一種篩選pd-1抗體的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種篩選PD?1抗體的方法，所述方法包括：將人PD?1和PD?L1全長基因分別構建到慢病毒表達載體中；然后分別轉染到T和B淋巴細胞株；篩選出穩(wěn)定表達的淋巴細胞；隨后加入PD?1單克隆抗體和T細胞超抗原SEE共同孵育48小時；最后根據(jù)上清中IL?2含量的高低篩選所需的PD?1單克隆抗體。本發(fā)明方法與SEB刺激全血分泌IL?2的實驗相比，在重復性和精確度方面更加優(yōu)越，并且顯著降低了實驗成本，減少了操作人血液帶來的各種潛在風險。
【專利說明】
一種篩選PD-1抗體的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種篩選抗體的方法，具體涉及一種篩選ro-i抗體的方法。
【背景技術】
[0002] T細胞的活化啟動和效應發(fā)揮的過程中至少需要兩種信號存在，第一種信號是抗 原特異性的，由主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex，MHC)以及 與其結合的抗原肽被T細胞受體（T cell receptor，TCR)識別并結合后，由TCR復合物向 T細胞內傳導激活信號；第二種激活信號是抗原非特異性的，是由抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC)和T細胞上多種輔助分子之間的配對和相互作用而提供的，能夠提 供第二種激活信號的一類T細胞膜蛋白又被稱為共刺激分子，其中CD28是一種表達在T細 胞表面的重要共刺激分子，在T細胞活化中發(fā)揮重要作用。當TCR與MHC-抗原肽復合物 結合后，如果共刺激分子缺乏，將導致T細胞對特異的抗原表現(xiàn)為無能狀態(tài)，不僅不能被激 活，而且對抗原特異性的活化信號均不應答；如果共刺激分子如CD28與B7分子結合并激活 后，可在多個水平上介導T細胞的活化?；罨腡細胞可以自分泌和旁分泌的形式產生白細 胞介素2 (interleukin 2 ;IL-2)，作用于細胞表面的受體IL2R，進一步刺激T細胞的增殖， 從而為發(fā)揮效應功能做好準備。
[0003] PD-1 (⑶279)是由288個氨基酸組成的免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白， 最初是從凋亡的小鼠T細胞雜交瘤中克隆，被認為與細胞凋亡相關而命名為程序性死 亡-1 (programmed death-1，ro-1)。ro-1是在活化的B細胞、T細胞和髓樣細胞上表達的 CD28家族的抑制性成員（Okazaki 等（2002)Curr Opin Immunol 14:391779-82 ;Bennett等 (2003) J Immunol 170:711-8)，該家族還包括CD28、CTLA-4、IC0S和 BTLA等。PD-1 在活化的 B 細胞、T 細胞和髓樣細胞上表達（Okazaki 等（2002) Curr. Opin. Tmmunol. 14:391779-82 ; Bennett等（2003)J Immunol 170:711-8)。ro-1含有接近膜的免疫受體酪氨酸抑制 基序（IHM)和遠離膜的基于酪氨酸的轉換基序（ITSM) (Thomas，M. L. (1995) J Exp Medl81:1953-6 ;Vivier，E 和 Daeron，M(1997) Immunol Todayl8:286-91)。雖然與 CTLA-4 結構類似，但ro-1蛋白因缺乏介導CD28/CTLA-4與B7-1/B7-2相結合的MYPPPY序列，以及 介導IC0S與IC0S-L相結合的FDPPPF序列，因而在結構上與CD28、CTLA-4及IC0S存在明 顯差異。因此，PD-1與配體的結合非常特異，不與其他的B7家族分子產生交叉結合。
[0004] 現(xiàn)已鑒定了 ro-1 的兩種配體，分別是 ro-Ll (B7-H1)和 TO-L2 (B7-DC) (Latchman 等（2001) Nat Tmmuno 12:261-8 ;Carter 等（2002) Eur J Immunol32:634-43)。PD-L1 屬于 B7家族，具有IgV和IgC樣區(qū)、跨膜區(qū)及胞漿區(qū)尾部，PD-L1與其T細胞上的受體H)-l相互 作用，在免疫應答的負性調控方面發(fā)揮著重要作用；該分子具有寬廣的組織表達譜，廣泛表 達于抗原提呈細胞（APCs)、活化T/B細胞、巨噬細胞、胎盤滋養(yǎng)層、心肌內皮和胸腺皮質上 皮細胞。PD-L1在許多人類腫瘤組織中均可檢測到ro-Li蛋白的表達，且許多癌組織較正常 組織中的H)-L1表達水平明顯上調（Dong等人（2002)Nat. Med 8:787-9)。應用免疫組織 化學方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺 癌、神經膠質瘤、黑素瘤等人類腫瘤組織中檢測到ro-Li蛋白的表達，且ro-Li的表達水平 和患者的臨床及預后緊密相關。許多研究均表明ro-Li與腫瘤的免疫逃逸機制相關。研究 表明，腫瘤細胞以及腫瘤微環(huán)境中的apc表達的ro-Li均可經ro-i/PD-Li信號通路抑制腫 瘤抗原特異性T細胞的活化，下調t細胞介導的腫瘤免疫應答。大量實驗證明，阻斷ro-i/ PD-L1信號可以促進腫瘤抗原特異性T細胞的增值，發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用，有效抑制腫 瘤生長。因此，干預ro-1/PD-Li信號有望成為腫瘤免疫治療的新策略。
[0005]目前，對ro-1單克隆抗體進行體外評價的模型往往需要使用新鮮抗凝的人血液 或從人血中分離的白細胞，人血液來源比較困難，不僅成本較高而且存在潛在的生物危害 性。因此，建立一種穩(wěn)定可靠的、能夠在體外長期傳代培養(yǎng)的細胞模型來評價ro-i抗體的 功能，一直是本領域的技術人員急待解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于，提供一種利用傳代細胞篩選ro-i單克隆抗體的方法，該方法 能有效的篩選出特異性結合ro-i并促使淋巴細胞分必出il-2的單克隆抗體，且本發(fā)明方 法無需使用血液。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：
[0008] -種篩選ro-i單克隆抗體的方法，包括以下步驟：
[0009] 1、將人ro-i和ro-Li全長基因構建到慢病毒表達載體中；
[0010] 2、將構建好的ro-1表達載體通過慢病毒轉染的方法穩(wěn)定轉染到T淋巴細胞株；將 構建好的ro-Li表達載體通過慢病毒轉染的方法穩(wěn)定轉染到b淋巴細胞株；
[0011] 3、用抗生素G418篩選出穩(wěn)定表達ro-1的T淋巴細胞和穩(wěn)定表達ro-Ll的B淋巴 細胞；
[0012] 4、穩(wěn)定表達ro-1的T淋巴細胞和穩(wěn)定表達ro-Ll的B淋巴細胞按照合適的比例 混合后，加入梯度稀釋的ro-1單克隆抗體和T細胞超抗原SEE，然后共同孵育48小時；
[0013] 5、用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中的IL-2含量，根據(jù)IL-2含量的高低篩選所需 的ro-i單克隆抗體。
[0014] 較佳的，所述載體為pLV-IRES-Neo載體。
[0015] 較佳的，步驟4中，所述T淋巴細胞與B淋巴細胞按照1:1的細胞個數(shù)比混合。
[0016] 較佳的，所述的T淋巴細胞株選自來源于小鼠、大鼠或人的在體外培養(yǎng)條件下可 以穩(wěn)定傳代的T淋巴細胞株；所述的B淋巴細胞株選自來源于小鼠、大鼠或人的在體外培養(yǎng) 可以穩(wěn)定傳代的B淋巴細胞株。優(yōu)選所述的T淋巴細胞株為人T淋巴細胞株Jurkat ;所述 的B淋巴細胞株為人B淋巴細胞株Raji。
[0017] 實驗表明，PD-1單克隆抗體Nivolumab能夠顯著增強Raji細胞和SEE刺激Jurkat 細胞的IL-2分泌，并且這種作用具有劑量依賴性；另外，這種方法與SEB刺激全血分泌 IL-2的實驗相比，在重復性和精確度方面更加優(yōu)越，并且顯著降低了實驗成本，減少了操作 人血液帶來的各種潛在風險，達到了本發(fā)明的目的。
【附圖說明】
[0018] 圖1是轉染后Jurkat細胞表面H)-l的相對表達；
[0019] 圖2是轉染后Raj i細胞表面PD-L1的相對表達；
[0020] 圖3是抗H)-l抗體的SEB刺激全血實驗；
[0021] 圖4是SEE刺激Jurkat-PD-1和Raji-PD-Ll的混合細胞反應。
【具體實施方式】
[0022] 以下實施例、實驗例是對本發(fā)明的進一步說明，不應理解為對本發(fā)明的限制。實 施例不包括對常規(guī)方法的詳細描述，如那些用于構建載體和質粒的方法，將編碼蛋白的基 因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法。這樣的方法對本領域 中具有普通技術的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，例如：Sambr 〇〇k， J. , Fritsch, E.F. and Maniais, T. (1989)Molecular Cloning ：A Laboratory Manual,2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press。
[0023] 實施例1.人源ro-i、PD-L1和ro-L2表達載體的構建以及抗體的表達
[0024] 人源ro-1和PD-L1的全長基因購買自北京義翹神州生物技術有限公司，其序列與 Gene Bank中公布的序列完全相同（ID分別為：NM_005018.2和NM_014143.2)。PCR均采用 高保真DNA聚合酶（例如：Takara公司的PrimeSTARK HS DNA Polymerase)。擴增ro-l和 PD-L1全長基因反應條件按照DNA聚合酶生產商說明書合理設置：95°C 20秒；55°C 10秒， 72°C 1分/kb ;30個循環(huán)。擴增H)-l和PD-L1全長基因所用引物序列如下：PD-1正向引物： TATGAATTCGCCACCATGCAGATCC CACAGGCGCCCTG，PD-1 反向引物：ATAGCGGCCGCTCAGAGGGGCCAA GAGCAGTGTCC ;PD-L1 正向引物：TATGAAITCGCCACCATGAGGATAITTGCTGTCTTTAT，PD-L1 反向引 物：ATAGCGGCCGCTTACGTCTCCTCCAAATGTGTAT。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆 到pLV-IRES-Neo載體中（購自北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司），測序驗證后確認獲得了 正確的克隆。本例中的正確克隆分別記作pLV-IRES-Neo-PD-1和pLV-IRES-Neo-PD-Ll 〇
[0025] 作為陽性參照物的]^-1單克隆抗體Nivolumab (Bristol-Myers Squibb公司 產品）和Pembrolizumab的序列根據(jù)WHO所公布的氨基酸序列（http://www.who.int/ medicines/publications/druginformation/en/)由蘇州金唯智生物技術服務有限公司全 基因合成?？贵w輕鏈和重鏈的編碼序列構建到PCH01. 0載體中，表達載體轉染CH0-S細胞 (Life technologies公司產品）以及重組蛋白的表達與純化方法按照細胞供應商提供的 說明書實施。
[0026] 實施例2.慢病毒載體的包裝和轉染靶細胞
[0027] 慢病毒的包裝質粒pHl、pH2購自北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司，其 編碼慢病毒轉染和整合所必需的蛋白，J1EK293細胞作為包裝病毒顆粒的宿主細 胞。 用 Lipofectamine2000(購自 Life Technologies)將 pLV-IRES-Neo-PD-1 和 pLV-IRES-Neo-PD-Ll分別與包裝質粒pHl和pH2的混合物（pHl與pH2的質量比為1 : 1)轉染到J1EK293細胞中，表達載體、包裝質粒的質量比為1 :1。轉染具體步驟為：轉染 前24小時將HEK293細胞接種到6孔板中，每孔2ml細胞懸液共106個細胞；轉染時將 1. 5 y 1濃度為1 y g/y 1的慢病毒表達載體以及1. 5 y 1濃度為1 y g/y 1的慢病毒包裝 質粒稀釋到150 y lOptiPRO? SFM(購自Life Technologies)中，輕輕混勻；將10 y 1轉 染試劑Lipofectamine2000稀釋到150 y 10ptiPR0?SFM中，輕輕混勻；立即將稀釋后的 Lipofectamine2000溶液慢慢加入到稀釋后的DNA溶液中，加入時槍頭浸于液面之下并慢 慢排出液體；立即上下顛倒數(shù)次使溶液混勻，室溫下孵育5分鐘左右以使DNA-脂質體復合 物形成；將300 y 1 DNA-Lipofectamine2000復合物逐滴加入到上述培養(yǎng)細胞的6孔板中， 邊加邊輕搖培養(yǎng)板；轉染后的細胞培養(yǎng)物置于37°C、5% 0)2的飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)48小時。
[0028] 靶細胞轉染過程如下：48小時后用0. 45 y mMi 1 lex-HV過濾器（Mi 11 ipore產 品）過濾轉染后的HEK293細胞培養(yǎng)液上清，將過濾好的上清分別加入到Jurkat和Raji 細胞培養(yǎng)物中，Jurkat和Raji的細胞密度均為5X10 5個/ml ;然后加入轉染增強劑 Po 1 ybrene (Sigma公司產品），使其終濃度為5 y g/ml ;繼續(xù)置于37 °C、5 % C02的飽和濕 度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時；離心收集感染后的Jurkat和Raji細胞，分別用含有l(wèi)mg/ 11116418(上海生工產品）的1?^11640完全培養(yǎng)液〇?^11640基本培養(yǎng)基+10%胎牛血清 ； 兩者均購自Life Technologies)重懸細胞，繼續(xù)培養(yǎng)7天；7天之后，為轉入外源基因的細 胞將會被G418殺死，而轉染外源基因的細胞因為同時表達外源基因和新霉素抗性基因（其 產物能夠將G418滅活）而存活下來并不斷增殖。最終將穩(wěn)定轉染了 H)-l的Jurkat細胞 和轉染了 H)-L1的Raji細胞分別命名為Jurkat-PDl和Raji-PD-Ll。
[0029] 實施例3.流式細胞法檢測細胞表面目的蛋白的表達情況
[0030] Jurkat-PDl細胞表達H)-l的情況用流式細胞儀確定，只轉染空載體的Jurkat作 為對照細胞，具體步驟如下：離心收集各種細胞，用含有5% (質量分數(shù)）牛血清白蛋白的 磷酸鹽緩沖液（以下簡稱 PBSB:135mM NaCl，2. 7mM KC1，1. 5mM KH2P04,8mM K2HP04,5% 牛血 清白蛋白；pH 7. 2)將細胞密度調整到5X105個/ml ;將細胞懸液分成兩份，每份lml，其中 一份加入終濃度為1 y g/ml的Nivolumab (ro-l單克隆抗體，本實驗室內部制備），另一份 不加；室溫孵育1小時后，離心收集細胞棄上清，用PBS將細胞洗滌三遍，最后每份樣品用 lmlPBSB重懸；加入FITC標記的羊抗人IgG二抗（Fc特異；Sigma公司產品），室溫孵育30 分鐘；離心收集細胞棄上清，用PBS將細胞洗滌三遍，最終用PBS重懸細胞；流式細胞儀檢 測熒光強度。實驗結果如圖1所示，Jurkat-PDl的H)-l表達量明顯高于只轉染空載體的 Jurkat 細胞。
[0031] Raji-PD-Ll細胞表達H)-L1的情況用流式細胞儀確定，只轉染空載體的Raji細 胞分別作為對照細胞，具體步驟如下：離心收集各種細胞，用含有5%牛血清白蛋白的PBS 將細胞密度調整到5X10 5個/ml ;將將細胞懸液分成兩份，每份lml，其中一份加入終濃度 為3 y g/ml的ro-1-hFc (H)-l胞外段與人IgG的Fc段的融合蛋白，R&D公司產品），另一 份不加；室溫孵育1小時后，離心收集細胞棄上清，用PBS將細胞洗滌三遍，最后每份樣品用 lmlPBSB重懸；加入FITC標記的羊抗人IgG二抗（Fc特異；Sigma公司產品），室溫孵育30 分鐘；離心收集細胞棄上清，用PBS將細胞洗滌三遍，最終用PBS重懸細胞；流式細胞儀檢 測熒光強度。實驗結果如圖2所示，Raji-PD-Ll的H)-L1表達量明顯高于只轉染空載體的 Raji細胞。
[0032] 實施例4.葡萄球菌腸毒素 B刺激全血實驗
[0033] 葡萄球菌腸毒素B (Staphylococcal Enterotoxin B，SEB)是一種T細胞超抗原， 能直接與MHC-II類分子和某些亞型的TCR-V區(qū)結合，可刺激T細胞總數(shù)的5~20%，，具有 強烈的激活T細胞（CD4 +T細胞）的作用。此實施例的目的是要檢測H)-l單克隆抗體能否 進一步增強SEB激活的T細胞對白介素（interleukin 2，IL-2)的分泌。具體實施步驟如 下：用無血清RPMI1640培養(yǎng)基將采自健康志愿者的新鮮抗凝血按1:5稀釋，然后將稀釋好 的血液接種到96孔圓底培養(yǎng)板（Coring公司產品），每孔100 y 1 ;在相應孔中加入50 y 1 梯度濃度的ro-l單克隆抗體Nivolumab或Pembrolizumab，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育30-60 分鐘；每孔中加入50y 1 SEB，使其終濃度為100ng/ml ;置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2-4天； 取細胞培養(yǎng)物上清用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定 上清中IL-2的含量。
[0034] ELISA法測定上清中IL-2含量的具體實施步驟如下：大鼠抗人的IL-2捕獲抗體 (BD Biosciences公司產品）用0. 05M碳酸鹽緩沖液（pH 9. 6)稀釋成2μg/ml，96孔酶 標板（Corning公司產品）每孔添加100 y 1上述稀釋后的抗體溶液，置于37°C恒溫箱中孵 育2小時；用洗滌緩沖液（含有0. 05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液）洗3次，每次3分鐘； 然后加入封閉液（含有5%脫脂奶粉的0. 05M碳酸鹽緩沖液；pH 9. 6)，于4°C冰箱內過夜； 次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘；將稀釋4倍的100 y 1上清加于上 述已包被的反應孔中，置37°C孵育1小時；用洗滌緩沖液洗滌后，加濃度1 μg/ml的生物 素化大鼠抗人的IL-2檢測抗體（BD Biosciences公司產品）于各反應孔中，每孔100 y 1， 37°C孵育1小時；洗滌緩沖液洗滌后，加濃度1 y g/ml的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素 (Streptavidin-HRP，BD Biosciences 公司產品）于各反應孔中，每孔 100 yl，37°C孵育 1 小時；用洗滌緩沖液洗滌后，于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液100 y 1顯色，37°C 放置10~30分鐘；于各反應孔中加入2M硫酸50 y 1終止反應；置SpectraMax i3酶標儀 (美國Molecular Devices公司產品）測定450nm波長處吸光值。
[0035] 實驗結果如圖3所示（所示為三次獨立重復實驗的平均值），兩個陽性對照抗 體Nivolumab和Pembrolizumab在此實驗中均能夠有效刺激IL-2的分泌，它們在SEB刺 激全血實驗中的EC 5。分別為52. 25和55. 13 (單位ng/ml)，它們的95 %置信區(qū)間分別為 27. 41-99. 61和25. 87-117. 5,另外它們的R2 (反映擬合度的好壞，數(shù)值越接近1說明擬合 度越好）分別為〇? 9374和0? 9020。
[0036] 實施例5.葡萄球菌腸毒素E刺激Jurkat-PD-1和Raji-PD-Ll混合細胞實驗
[0037] 葡萄球菌腸毒素E (Staphylococcal Enterotoxin E，SEE)也是一種T細胞超抗 原，能直接與MHC-II類分子和某些亞型的TCR-V區(qū)結合，具有強烈的激活T細胞（⑶4 +T細 胞）的作用。Jurkat細胞來源于人的T淋巴白血病細胞，而Raji來源于人的B淋巴白血病 細胞，它們仍然分別保留了 T和B淋巴細胞的性質，即Jurkat表達TCR而Raji表達MHC-II 類分子，SEE能夠同時結合兩種細胞上的TCR和MHC-II類分子，從而激活Jurkat細胞使其 分泌IL-2。此實施例的目的是要檢測H)-l單克隆抗體能否進一步增強SEE和Raji激活的 Jurkat細胞對白介素（interleukin 2, IL-2)的分泌。具體實施步驟如下：
[0038] 離心分別收集 Jurkat-PD-1 和 Raji-PD-Ll 細胞，用含有 800 y g/ml 完全 RPMI1640 培養(yǎng)基將兩種細胞的密度均調整到2X 105個/ml，然后將兩種細胞等體積混合，混合培養(yǎng) 物中加入SEE使其終濃度為100ng/ml，混勻后接種到96孔圓底培養(yǎng)板（Coring公司產 品）中，每孔150 y 1 ;在相應孔中加入50 y 1梯度濃度的H)-l單克隆抗體Nivolumab或 Pembrolizumab，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2天；取細胞培養(yǎng)物上清用ELISA法測定上清 中IL-2的含量。ELISA法檢測IL-2濃度的方法與實施例4中所述相同。
[0039] 實驗結果如圖4所示（所示為三次獨立重復實驗的平均值），兩個陽性對照抗體 Nivolumab 和 Pembrolizumab 在 SEE 刺激的 Jurkat-PD-1 和 Raji-PD-Ll 混合細胞反應中均 能夠有效刺激IL-2的分泌，它們的EC5。分別為47. 94和44. 22 (單位ng/ml)，它們的95% 置信區(qū)間分別為39. 55-58. 11和35. 11-55. 70,另外它們的R2分別為0.9957和0.9929。另 外，我們的實驗結果還顯示，僅僅轉染空載體的Jurkat和Raji-PD-Ll的混合細胞反應，以 及Jurkat-PD-1和僅僅轉染空載體的Raji的混合細胞反應均不能有效刺激IL-2的進一步 分泌，這說明在兩種細胞中分別同時轉染ro-i和ro-Li是建立此模型的必要條件，相應結 果未予顯示。
[0040] 圖3和4的結果說明我們建立的混合細胞反應模型在平行性和精確度方面要優(yōu)于 SEB刺激的全血實驗。
【主權項】
1. 一種篩選ro-1單克隆抗體的方法，包括以下步驟： 1) 、將人ro-i和ro-Li全長基因分別構建到慢病毒表達載體中； 2) 、將構建好的ro-i表達載體通過慢病毒轉染的方法穩(wěn)定轉染到τ淋巴細胞株；將構 建好的ro-Li表達載體通過慢病毒轉染的方法穩(wěn)定轉染到b淋巴細胞株； 3) 、用抗生素 G418篩選出穩(wěn)定表達ro-i的τ淋巴細胞和穩(wěn)定表達ro-Li的b淋巴細 胞； 4) 、篩選后的穩(wěn)定表達ro-l的T淋巴細胞和穩(wěn)定表達PD-L1的B淋巴細胞按照合適的 比例混合后，加入梯度稀釋的ro-i單克隆抗體和T細胞超抗原SEE，然后共同孵育48小時； 5) 、檢測細胞培養(yǎng)上清中的IL-2含量，根據(jù)IL-2含量的高低篩選所需的ro-Ι單克隆 抗體。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述載體為pLV-IRES-Neo載體。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中，步驟4中所述T淋巴細胞與B淋巴細胞按照 1:1的細胞個數(shù)比混合。4. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中，所述的T淋巴細胞株為人T淋巴細胞株 Jurkat〇5. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中，所述的B淋巴細胞株為人B淋巴細胞株 Raji〇
【文檔編號】C07K16/28GK105820247SQ201410853531
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年12月31日
【發(fā)明人】趙杰, 張成海, 朱玲巧
【申請人】三生國健藥業(yè)（上海）股份有限公司