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一種曲霉菌f菌株及其篩選方法和應(yīng)用

文檔序號(hào):10467020閱讀:913來源:國知局
一種曲霉菌f菌株及其篩選方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種曲霉菌F菌株及其篩選方法和應(yīng)用。一種曲霉菌F菌株,保藏號(hào)為:CGMCC NO.1176。所述菌株篩選方法為將新鮮瓦式馬尾藻加入陳海水直至馬尾藻腐爛,馬尾藻腐爛液稀釋后涂布在選擇培養(yǎng)基上,待菌落長出后篩選出后并提純。本發(fā)明提供的曲霉菌F菌株可分泌纖維素酶,而且在應(yīng)用時(shí),利用馬尾藻粉作為纖維素底物誘導(dǎo)產(chǎn)酶,直接將該菌株的酶解系統(tǒng)與馬尾藻藻體纖維素直接作用,能有效酶解馬尾藻中的纖維素物質(zhì),將其降解為還原糖等單糖物質(zhì),為生物乙醇的發(fā)酵直接提供發(fā)酵底物。本發(fā)明將難以利用的纖維素物質(zhì)進(jìn)行生物乙醇的生產(chǎn),設(shè)備簡單,反應(yīng)溫和,操作簡便,適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。CGMCC No.1176720151130
【專利說明】
一種曲霉菌F菌株及其篩選方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種曲霉菌F菌株及其篩選方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 化石燃料作為一種能源在商業(yè)、交通、工業(yè)等方面有著不可替代的作用,隨著現(xiàn)代 化工業(yè)的加速發(fā)展和世界人口的逐步增加,人們對(duì)能源的需求量越來越大。據(jù)一項(xiàng)國際報(bào) 道,在未來30年里,人們對(duì)能源的需求量將會(huì)增加53%。生物乙醇作為一種清潔無污染的可 再生能源受到各個(gè)國家的廣泛關(guān)注,不僅能夠作為燃料直接使用,同時(shí)還能混合汽油中供 給汽車使用,能大大降低人們對(duì)化石燃料的依賴度。
[0003] 藻類生物質(zhì)作為第三代燃料乙醇的生產(chǎn)原料以其生長周期短,生長速率快和生物 量巨大的優(yōu)勢戰(zhàn)勝了第一代和第二代燃料乙醇。馬尾藻主要產(chǎn)于我國廣東沿海和海南等地 區(qū),是一種大型海洋褐藻,資源豐富。馬尾藻富含氨基酸、纖維素、微量元素以及多糖類,可 用于藻膠的制作以及作為第三代燃料乙醇的生產(chǎn)原料。纖維素是D-葡糖糖以0-1,4糖苷鍵 為基環(huán)組成的大分子多糖[1],通常與木質(zhì)素、半纖維素組合在一起,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,難降解。相 對(duì)于物理和化學(xué)方法降解纖維素時(shí)的設(shè)備要求高、時(shí)間長等缺點(diǎn),纖維素酶作為酶解纖維 素快速高效的方法被人們所熟知,但商品纖維素酶價(jià)格昂貴,不適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種曲霉菌F菌株,該菌株能夠分泌纖維素酶,對(duì)馬尾藻體所 含有的纖維素類物質(zhì)進(jìn)行有效降解,可將纖維素降解為還原糖等單糖物質(zhì),為馬尾藻的進(jìn) 一步資源化利用提供技術(shù)保障。
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種曲霉菌F菌株,該菌株能夠分泌纖維素酶,對(duì)馬尾藻體所 含有的纖維素類物質(zhì)進(jìn)行有效降解,可將纖維素降解為還原糖等單糖物質(zhì),為馬尾藻的進(jìn) 一步資源化利用提供技術(shù)保障。
[0006] 本發(fā)明的另一幕的是提供一種曲霉菌F菌株的篩選方法。
[0007] 本發(fā)明的另一幕的是提供一種曲霉菌F菌株酶解馬尾藻的應(yīng)用方法。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)效果,本發(fā)明通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0009] 一種曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.),其特征在于:保藏號(hào)為:CGMCC N0.1176。 [0010]所述的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)的篩選方法,其步驟包括:
[0011] (1)稱取新鮮瓦式馬尾藻于燒杯中,加入陳海水,用八層紗布扎住封口,外加一層 錫箱紙,于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至馬尾藻腐爛;
[0012] (2)將步驟(1)中的腐爛馬尾藻液體,稀釋后涂布在選擇培養(yǎng)基上,恒溫培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)待菌落長出;
[0013] (3)在長出菌落的選擇培養(yǎng)基中挑取單菌落一滿環(huán),于5-6ml的富集培養(yǎng)基搖床振 蕩過夜培養(yǎng),搖床條件設(shè)置為轉(zhuǎn)速170r/min,溫度33°C,待菌液渾濁;
[0014] (4)取步驟(3)中的渾濁菌液,稀釋至10'取150-200yL涂布于鑒別培養(yǎng)基上,并用 染色,篩選有透明圈的菌株進(jìn)行平板劃線分離,并提純。
[0015] 所述步驟(1)中馬尾藻與陳海水的加入量配比為lg: 10ml;恒溫培養(yǎng)溫度為33°C, 時(shí)間為10天。
[0016] 所述步驟(2)中的選擇培養(yǎng)基中添加的組分包括纖維素粉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、 七水合硫酸鎂、酵母粉、瓊脂粉以及自然海水,各組分加入的配比依次為8.0g:0.5g :1.0g: 0?5g:0?lg:1?8g:1000ml。
[0017] 所述步驟(3)中富集培養(yǎng)基中添加的組分包括纖維素粉、馬尾藻粉、硝酸鈉、氯化 鉀、磷酸二氫鈉、七水合硫酸鎂、酵母粉、水解酪素以及海水,各組分加入的配比依次為 1?0g:5?0g:1?0g:0?5g:0?5g:0?5g:0?5g:0?lg:1000ml。
[0018] 所述步驟(4)中鑒別培養(yǎng)基中添加的組分羧甲基纖維素鈉、磷酸二氫鉀、酵母粉、 瓊脂粉、自然海水,各組分加入的配比依次為5.0g: 0.25g: 1.0g: 1.0g: 1000ml。
[0019]所述的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)降解瓦式馬尾藻的應(yīng)用方法為:
[0020] (a)將曲霉菌F菌株在Martin液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12-18小時(shí),取2-4ml菌液于已 滅菌的纖維素誘導(dǎo)培液體養(yǎng)基中,恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)4-6天;
[0021] (b)將步驟(a)中的纖維素誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基,低溫離心處理,取上清液為粗酶液;
[0022] (c)將馬尾藻粉溶于2-4%的硫酸中,制成馬尾藻液,高壓滅菌后,用PH值調(diào)節(jié)液調(diào) 至中性,然后加入(b)中的粗酶液,36-40 °C條件下反應(yīng)48-60小時(shí)。
[0023]在步驟(a)中的纖維素誘導(dǎo)培液體養(yǎng)基組分為馬尾藻粉、葡萄糖、蛋白胨、七水合 硫酸鎂、磷酸二氫鉀、1 %孟加拉紅水、1 %鏈霉素液、蒸餾水,各組分比例依次為7.2-8.8g: 1?8-2?2g:4?5-5?5g:0?45-0?55g:lg:3-3?6ml:2?7-3?3ml:900-1100ml。
[0024]所述步驟(a)中的恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速為150r/min,溫度為33°C。
[0025] 在步驟(b)中低溫離心處理的溫度為4-5°C,轉(zhuǎn)速3000-5000r/min,時(shí)間為8-12min〇
[0026]在步驟(c)中,所述硫酸的濃度為2%,馬尾藻粉與硫酸的質(zhì)量體積比為2_4g: 20ml 〇
[0027] 在步驟(c)中,高壓滅菌為121°C,時(shí)間為30min,PH值調(diào)節(jié)液為氫氧化鈉溶液。
[0028] 在步驟(c)中,馬尾藻粉與粗酶液的加入量配比為l_2g: 10ml。優(yōu)選比例為1.5g: 10ml 〇
[0029]本發(fā)明篩選得到的菌株為曲霉Aspergilus sp.,該菌株于2015年11月30日保藏中 國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。 保藏號(hào)CGMCC從).1176,其幾3序列,如下:

[0031] 本發(fā)明的有益效果是:
[0032] 1、本發(fā)明提供的曲霉菌F菌株可分泌纖維素酶,而且在應(yīng)用時(shí),利用馬尾藻粉作為 纖維素底物誘導(dǎo)產(chǎn)酶,直接將該菌株的酶解系統(tǒng)與馬尾藻藻體纖維素直接作用,能有效酶 解馬尾藻中的纖維素物質(zhì),將其降解為還原糖等單糖物質(zhì),為生物乙醇的發(fā)酵直接提供發(fā) 酵底物。
[0033] 2、本發(fā)明將難以利用的纖維素物質(zhì)進(jìn)行生物乙醇的生產(chǎn),設(shè)備簡單,反應(yīng)溫和,操 作簡便,適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
[0035]自然海水為上海市金山區(qū)城市沙灘海域采集并用0.22um濾膜過濾后的備用海水。
[0036]下面結(jié)合實(shí)例,對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
[0037]自然海水為上海市金山區(qū)城市沙灘海域采集回,用0.22um濾膜過濾后的備用海 水。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 曲霉菌F菌株的篩選
[0040] 在馬尾藻生長的海域及底泥中,采樣帶回,采樣點(diǎn)為浙江舟山海域,采集后立即低 溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行篩選。
[0041 ] (1)稱取20g新鮮馬尾藻于500ml燒杯中,加入200ml自然海水,用八層紗布扎住封 口,外加一層錫箱紙,于恒溫培養(yǎng)箱中自然腐爛,溫度為30°C,時(shí)間為10天。
[0042] (2)吸取自然腐爛的馬尾藻液,用無菌水進(jìn)行梯度稀釋,取稀釋度為10-6馬尾藻液 150ul,在選擇培養(yǎng)基平板上涂布。
[0043]其中選擇培養(yǎng)基為
[0044] 纖維素粉8.0g
[0045] 氯化鈉 0.5g [0046] 磷酸二氫鉀l.Og [0047] 七水合硫酸鎂0.5g
[0048]酵母粉 O.lg
[0049] 瓊脂粉 1.8g
[0050] 自然海水1000ml
[0051] (3)在選擇培養(yǎng)基平板中挑取單菌落,于富集培養(yǎng)基中振蕩過夜培養(yǎng),搖床條件設(shè) 置為轉(zhuǎn)速170r/min,溫度33°C,待菌液渾濁;
[0052]其中富集培養(yǎng)基為:纖維素粉1.0g [0053]馬尾藻粉5.0g [0054]硝酸鈉 l.Og
[0055] 氯化鉀 0.5g
[0056] 磷酸二氫鈉0.5g [0057] 七水合硫酸鎂0.5g
[0058]酵母粉 0.5g [0059] 水解酪素O.lg
[0060] 自然海水1000ml
[0061] (4)將富集培養(yǎng)基中渾濁的菌液進(jìn)行稀釋:10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,將 稀釋度為10-6的菌液150ul,涂布在鑒別培養(yǎng)基平板上,于恒溫培養(yǎng)箱中33°C培養(yǎng)3天。 [0062]其中鑒別培養(yǎng)基為:羧甲基纖維素鈉5.0g
[0063] 磷酸二氫鉀0.25g
[0064] 酵母粉 l.Og
[0065] 瓊脂粉 l.Og
[0066] 自然海水1000ml
[0067]在長出菌落的鑒別培養(yǎng)基上添加1 %的剛果紅溶液,15min后倒去染液,滴加lmol/ L的氯化鈉溶液5-6滴,洗去多余剛果紅,15min后倒去氯化鈉溶液,觀察透明圈,測量水解圈 的直徑,挑選透明圈大的菌株,進(jìn)行多次平板劃線分離,最終得到純菌株。
[0068] 實(shí)施例2 [0069]粗酶液的制取
[0070] (1)將實(shí)施例1中得到的曲霉菌F菌株培養(yǎng)在Martin液體培養(yǎng)基中,18小時(shí)搖床過 夜培養(yǎng)后,取3ml于已滅菌的纖維素誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基中,33°C,150r/min培養(yǎng)5天。取纖維素 誘導(dǎo)培養(yǎng)后的液體,經(jīng)冷凍離心機(jī)離心后取上清液,即為粗酶液。
[0071] 其中纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:
[0072]馬尾藻粉8.0g
[0073]葡萄糖 2.0g [0074]蛋白胨 5.0g [0075] 七水合硫酸鎂0.5g
[0076] 磷酸二氫鉀l.Og [0077] 1 %孟加拉紅水3.3ml
[0078] 1%鏈霉素液3ml
[0079] 蒸餾水 1000ml
[0080] (2)其中,低溫冷凍離心機(jī)的條件為溫度4°C,轉(zhuǎn)速4000r/min,離心時(shí)間10min。
[0081] (3)步驟(2)中,F(xiàn)菌株纖維素液體誘導(dǎo)培養(yǎng)后的酶解液,經(jīng)低溫離心所取得的上清 液,即為F菌株所產(chǎn)的粗酶液。
[0082] 實(shí)施例3
[0083]粗酶液酶活的測定
[0084] (1)粗酶液的獲得同實(shí)施例2。
[0085] (2)濾紙酶活(FPA)測定:將濾紙剪成長方形紙條,長約5cm,寬約1.5cm,放進(jìn)25mL 比色管內(nèi),加入lmL檸檬酸緩沖液(pH=4.8),再加入2mL所制得的粗酶液,使濾紙完全浸泡 在溶液中,50°C準(zhǔn)確保溫lh后立即按DNS法測還原糖,測得酶活力為14.32U/mL。
[0086] (3)CMC酶活測定:吸取所制得的粗酶液于25mL比色管中,加入lmL含0.5%CMC-Na 的檸檬酸緩沖液(pH = 4.4),50°C準(zhǔn)確保溫30min后立即按DNS法測還原糖,測得酶活力為 21.97U/mL〇
[0087] 實(shí)施例4
[0088]粗酶液酶活的測定
[0089] (1)粗酶液的獲得同實(shí)施例2。
[0090] (2)濾紙酶活(FPA)測定:將濾紙剪成長方形紙條,長約5cm,寬約1.5cm,放進(jìn)25mL 比色管內(nèi),加入lmL檸檬酸緩沖液(pH=4.8),再加入2mL所制得的粗酶液,使濾紙完全浸泡 在溶液中,50°C準(zhǔn)確保溫lh后立即按DNS法測還原糖,測得酶活力為11.68U/mL。
[0091] (3)CMC酶活測定:吸取所制得的粗酶液于25mL比色管中,加入lmL含0.5%CMC-Na 的檸檬酸緩沖液(pH = 4.4),50°C準(zhǔn)確保溫30min后立即按DNS法測還原糖,測得酶活力為 19.99U/mL〇 [0092] 實(shí)施例5
[0093]粗酶液對(duì)馬尾藻的酶解應(yīng)用
[0094] (1)以浙江舟山海域馬尾藻為藻樣,采回后,用海水清洗除去貝殼、沙石雜藻等3-4 遍,陽光下晾干,并用粉碎機(jī)粉碎lmin,過80目篩,存于陰涼處備用。
[0095] (2)稱取30g干燥的馬尾藻粉末于250ml三角瓶中,2%硫酸高壓滅菌處理后,調(diào)pH 至中性。馬尾藻粉與2%硫酸的加入配比為3g:20mL,粗酶液用本實(shí)施例2中所制得的粗酶 液,2 %硫酸處理后的馬尾藻液與粗酶液的配比為lml: lml,37 °C反應(yīng)48h后,按DNS法檢測還 原糖,測得還原糖得率為6.92%,說明粗酶液對(duì)馬尾藻藻體中纖維素類物質(zhì)有很好地降解 作用,可將纖維素降解為還原糖,為馬尾藻制取生物乙醇做好了準(zhǔn)備。
[0096] 實(shí)施例6
[0097]粗酶液對(duì)馬尾藻的酶解應(yīng)用
[0098] (1)以浙江舟山海域馬尾藻為藻樣,采回后,用海水清洗除去貝殼、沙石雜藻等3-4 遍,陽光下晾干,并用粉碎機(jī)粉碎lmin,過80目篩,存于陰涼處備用。
[0099] (2)稱取30g干燥的馬尾藻粉末于250ml三角瓶中,2%硫酸高壓滅菌處理后,調(diào)pH 至中性。馬尾藻粉與2%硫酸的加入配比為3g:20mL,粗酶液用本實(shí)施例2中所制得的粗酶 液,2 %硫酸處理后的馬尾藻液與粗酶液的配比為lml: lml,37 °C反應(yīng)48h后,按DNS法檢測還 原糖,測得還原糖得率為7.37%,說明粗酶液對(duì)馬尾藻藻體中纖維素類物質(zhì)有很好地降解 作用,可將纖維素降解為還原糖,為馬尾藻制取生物乙醇做好了準(zhǔn)備。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.),其特征在于:保藏號(hào)為CGMCC NO. 1176。2. 如權(quán)利要求1所述的曲霉菌F菌株(Aspergi 1 lus sp.)的篩選方法,其步驟包括: (1) 稱取新鮮瓦式馬尾藻于燒杯中,加入陳海水,用八層紗布扎住封口,外加一層錫箱 紙,于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至馬尾藻腐爛; (2) 將步驟(1)中的腐爛馬尾藻液體,稀釋后涂布在選擇培養(yǎng)基上,恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 待菌落長出; (3) 在長出菌落的選擇培養(yǎng)基中挑取單菌落一滿環(huán),于5-6ml的富集培養(yǎng)基搖床振蕩過 夜培養(yǎng),搖床條件設(shè)置為轉(zhuǎn)速170r/min,溫度33°C,待菌液渾濁; (4) 取步驟(3)中的渾濁菌液,稀釋至10-6,取150-200yL涂布于鑒別培養(yǎng)基上,并用染 色,篩選有透明圈的菌株進(jìn)行平板劃線分離,并提純。3. 根據(jù)權(quán)利要求2中所述的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)的篩選方法,其特征在于 所述步驟(1)中馬尾藻與陳海水的加入量配比為lg: l〇ml;恒溫培養(yǎng)溫度為33°C,時(shí)間為10 天。4. 如權(quán)利要求1所述的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp .)降解瓦式馬尾藻的應(yīng)用方法 為: (a) 將曲霉菌F菌株在Martin液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12-18小時(shí),取2-4ml菌液于已滅菌 的纖維素誘導(dǎo)培液體養(yǎng)基中,恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)4-6天; (b) 將步驟(a)中的纖維素誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基,低溫離心處理,取上清液為粗酶液; (c) 將馬尾藻粉溶于2-4%的硫酸中,制成馬尾藻液,高壓滅菌后,用PH值調(diào)節(jié)液調(diào)至中 性,然后加入(b)中的粗酶液,36-40 °C條件下反應(yīng)48-60小時(shí)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4中的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)降解瓦式馬尾藻的應(yīng)用方法, 其特征在于:在步驟(a)中的纖維素誘導(dǎo)培液體養(yǎng)基組分為馬尾藻粉、葡萄糖、蛋白胨、七水 合硫酸鎂、磷酸二氫鉀、1 %孟加拉紅水、1 %鏈霉素液、蒸餾水,各組分比例依次為7.2-8·8g:1·8-2·2g:4·5-5·5g:0·45-0·55g:lg:3-3·6ml:2·7-3·3ml:900-1100ml。6. 根據(jù)權(quán)利要求4中的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)降解瓦式馬尾藻的應(yīng)用方法, 其特征在于:所述步驟(a)中的恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速為150r/min,溫度為33°C。7. 根據(jù)權(quán)利要求4中的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)降解瓦式馬尾藻的應(yīng)用方法, 其特征在于:在步驟(b)中低溫離心處理的溫度為4-5°C,轉(zhuǎn)速3000-5000r/min,時(shí)間為8-12min〇8. 根據(jù)權(quán)利要求4中的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)降解瓦式馬尾藻的應(yīng)用方法, 其特征在于:在步驟(c)中,硫酸的濃度為2%,馬尾藻粉與硫酸的加入量配比為2-4g:20ml。9. 根據(jù)權(quán)利要求4中的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)降解瓦式馬尾藻的應(yīng)用方法, 其特征在于:在步驟(c)中,高壓滅菌為121°C,時(shí)間為30min,PH值調(diào)節(jié)液為氫氧化鈉溶液。10. 根據(jù)權(quán)利要求4中的曲霉菌F菌株(Aspergillus sp.)降解瓦式馬尾藻的應(yīng)用方法, 其特征在于:在步驟(c)中,馬尾藻粉與粗酶液的加入量配比為l-2g: 10ml。
【文檔編號(hào)】C12N1/02GK105820957SQ201511007615
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2015年12月29日
【發(fā)明人】王淑賢, 何培民, 賈睿, 韋章良, 丁平真, 劉偉
【申請(qǐng)人】上海海洋大學(xué)
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