分子量的PEG雖與無機(jī)鹽的極性差較高，體系分相速度快，但隨著PEG平均分子量的增大， 體系粘度增大，成相物質(zhì)分子間的自由體積減小，空間位阻作用增強(qiáng)，阻礙PC分子進(jìn)入PEG 相。平均分子量為1000或2000的PEG所構(gòu)成的雙水相對(duì)藻藍(lán)蛋白的選擇性較好，采用油酸酯 化改性PEG的部分端羥基，獲得部分支化的PEG，使其在具有水溶性的同時(shí)，增大與無機(jī)鹽的 極性差，從而加快分相速度，不用離心即可成功分相，降低了操作難度，增加了純化效率。
[0010] (3)成品制備:將在步驟(2)所得上相在截留相對(duì)分子質(zhì)量為5000的透析膜中透析 20~30小時(shí)后得藻藍(lán)蛋白水溶液，再于-15~-10°C冷凍干燥8~15小時(shí)得藻藍(lán)蛋白粉末。
[0011] 進(jìn)一步地，在步驟(1)中，螺旋藻粉與水的質(zhì)量比為1:80~150。
[0012] 進(jìn)一步地，在步驟(2)中，無機(jī)鹽為硫酸銨、硫酸鈉或硫酸鎂中的任意一種。
[0013] 更進(jìn)一步地，，在步驟（2)中，油酸聚乙二醇酯質(zhì)量為雙水相體系總質(zhì)量的15~ 20%，無機(jī)鹽質(zhì)量為雙水相體系總質(zhì)量的8~12%，含藻藍(lán)蛋白的粗提液的質(zhì)量為雙水相體 系總質(zhì)量的68~77%。不同濃度組成的雙水相體系萃取效果不同，油酸聚乙二醇酯濃度過 低，分相困難;隨著油酸聚乙二醇酯濃度在一定范圍內(nèi)的增加，雙水相體系兩相差別較大， 利于藻藍(lán)蛋白在上相中富集，多糖在下相中富集，但是隨著油酸聚乙二醇酯濃度繼續(xù)增大， 更多的雜蛋白進(jìn)入上相，使上相中藻藍(lán)蛋白的純度降低。隨著無機(jī)鹽濃度在一定范圍內(nèi)的 提高，物質(zhì)在兩相中界面張力增大，有利于藻藍(lán)蛋白在上相富集，多糖在下相富集；當(dāng)無機(jī) 鹽濃度更大時(shí)，上相體積逐漸減小，同時(shí)粘度逐漸增大，不利于藻藍(lán)蛋白在上相的富集。 [0014]作為優(yōu)選，在步驟（2)中，油酸聚乙二醇酯的制備方法為：將油酸、聚乙二醇和 S0 427Zr02固體超強(qiáng)酸催化劑混合均勻后，于100~130°C下反應(yīng)，反應(yīng)過程中不斷除去生成 的水，直至反應(yīng)液呈中性，停止反應(yīng)，冷卻至常溫后，過濾，濾液蒸餾去除水分后即得油酸聚 乙二醇酯。
[0015] 進(jìn)一步地，所述聚乙二醇為聚乙二醇1000或聚乙二醇2000中的任意一種。
[0016]進(jìn)一步地，所述油酸與聚乙二醇的的質(zhì)量比為1:8~10,所述固體超強(qiáng)酸催化劑的 質(zhì)量為聚乙二醇質(zhì)量的0.05~0.12%。油酸與PEG的摩爾比決定了PEG的支化程度，支化程 度過高則油酸聚乙二醇酯的水溶性下降;支化程度過低則不足以改善雙水相體系的分相速 度。支化程度要保證油酸聚乙二醇酯的水溶性適宜。
[0017] 有益效果:本發(fā)明對(duì)藻藍(lán)蛋白的選擇性高，體系分相容易且速度快，分配系數(shù)高， 用設(shè)備常規(guī)，操作簡(jiǎn)便，分離效率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0019] (1)本發(fā)明選用的油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相體系對(duì)藻藍(lán)蛋白的選擇性高，體 系分相速度快，不需借助離心機(jī)等設(shè)備即可快速分相，且不需額外加入中性鹽以提高藻藍(lán) 蛋白回收率。
[0020] (2)采用本發(fā)明所述方法制得藻藍(lán)蛋白產(chǎn)品中藻藍(lán)蛋白純度高達(dá)(A620/A280) 3.68,回收率高達(dá)91.2%。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ]下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0022] 實(shí)施例1
[0023]本發(fā)明的一種油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法，包括如 下在步驟：
[0024] (1)油酸聚乙二醇酯的制備
[0025]將10g油酸、lOOgPEG 1000和0.12g S〇42-/Zr02固體超強(qiáng)酸催化劑置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 中，混合均勻后，于100°C下反應(yīng)，并減壓分水，PH試紙檢測(cè)反應(yīng)液呈中性后，停止反應(yīng)，冷卻 至常溫后，過濾，濾液蒸餾去除水分后即得油酸聚乙二醇酯105.23g，F(xiàn)T-IR數(shù)據(jù)分析為 3455cm- 1(羥基吸收峰），290cm-hdSSgcm-1(甲基、亞甲基吸收峰），1248cm-1(烯基酯吸收 峰hlOSOcnf 1 (伯醇吸收峰(長(zhǎng)鏈亞甲基吸收峰），確定所制得物質(zhì)為油酸聚乙二 醇酯，且只有部分端羥基被酯化。
[0026] (2)反復(fù)凍融破壁
[0027] 將lg螺旋藻粉加入100g去離子水中浸泡6小時(shí)后，于_20°C下冷凍3小時(shí)，再于25°C 融化，如此反復(fù)凍融3次破壁，再將所得溶液離心處理后，收集上清液即為含藻藍(lán)蛋白的粗 提液，測(cè)得藻藍(lán)蛋白純度(A620/A280)為0.78。
[0028] (3)雙水相萃取
[0029]取38.5g含藻藍(lán)蛋白的粗提液、7.5g油酸聚乙二醇酯和4g硫酸銨加入分液漏斗中， 震蕩混合后，靜置10分鐘后分相，收集上相，將上相置于截留相對(duì)分子質(zhì)量為5000的透析膜 中透析20小時(shí)后得藻藍(lán)蛋白水溶液，再于-15°C冷凍干燥10小時(shí)得藻藍(lán)蛋白粉末，其中藻藍(lán) 蛋白的純度為3.68,回收率為91.2%。
[0030] 實(shí)施例2
[0031] 實(shí)施例2與實(shí)施例1的區(qū)別在于:本發(fā)明的一種油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相萃 取分離藻藍(lán)蛋白的方法，包括如下在步驟：
[0032] (1)油酸聚乙二醇酯的制備
[0033] 將10g油酸、80gPEG 2000和0.08g S〇42-/Zr02固體超強(qiáng)酸催化劑置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 中，混合均勻后，于110°c下反應(yīng)，并減壓分水，PH試紙檢測(cè)反應(yīng)液呈中性后，停止反應(yīng)，冷卻 至常溫后，過濾，濾液蒸餾去除水分后即得油酸聚乙二醇酯82.69g。
[0034] (2)反復(fù)凍融破壁
[0035] 將lg螺旋藻粉加入80g去離子水中浸泡8小時(shí)后，于-15°C下冷凍2小時(shí)，再于25°C 融化，如此反復(fù)凍融4次破壁，再將所得溶液離心處理后，收集上清液即為含藻藍(lán)蛋白的粗 提液，測(cè)得藻藍(lán)蛋白純度(A620/A280)為0.75。
[0036] (3)雙水相萃取
[0037]取36g含藻藍(lán)蛋白的粗提液、9g油酸聚乙二醇酯和5g硫酸鈉加入分液漏斗中，震蕩 混合后，靜置8分鐘后分相，收集上相，將上相置于截留相對(duì)分子質(zhì)量為5000的透析膜中透 析25小時(shí)后得藻藍(lán)蛋白水溶液，再于-10°C冷凍干燥8小時(shí)得藻藍(lán)蛋白粉末，其中藻藍(lán)蛋白 的純度為3.62，回收率為88.3 %。
[0038] 實(shí)施例3
[0039] 實(shí)施例3與實(shí)施例1的區(qū)別在于:本發(fā)明的一種油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相萃 取分離藻藍(lán)蛋白的方法，包括如下在步驟：
[0040] (1)油酸聚乙二醇酯的制備
[0041 ] 將l〇g油酸、90gPEG 1000和0.045g S〇42-/Zr〇2固體超強(qiáng)酸催化劑置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 中，混合均勻后，于130°C下反應(yīng)，并減壓分水，PH試紙檢測(cè)反應(yīng)液呈中性后，停止反應(yīng)，冷卻 至常溫后，過濾，濾液蒸餾去除水分后即得油酸聚乙二醇酯92.33g。
[0042] (2)反復(fù)凍融破壁
[0043] 將lg螺旋藻粉加入150g去離子水中浸泡7小時(shí)后，于-18°C下冷凍5小時(shí)，再于25°C 融化，如此反復(fù)凍融3次破壁，再將所得溶液離心處理后，收集上清液即為含藻藍(lán)蛋白的粗 提液，測(cè)得藻藍(lán)蛋白純度(A620/A280)為0.73。
[0044] (3)雙水相萃取
[0045]取34g含藻藍(lán)蛋白的粗提液、10g油酸聚乙二醇酯和6g硫酸鎂加入分液漏斗中，震 蕩混合后，靜置15分鐘后分相，收集上相，將上相置于截留相對(duì)分子質(zhì)量為5000的透析膜中 透析30小時(shí)后得藻藍(lán)蛋白水溶液，再于_12°C冷凍干燥15小時(shí)得藻藍(lán)蛋白粉末，其中藻藍(lán)蛋 白的純度為3.53，回收率為86.7 %。
[0046] 對(duì)比例1
[0047] 將lg螺旋藻粉加入100g去離子水中浸泡6小時(shí)后，于_20°C下冷凍3小時(shí)，再于25°C 融化，如此反復(fù)凍融3次破壁，再將所得溶液離心處理后，收集上清液即為含藻藍(lán)蛋白的粗 提液，測(cè)得藻藍(lán)蛋白純度(A620/A280)為0.78。取38.5g含藻藍(lán)蛋白的粗提液、7.5g PEG1000 和4g硫酸銨加入分液漏斗中，震蕩混合后，靜置1小時(shí)后溶液不分層。
[0048] 對(duì)比例2-5
[0049] 與對(duì)比例1的操作方法相同，所用物質(zhì)比例相同，不同的是PEG平均分子量，所得實(shí) 驗(yàn)結(jié)果見表1:
[0050] 表 1
[0052] 通過對(duì)比對(duì)比例1-5和實(shí)施例1，可以發(fā)現(xiàn):PEG1000和PEG2000經(jīng)油酸酯化改性后， 更有利于體系分相，且所得藻藍(lán)蛋白的純度和回收率更高。
[0053]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，本發(fā)明 要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書、說明書及其等效物界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法，其特征在于包括如 下在步驟： (1) 反復(fù)凍融破壁:將螺旋藻粉加入水中浸泡6~8小時(shí)后，于-20°c下冷凍2~5小時(shí)后， 再于25°C融化，如此反復(fù)凍融3~4次破壁，再將所得溶液離心處理，收集上清液即為含藻藍(lán) 蛋白的粗提液； (2) 雙水相萃?。合蛟诓襟E（1)所得含藻藍(lán)蛋白的粗提液中加入油酸聚乙二醇酯和無機(jī) 鹽，震蕩混合后，靜置8~15分鐘，收集上相； (3) 成品制備:將在步驟(2)所得上相在截留相對(duì)分子質(zhì)量為5000的透析膜中透析20~ 30小時(shí)后得藻藍(lán)蛋白水溶液，再于-15~-10°C冷凍干燥8~15小時(shí)得藻藍(lán)蛋白粉末。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法，其 特征在于:在步驟(1)中，所述螺旋藻粉與水的質(zhì)量比為1:80~150。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法，其 特征在于:在步驟(2)中，所述無機(jī)鹽為硫酸銨、硫酸鈉或硫酸鎂中的任意一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法，其 特征在于:在步驟(2)中，所述油酸聚乙二醇酯中的聚乙二醇平均分子量為1000或2000。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方 法，其特征在于:在步驟(2)中，所述油酸聚乙二醇酯質(zhì)量為雙水相體系總質(zhì)量的15~20%， 無機(jī)鹽質(zhì)量為雙水相體系總質(zhì)量的8~12%，含藻藍(lán)蛋白的粗提液的質(zhì)量為雙水相體系總 質(zhì)量的68~77%。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法，其 特征在于：在步驟（2)中，所述油酸聚乙二醇酯的制備方法為：將油酸、聚乙二醇和S0 427 Zr02固體超強(qiáng)酸催化劑混合均勻后，于100~130°C下反應(yīng)，反應(yīng)過程中不斷除去生成的水， 直至反應(yīng)液呈中性，停止反應(yīng)，冷卻至常溫后，過濾，濾液蒸餾去除水分后即得油酸聚乙二 醇酯。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法，其 特征在于:所述聚乙二醇為聚乙二醇1000或聚乙二醇2000中的任意一種。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的油酸聚乙二醇酯/無機(jī)鹽雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法，其 特征在于:所述油酸與聚乙二醇的質(zhì)量比為1:8~10,所述固體超強(qiáng)酸催化劑的質(zhì)量為聚乙 二醇質(zhì)量的0.05~0.12%。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK105820236SQ201610239712
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年4月18日
【發(fā)明人】高志剛, 汪世軍, 王峰
【申請(qǐng)人】東臺(tái)市賜百年生物工程有限公司