一種規(guī)模化小分子透明質(zhì)酸鈉的制備和純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種規(guī)?；》肿油该髻|(zhì)酸鈉的制備和純化方法，將大分子透明質(zhì)酸鈉溶解在堿性水溶液中，高溫降解獲得小分子透明質(zhì)酸鈉降解液；然后超濾獲得目的分子量范圍的小分子透明質(zhì)酸鈉。本發(fā)明的方法不僅可以嚴(yán)格控制透明質(zhì)酸在降解后生成穩(wěn)定的透明質(zhì)酸鹽，使得透明質(zhì)酸更加穩(wěn)定，而且可以嚴(yán)格控制透明質(zhì)酸分子量的范圍。
【專利說明】
一種規(guī)?；》肿油该髻|(zhì)酸鈉的制備和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種規(guī)?；》肿油该髻|(zhì)酸鈉 的制備和純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸及其鹽(hyaluronate acid，簡(jiǎn)稱HA)，在自然界中廣泛存在，是人和動(dòng)物 皮膚、玻璃體、關(guān)節(jié)滑液和軟骨組織的重要組成部分，是由（l-0-4)D-葡萄糖醛酸（1-P-3)N 乙酰氨基葡萄糖的雙塘單位重復(fù)連接組成，是一種鏈狀聚陰離子大分子黏多糖。廣泛應(yīng)用 于醫(yī)療、日化、食品領(lǐng)域。HA具有良好的生物相容性，極少有副作用，研究表明，HA的生物活 性具有明顯的M r (相對(duì)分子量)依懶性。
[0003] 根據(jù)文獻(xiàn)研究表明，透明質(zhì)酸鈉的生物活性與分子量的大小有關(guān)，分子量越小聚 合度越小，生物活性就會(huì)越高。比如，有文獻(xiàn)報(bào)道，在抗腫瘤作用方面，LMWHA(透明質(zhì)酸)有 很好的生物活性，低M r的HA((1~3)X105)比高M(jìn)r的HA((1.5~1.8)X10 6)更能顯著增加 CT26細(xì)胞凋亡（約50%);促炎癥反應(yīng)生物活性研究表明Mr為2 X104的HA能夠顯著正調(diào)節(jié)腫 瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF_a)的表達(dá)。LMWHA具有免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)血管形成、 抗腫瘤、創(chuàng)傷愈合等活性，皮膚對(duì)小分子透明質(zhì)酸鈉有極強(qiáng)的吸收性，在美容修復(fù)中具有不 可替代作用。
[0004] 目前本領(lǐng)域中，仍然缺乏小分子透明質(zhì)酸鈉的工業(yè)化生產(chǎn)方法，因此本領(lǐng)域技術(shù) 人員致力于開發(fā)簡(jiǎn)單方面、成本交底、適合工業(yè)化生產(chǎn)的小分子透明質(zhì)酸鈉的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種規(guī)模化小分子透明質(zhì)酸鈉的制備和純化方法及其應(yīng) 用。
[0006] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種制備小分子透明質(zhì)酸鈉的方法，包括步驟：
[0007] (1)降解
[0008] 將大分子透明質(zhì)酸鈉溶解在堿性水溶液中，高溫降解獲得小分子透明質(zhì)酸鈉降解 液;和
[0009] (2)純化
[0010] 超濾獲得目的分子量范圍的小分子透明質(zhì)酸鈉。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述大分子透明質(zhì)酸鈉的平均分子量約在800kDa~llOOkDa。 [00 12] 在另一優(yōu)選例中，所述目的分子量范圍的下限約為5kDa~500kDa，目的分子量范 圍的上限約為100kDa~800kDa。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述堿性水溶液的PH約為9 ? 0-13 ? 0;優(yōu)選地pH約為10 ? 0-12 ? 0;
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述高溫降解的溫度約為100°C~130°C;優(yōu)選地降解溫度約為 105 °C~125 °C ;更優(yōu)選地降解溫度121°C。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述高溫降解的時(shí)間約為2h~10h。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述步驟(2)中使用中空纖維柱或膜包超濾。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述步驟⑵中，包括步驟：
[0018] (a)-級(jí)超濾純化
[0019] 使用截留分子量小于目的分子量范圍下限的超濾裝置，去除小分子透明質(zhì)酸鈉降 解液中的無機(jī)鹽離子；
[0020] (b)二級(jí)超濾純化
[0021] 使用截留分子量大于或等于目的分子量范圍上限的超濾裝置，對(duì)步驟(a)獲得的 溶液進(jìn)行超濾，收集分離液；
[0022] (c)三級(jí)超濾純化
[0023]使用截留分子量小于目的分子量范圍下限的超濾裝置，對(duì)步驟(b)獲得分離液進(jìn) 行超濾濃縮，獲得濃縮液，所述濃縮液中含有目的分子量范圍的小分子透明質(zhì)酸鈉。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(2)中，還包括步驟：
[0025] (d)醇沉
[0026]將步驟(c)中獲得的濃縮液加入95%藥用乙醇溶液中，靜置，從而獲得固態(tài)目的分 子量范圍的小分子透明質(zhì)酸鈉。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述方法中：
[0028] 將大分子透明質(zhì)酸鈉溶解在pH約為9~13的堿性水溶液中，100~130°C降解2.5h ~3.5h，超濾后獲得目的分子量范圍約為200kDa-400kDa的小分子透明質(zhì)酸鈉;或者 [0029] 將大分子透明質(zhì)酸鈉溶解在pH約為9~13的堿性水溶液中，100~130°C降解4.5h ~5.5h，超濾后獲得目的分子量范圍約為100kDa-200kDa的小分子透明質(zhì)酸鈉;或者 [0030] 將大分子透明質(zhì)酸鈉溶解在pH約為9~13的堿性水溶液中，100~130°C降解6.5h ~7.5h，超濾后獲得目的分子量范圍約為50kDa-100kDa的小分子透明質(zhì)酸鈉;或者 [0031] 將大分子透明質(zhì)酸鈉溶解在pH約為9~13的堿性水溶液中，100~130°C降解7.5h ~8.5h，超濾后獲得目的分子量范圍約為5kDa_50kDa的小分子透明質(zhì)酸鈉。
[0032]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0033]圖1顯示了降解3小時(shí)透明質(zhì)酸鈉分子量圖譜。
[0034]圖2顯示了降解5小時(shí)透明質(zhì)酸鈉分子量圖譜。
[0035]圖3顯示了降解7小時(shí)透明質(zhì)酸鈉分子量圖譜。
[0036]圖4顯示了降解8小時(shí)透明質(zhì)酸鈉分子量圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0037]本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，獲得一種規(guī)模化小分子透明質(zhì)酸鈉的制備和提 純方法。通過在堿性條件下高溫降解大分子透明質(zhì)酸鈉溶液，然后通過分子排阻工藝分離、 純化，嚴(yán)格制備不同大小分子量透明質(zhì)酸。不僅可以嚴(yán)格控制透明質(zhì)酸在降解后生成穩(wěn)定 的透明質(zhì)酸鹽，使得透明質(zhì)酸更加穩(wěn)定，而且可以嚴(yán)格控制透明質(zhì)酸分子量的范圍，通過藥 用乙醇沉淀、脫水、45 °C真空干燥，實(shí)現(xiàn)藥用級(jí)小分子透明質(zhì)酸納（玻璃酸鈉）的工業(yè)化生 產(chǎn)。
[0038] 通過單一的降解方法，對(duì)降解透明質(zhì)酸鈉有一定的局限性。本發(fā)明通過化學(xué)和物 理的方法共同作用降解，同時(shí)通過分子排阻法純化分離工藝進(jìn)行分離純化，最后通過乙醇 沉淀干燥。實(shí)現(xiàn)高純度的小分子透明質(zhì)酸鈉的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0039] 在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@ 類方法和條件可以變動(dòng)。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并 且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限制。
[0040] 除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時(shí)，術(shù)語 "約"意指該值可以從列舉的值變動(dòng)不多于1%。例如，如本文所用，表述"約1〇〇"包括99和 101和之間的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等）。
[0041] 雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價(jià)的任何方法 和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。
[0042] 本發(fā)明公開了一種大規(guī)模小分子透明質(zhì)酸鈉的制備和提純方法。
[0043]在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，采用pH9.0-13.0的NaOH溶液作為媒介，溶解大 分子透明質(zhì)酸鈉，通過100°c以上高溫降解3-8個(gè)小時(shí)，降解得到不同分子量的透明質(zhì)酸及 其鹽，通過分子排阻法工藝條件分離純化不同分子量透明質(zhì)酸，再透過濃縮制備高濃度的 透明質(zhì)酸酸溶液，濃縮液通過藥用乙醇沉淀干燥作用機(jī)理，實(shí)現(xiàn)小分子透明質(zhì)酸鈉工業(yè)化 制備。在整個(gè)生產(chǎn)工藝中過程中，分子排阻法制備的透明質(zhì)酸鈉的分子量通過物理方法控 制。整個(gè)工藝提高的小分子透明質(zhì)酸的純度。
[0044] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，將大分子透明質(zhì)酸鈉溶解于pH9.0-13.0的 NaOH溶液中，其玻璃酸鈉溶液濃度為50-60g/L，在通過100°C以上高溫降解，控制降解時(shí)間， 來控制降解后透明質(zhì)酸鈉的分子量。
[0045] 然后，通過一級(jí)超濾純化，去除降解溶液中的無機(jī)鹽離子，同時(shí)進(jìn)一步將溶液濃 縮，收集超純的透明質(zhì)酸鈉溶液。
[0046] 二級(jí)超濾，將濃縮液加入3-6倍注射用水，攪拌混勻，利用剪切力的作用使用中空 纖維柱或膜包超濾、分離特定分子量范圍的小分子透明質(zhì)酸鈉。
[0047]三級(jí)超濾，即為濃縮，將二級(jí)超濾液進(jìn)行濃縮，最后的濃縮液即為高濃度小分子透 明質(zhì)酸鈉溶液，然后稱取〇. 5 %-2%的NaCl溶解于5-20ml注射用水中，然后將溶解后的NaCl 溶液加入濃縮后的透明質(zhì)酸鈉溶液中，靜置。
[0048] 一次醇沉，量取3-6倍體積的95 %的藥用乙醇，將靜置后的濃縮液緩慢加入乙醇溶 液中，以攪拌槳l〇_15rpm/min速度攪拌，出現(xiàn)白色顆粒狀透明質(zhì)酸鈉，控制攪拌速度，免于 形成絮狀沉淀，在0-4°C的冰箱中，靜置10_300min分鐘，去除上清液。
[0049] 二次醇沉，量取3-6倍體積的95%的藥用乙醇，加入一次醇沉的透明質(zhì)酸鈉中，放 在0-4°C的冰箱中，靜置10-300分鐘，去除上清液。
[0050] 三次醇沉，即脫水，量取3-6倍體積的95 %的藥用乙醇，加入二次醇沉的透明質(zhì)酸 鈉中，放在0-4°C的冰箱中，靜置10_300min分鐘，去除上清液。將三次醇沉透明質(zhì)酸通過8號(hào) 篩網(wǎng)，過濾去除多余的乙醇溶液，放入30-50°C，真空度0.08MPa的恒溫真空干燥箱中，干燥 10小時(shí)以上。
[0051 ]檢測(cè)干燥后透明質(zhì)酸鈉干粉水分，應(yīng)低于8%。
[0052] 超濾
[0053]超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定 孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部 分的純化。
[0054]超濾原理也是一種膜分離過程原理，超濾利用一種壓力活性膜，在外界推動(dòng)力(壓 力)作用下截留水中膠體、顆粒和分子量相對(duì)較高的物質(zhì)，而水和小的溶質(zhì)顆粒透過膜的分 離過程。
[0055] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0056] (1)在整個(gè)制備過程中沒有引進(jìn)其他的化學(xué)物質(zhì)，保證小分子透明質(zhì)酸鈉產(chǎn)品沒 有化學(xué)殘留，刺激性小。
[0057] (2)在整個(gè)過程分子量可以明確表示，通過物理作用分離，能更準(zhǔn)確確認(rèn)透明質(zhì)酸 分子量的范圍。
[0058] (3)實(shí)現(xiàn)小分子玻璃酸鈉制備工業(yè)化生產(chǎn)，整個(gè)生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，易于操作，易于控 制，降低生產(chǎn)成本。
[0059] (4)在制備過程中堿性條件優(yōu)于酸性條件，透明質(zhì)酸的保存以鈉鹽形式保存，易于 保存;酸性條件如果采用鹽酸，其具有揮發(fā)性，制備過程中存在嚴(yán)重的安全;采用硫酸，帶入 了新的硫酸根離子;同時(shí)在超濾過程中，膜包在堿性條件下不會(huì)受到損害。
[0060] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳陳本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如美國(guó)Sambrook. J等著《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(黃培堂等譯，北京:科學(xué)出版社，2002年） 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì) 算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。
[0061 ] 實(shí)施例1
[0062] 將50g高分子透明質(zhì)酸鈉加入到1000ml pH 11.ONaOH注射用水溶液中，完全溶解， 溶解液分裝兩個(gè)玻璃容器內(nèi)，在121°C高溫條件下，進(jìn)行高溫降解反應(yīng)，高溫降解3個(gè)小時(shí)， 冷卻，加入4倍注射水稀釋。
[0063] 一級(jí)超濾、純化，將稀釋后的玻璃酸鈉溶液通過膜包(Microza PALL AIP2013-6K) 超濾純化，超濾純化5倍注射水，去除溶液中的NaOH離子，濃縮致1500ml溶液。
[0064] 將濃縮液加入5倍注射水稀釋，通過(Microza PALL AHP2013-200K)200KDa的膜包 超濾，收集部分超濾液進(jìn)行醇沉，沒有透明質(zhì)酸鈉白色顆粒析出，說明降解分子量在200KDa 以上，再次將溶液濃縮至1500ml。
[0065] 二級(jí)超濾分離，將濃縮液加入5倍注射水稀釋，更換400KDa膜包(Microza PALL AHP2013-400K)超濾分離，超濾分離電機(jī)控制在低速轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)，分離10倍注射水溶液，收集 分離液體進(jìn)行三級(jí)濃縮。
[0066] 濃縮(Microza PALL AHP2013-400K)膜包內(nèi)剩余溶液（分子量在400KDa以上）至 500ml，收集，稱取0.05g NaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解，加入到濃縮液中，靜置5min， 獲得第一份濃縮液，留待醇沉。
[0067] 三級(jí)濃縮，利用一級(jí)超濾純化膜包(Microza PALL AIP2013-6K)對(duì)二級(jí)分離液進(jìn) 行超濾濃縮，將溶液濃縮致l〇〇〇ml。收集，稱取0.45g NaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解， 加入到濃縮液中，靜置5min，收集獲得第二份濃縮液進(jìn)行下一步醇沉工藝。
[0068] 將第一份濃縮液緩慢加入到2000ml 95%藥用乙醇溶液中，攪拌速度在lOrpm/ min，放入0-4 °C冰箱中靜置30min，有少量的透明質(zhì)酸鈉沉淀析出，去除上清液;繼續(xù)加入到 2000ml的乙醇溶液，放入0-4 °C冰箱中靜置60min，去除上清液;再次加入到2000ml的乙醇溶 液，放入〇_4°C冰箱中靜置240min，去除上清液，通過8號(hào)篩網(wǎng)，過濾多余的乙醇。
[0069] 將第二份濃縮液緩慢加入到4000ml 95%藥用乙醇溶液中，攪拌速度在15rpm/ min，放入0-4 °C冰箱中靜置30min，有大量的透明質(zhì)酸鈉沉淀析出，去除上清液;繼續(xù)加入到 4000ml的乙醇溶液，放入0-4 °C冰箱中靜置60min，去除上清液;再次加入到4000ml的乙醇溶 液，進(jìn)行脫水，放入〇_4°C冰箱中靜置240min，去除上清液，通過8號(hào)篩網(wǎng)，過濾多余的乙醇。
[0070] 同時(shí)將第一份和第二份醇沉后的透明質(zhì)酸鈉放入在30°C，0.08MPa恒溫真空干燥 箱中，干燥16-19小時(shí)，檢測(cè)水分，水分含量在7.8 %，分別稱重為1.1 g和47.6g。
[0071] 實(shí)施列2
[0072] 將60g高分子透明質(zhì)酸鈉加入到1000ml pH9.0Na0H注射用水溶液中，完全溶解，溶 解液分裝兩個(gè)玻璃容器內(nèi)，在121°C高溫條件下，進(jìn)行高溫降解反應(yīng)，高溫降解5個(gè)小時(shí)，冷 卻，加入4倍注射水稀釋。
[0073] 一級(jí)超濾純化，將稀釋后的玻璃酸鈉溶液通過柱式膜包(Microza PALL AIP2013- 6K)超濾純化，超濾純化5倍注射水，去除溶液中的NaOH離子，濃縮致1500ml溶液。
[0074]將濃縮液加入5倍注射水稀釋，通過lOOkDa的膜包超濾，收集部分超濾液進(jìn)行醇 沉，沒有透明質(zhì)酸鈉白色顆粒析出，說明降解分子量在l〇〇kDa以上，再次將溶液濃縮至 1500ml〇
[0075] 二級(jí)超濾分離，將濃縮液加入5倍注射水稀釋，更換200kDa膜包(Microza PALL AHP2013-200K)超濾分離，超濾分離電機(jī)控制在低速轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)，分離10倍注射水溶液，收集 分離液體進(jìn)行三級(jí)濃縮工藝。
[0076] 濃縮(Microza PALL AHP2013-200K)膜包內(nèi)剩余溶液（分子量在200KDa以上）至 500ml，收集，稱取0.05g NaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解，加入到濃縮液中，靜置5min， 獲得第一份濃縮液，留待醇沉。
[0077] 三級(jí)濃縮，利用一級(jí)超濾純化膜包(Microza PALL AIP2013-6K)對(duì)二級(jí)分離液進(jìn) 行濃縮，將溶液濃縮致l〇〇〇ml。收集，稱取0.55g NaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解，加入 到濃縮液中，靜置5min，收集獲得第二份濃縮液進(jìn)行下一步醇沉工藝。
[0078] 將第一份濃縮液緩慢加入到2000ml 95%藥用乙醇溶液中，攪拌速度在10rpm/ min，放入0-4 °C冰箱中靜置30min，有少量的透明質(zhì)酸鈉沉淀析出，去除上清液;繼續(xù)加入到 2000ml的乙醇溶液，放入0-4 °C冰箱中靜置60min，去除上清液;再次加入到2000ml的乙醇溶 液，放入〇_4°C冰箱中靜置240min，去除上清液，通過8號(hào)篩網(wǎng)，過濾多余的乙醇。
[0079] 將第二份濃縮液緩慢加入到4000ml 95%藥用乙醇溶液中，攪拌速度在15rpm/ min，放入0-4 °C冰箱中靜置30min，有大量的透明質(zhì)酸鈉沉淀析出，去除上清液;繼續(xù)加入到 4000ml的乙醇溶液，放入0-4 °C冰箱中靜置60min，去除上清液;再次加入到4000ml的乙醇溶 液，進(jìn)行脫水，放入〇_4°C冰箱中靜置240min，去除上清液，通過8號(hào)篩網(wǎng)，過濾多余的乙醇。
[0080]同時(shí)將第一份和第二份醇沉后的透明質(zhì)酸鈉放入在30°C，0.08MPa恒溫真空干燥 箱中，干燥16-19小時(shí)，檢測(cè)水分，水分含量在8.0%，分別稱重為1.4g和57.4g。
[0081 ] 實(shí)施例3:
[0082] 將55g高分子透明質(zhì)酸鈉加入到1000ml pH13.0Na0H注射用水溶液中，完全溶解， 溶解液分裝兩個(gè)玻璃容器內(nèi)，在121°C高溫條件下，進(jìn)行高溫降解反應(yīng)，高溫降解7個(gè)小時(shí)， 冷卻，加入4倍注射水稀釋。
[0083] 一級(jí)超濾純化，將稀釋后的玻璃酸鈉溶液通過柱式膜包(Microza PALL AIP2013-6K)超濾純化，超濾純化5倍注射水，去除溶液中的NaOH離子，濃縮致1500ml溶液。
[0084]將濃縮液加入5倍注射水稀釋，通過10kDa的膜包超濾，收集部分超濾液進(jìn)行醇沉， 沒有透明質(zhì)酸鈉白色顆粒析出，說明降解分子量在10kDa以上，再次將溶液濃縮至1500ml。 [0085] 二級(jí)超濾分離，將濃縮液加入5倍注射水稀釋，更換lOOkDa膜包(Microza PALL AHP2013-100K)超濾分離，超濾分離電機(jī)控制在低速轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)，超濾10倍注射水溶液，收集 分離液體進(jìn)行三級(jí)濃縮工藝。
[0086] 濃縮(Microza PALL AHP2013-100K)膜包內(nèi)剩余溶液（分子量在lOOKDa以上）至 500ml，收集，稱取0.05gNaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解，加入到濃縮液中，靜置5min，獲 得第一份濃縮液，留待醇沉。
[0087] 三級(jí)濃縮，利用一級(jí)超濾純化膜包(Microza PALL AIP2013-6K)對(duì)二級(jí)分離液進(jìn) 行濃縮，將溶液濃縮致l〇〇〇ml。收集，稱取0.55gNaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解，加入到 濃縮液中，靜置5min，收集獲得第二份濃縮液進(jìn)行下一步醇沉工藝。
[0088] 將第一份濃縮液緩慢加入到2000ml 95%藥用乙醇溶液中，攪拌速度在10rpm/ min，放入0-4 °C冰箱中靜置30min，有少量的透明質(zhì)酸鈉沉淀析出，去除上清液;繼續(xù)加入到 2000ml的乙醇溶液，放入0-4 °C冰箱中靜置60min，去除上清液;再次加入到2000ml的乙醇溶 液，放入〇_4°C冰箱中靜置240min，去除上清液，通過8號(hào)篩網(wǎng)，過濾多余的乙醇。
[0089] 將第二份濃縮液緩慢加入到4000ml 95%藥用乙醇溶液中，攪拌速度在15rpm/ min，放入0-4 °C冰箱中靜置30min，有大量的透明質(zhì)酸鈉沉淀析出，去除上清液;繼續(xù)加入到 4000ml的乙醇溶液，放入0-4 °C冰箱中靜置60min，去除上清液;再次加入到4000ml的乙醇溶 液，進(jìn)行脫水，放入〇_4°C冰箱中靜置240min，去除上清液，通過8號(hào)篩網(wǎng)，過濾多余的乙醇。
[0090]同時(shí)將第一份和第二份醇沉后的透明質(zhì)酸鈉放入在30°C，0.08MPa恒溫真空干燥 箱中，干燥16-19小時(shí)，檢測(cè)水分，水分含量在7.0%，分別稱重為1.0g和53.0g。
[0091] 實(shí)施例4:
[0092] 將55g高分子透明質(zhì)酸鈉加入到1000ml pH13.0Na0H注射用水溶液中，完全溶解， 溶解液分裝兩個(gè)玻璃容器內(nèi)，在121°C高溫條件下，進(jìn)行高溫降解反應(yīng)，高溫降解8個(gè)小時(shí)， 冷卻，加入4倍注射水稀釋。
[0093] 一級(jí)超濾純化，將稀釋后的玻璃酸鈉溶液通過柱式膜包(Microza PALL AIP2013-6K)超超濾純化，超濾純化5倍注射水，去除溶液中的NaOH離子，濃縮致1500ml溶液。
[0094]收集前期部分超濾液進(jìn)行醇沉，沒有透明質(zhì)酸鈉白色顆粒析出，說明降解分子量 6000Da在以上。
[0095] 二級(jí)超濾分離，將濃縮液加入5倍注射水稀釋，更換10kDa膜包（Microza PALL ACP3013)超濾分離，超濾分離電機(jī)控制在低速轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)，分離10倍注射水溶液，收集分離液 體進(jìn)行三級(jí)濃縮工藝。
[0096] 濃縮(Microza PALL ACP3013)膜包內(nèi)剩余溶液(分子量在lOKDa以上）至500ml，收 集，稱取0.05gNaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解，加入到濃縮液中，靜置5min，獲得第一份 濃縮液，留待醇沉。
[0097] 三級(jí)超濾，利用一級(jí)超濾純化膜包(Microza PALL AIP2013-6K)對(duì)二級(jí)分離液進(jìn) 行濃縮，將溶液濃縮至l〇〇〇ml。收集，稱取0.55gNaCl溶解在5ml水中，待其完全溶解，加入到 濃縮液中，靜置5min，收集獲得第二份濃縮液進(jìn)行下一步醇沉工藝。
[0098] 將第一份濃縮液緩慢加入到2000ml 95%藥用乙醇溶液中，攪拌速度在lOrpm/ min，放入0-4 °C冰箱中靜置30min，有少量的透明質(zhì)酸鈉沉淀析出，去除上清液;繼續(xù)加入到 2000ml的乙醇溶液，放入0-4 °C冰箱中靜置60min，去除上清液;再次加入到2000ml的乙醇溶 液，放入〇_4°C冰箱中靜置240min，去除上清液，通過8號(hào)篩網(wǎng)，過濾多余的乙醇。
[0099] 將第二份濃縮液緩慢加入到4000ml 95%藥用乙醇溶液中，攪拌速度在15rpm/ min，放入0-4 °C冰箱中靜置30min，有大量的透明質(zhì)酸鈉沉淀析出，去除上清液;繼續(xù)加入到 4000ml的乙醇溶液，放入0-4 °C冰箱中靜置60min，去除上清液;再次加入到4000ml的乙醇溶 液，進(jìn)行脫水，放入〇_4°C冰箱中靜置240min，去除上清液，通過8號(hào)篩網(wǎng)，過濾多余的乙醇。 [0100]同時(shí)將第一份和第二份醇沉后的透明質(zhì)酸鈉放入在30°C，0.08MPa恒溫真空干燥 箱中，干燥16-19小時(shí)，檢測(cè)水分，水分含量在7.5%，分別稱重為1.2g和52.6g。
[0101]通過實(shí)施例4,可以證實(shí)，在分子量降到lOOkDa后，在堿性容易中更容易降解，所需 要時(shí)間更短時(shí)間更短。
[0102] 通過以上四個(gè)案例總結(jié)整個(gè)工藝控制參數(shù)以及分子量的范圍如下表：
[0103] 表1小分子透明質(zhì)酸鈉降解時(shí)間及降解重量比
[0105] 實(shí)施例5:
[0106] 將58g高分子透明質(zhì)酸鈉加入到1000ml pH 13.ONaOH注射用水溶液中，完全溶解， 將溶解后的液體平均分裝于4個(gè)玻璃容器內(nèi)，在121°C高溫條件下，進(jìn)行降解反應(yīng)，在3、5、7、 8四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出一個(gè)樣品。3小時(shí)取出的實(shí)驗(yàn)樣品按照實(shí)施例1工藝要求進(jìn)行 純化;5小時(shí)取出的實(shí)驗(yàn)樣品按照實(shí)施例2的工藝要求進(jìn)行純化;7小時(shí)取出的實(shí)驗(yàn)樣品按照 實(shí)施例3的工藝要求進(jìn)行純化;8小時(shí)取出的樣品按照實(shí)施例4的工藝要求進(jìn)行純化。
[0107] 純化后產(chǎn)品通過0.08MPa恒溫真空干燥箱中，干燥16-19小時(shí)，檢測(cè)水分，水分含量 在7.5%以下，既可。
[0108] 實(shí)施例5所制備的透明質(zhì)酸鈉符合實(shí)驗(yàn)要求，通過實(shí)施例5,可以控制在制備不同 分子量產(chǎn)品的配方要求中更具有針對(duì)性。
[0109]在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制備小分子透明質(zhì)酸鈉的方法，其特征在于，包括步驟： (1) 降解 將大分子透明質(zhì)酸鈉溶解在堿性水溶液中，高溫降解獲得小分子透明質(zhì)酸鈉降解液； 和 (2) 純化 超濾獲得目的分子量范圍的小分子透明質(zhì)酸鈉。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述大分子透明質(zhì)酸鈉的平均分子量約在800kDa~ 1100kDa〇3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述目的分子量范圍的下限約為5kDa~500kDa，目 的分子量范圍的上限約為lOOkDa~800kDa。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述堿性水溶液的pH約為9.0-13.0。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述堿性水溶液的pH約為10.0-12.0。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述高溫降解的溫度約為100°C~130°C;優(yōu)選地降 解溫度約為105 °C~125 °C ;更優(yōu)選地降解溫度121°C。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述高溫降解的時(shí)間約為2h~10h。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述步驟(2)中，包括步驟： (a) -級(jí)超濾純化 使用截留分子量小于目的分子量范圍下限的超濾裝置，去除小分子透明質(zhì)酸鈉降解液 中的無機(jī)鹽離子； (b) 二級(jí)超濾純化 使用截留分子量大于或等于目的分子量范圍上限的超濾裝置，對(duì)步驟(a)獲得的溶液 進(jìn)行超濾，收集分離液； (c) 三級(jí)超濾純化 使用截留分子量小于目的分子量范圍下限的超濾裝置，對(duì)步驟(b)獲得分離液進(jìn)行超 濾濃縮，獲得濃縮液，所述濃縮液中含有目的分子量范圍的小分子透明質(zhì)酸鈉。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述步驟(2)中，還包括步驟： (d) 醇沉 將步驟(c)中獲得的濃縮液加入95%藥用乙醇溶液中，靜置，從而獲得固態(tài)目的分子量 范圍的小分子透明質(zhì)酸鈉。10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法中： 將大分子透明質(zhì)酸鈉溶解在pH約為9~13的堿性水溶液中，100~130 °C降解2.5h~ 3.5h，超濾后獲得目的分子量范圍約為200kDa-400kDa的小分子透明質(zhì)酸鈉;或者 將大分子透明質(zhì)酸鈉溶解在pH約為9~13的堿性水溶液中，100~130 °C降解4.5h~ 5.5h，超濾后獲得目的分子量范圍約為100kDa-200kDa的小分子透明質(zhì)酸鈉;或者 將大分子透明質(zhì)酸鈉溶解在pH約為9~13的堿性水溶液中，100~130 °C降解6.5h~ 7.5h，超濾后獲得目的分子量范圍約為50kDa-100kDa的小分子透明質(zhì)酸鈉;或者 將大分子透明質(zhì)酸鈉溶解在pH約為9~13的堿性水溶液中，100~130 °C降解7.5h~ 8.5h，超濾后獲得目的分子量范圍約為5kDa-50kDa的小分子透明質(zhì)酸鈉。
【文檔編號(hào)】C08B37/08GK105820271SQ201610352055
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年5月25日
【發(fā)明人】宋禹, 孫海勝, 程慶有, 周雪, 王珙, 鐘慧麗, 薛艷平, 王曄塵
【申請(qǐng)人】蘇州景卓生物技術(shù)有限公司