一種大腸桿菌基因工程菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種大腸桿菌基因工程菌。本發(fā)明提供一種大腸桿菌基因工程菌，以CCTCC M 2016070的保藏號保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。利用本發(fā)明所提供的大腸桿菌基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)L?Ser，在發(fā)酵培養(yǎng)約35 h，L?Ser產(chǎn)量可達(dá)21.7 g/L，糖轉(zhuǎn)化率為17?19%，與現(xiàn)有谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)L?Ser技術(shù)相比具有發(fā)酵時間短、生產(chǎn)強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)；與現(xiàn)有大腸桿菌生產(chǎn)L?Ser技術(shù)相比具有產(chǎn)量高，轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)。CCTCC NO：M 201607020160223
【專利說明】
一種大腸桿菌基因工程菌
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種大腸桿菌基因工程菌。
【背景技術(shù)】
[0002] L-絲氨酸(L-Serine，L-Ser)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)。此外，以L-Ser為原料還可以合成具有抗癌、抗艾滋、調(diào)節(jié)人體神經(jīng)系統(tǒng)等藥物20余種;其市場潛力巨 大。
[0003] 目前，L-絲氨酸的生產(chǎn)方法主要有酶法和微生物發(fā)酵法兩種，其中由于微生物發(fā) 酵法具有原料廉價、產(chǎn)物純度高、易提取等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此其育種研究獲得了廣泛的關(guān)注。 大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌是最常見的兩種L-絲氨酸生產(chǎn)菌株，其中谷氨酸棒桿菌通過基因 工程改造后，發(fā)酵培養(yǎng)96h，L_絲氨酸的產(chǎn)量可達(dá)到42g/L(Effect of cofactor folate on the growth of Corynebacterium glutamicum SYPS_062and L-Serine accumulation, Applied Biochemistry and Biotechnology，2014.173:1607_1617.)D然而，目前構(gòu)建的大 腸桿菌基因工程菌的L-絲氨酸產(chǎn)量仍然偏低，例如:克隆表達(dá)E.coli DH5a基因組中磷絲氨 酸磷酸酶基因serB、磷絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因serC和抗反饋調(diào)節(jié)的磷酸甘油酸脫氫酶基因 (serA fb〇,同時敲除敲除絲氨酸脫水酶編碼基因sdaA，異檸檬酸裂解酶調(diào)節(jié)因子編碼基因 iclR，有氧呼吸調(diào)控蛋白編碼基因arcA，蘋果酸合酶編碼基因aceB構(gòu)建而成的基因工程菌 分批補(bǔ)料發(fā)酵后，L_Ser產(chǎn)量僅至8.34g/L(Construction of an L-serine producing Escherichia coli via metabolic engineering,Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology，2014?41:1443-1450?)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種大腸桿菌基因工程 菌，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種大腸桿菌基因工程 菌，以CCTCC M 2016070的保藏號保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center for Type Culture Col lection，簡稱CCTCC)。
[0006] 所述大腸桿菌基因工程菌為敲除絲氨酸脫水酶編碼基因sdaA構(gòu)建而成的基因工 程菌。
[0007] 本發(fā)明第二方面提供所述大腸桿菌基因工程菌的制備方法，包括如下步驟：
[0008] 1)將磷絲氨酸磷酸酶基因serB、磷絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因serC和磷酸甘油酸激酶 基因pgk，磷酸甘油酸脫氫酶基因serA的抗反饋調(diào)節(jié)突變株serA2,連接到載體pSC上，構(gòu)建 重組質(zhì)粒pSC-PR-serB-PL-serA2-PR-serC-PL-pgk，標(biāo)記為質(zhì)粒pSC-06，其核苷酸序列如 SEQIDN0.7K* ;
[0009] 2)敲除大腸桿菌E.coli W3110基因組中的sdaA基因片段，得到sdaA基因失活的菌 株E.coli W3110-A sdaA，標(biāo)記為E.coli SWZ-01;
[0010] 3)將質(zhì)粒PSC06轉(zhuǎn)化至E.coli SWZ-01的感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組大腸桿菌SWZ-01/ pSC06；
[0011] 4)等離子體誘變重組大腸桿菌SWZ-01/pSC06,獲得誘變菌株E.coli SWZ-02/pSC-06,保藏號為：CCTCC M 2016070。
[0012]本發(fā)明第三方面提供所述大腸桿菌基因工程菌在生產(chǎn)L-Ser中的用途。
[0013]本發(fā)明第四方面提供一種L-Ser的生產(chǎn)方法，包括如下步驟:在合適的條件下誘導(dǎo) 所述大腸桿菌基因工程菌(CCTCC M 2016070)生產(chǎn)1^-36『。
[0014]在本發(fā)明的一些實施方式中，所述L-Ser的生產(chǎn)方法中，在發(fā)酵培養(yǎng)前，可以將磷 絲氨酸磷酸酶基因serB、磷絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因serC和磷酸甘油酸激酶基因pgk和磷酸 甘油酸脫氫酶基因serA的抗反饋調(diào)節(jié)突變體serA2構(gòu)建入所述所述大腸桿菌基因工程菌 (CCTCC M2016070)，還可以進(jìn)一步包括種子培養(yǎng)步驟，具體可以包括如下步驟：
[0015] 1)將磷絲氨酸磷酸酶基因 serB、磷絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因 serC和磷酸甘油酸激酶 基因pgk和磷酸甘油酸脫氫酶基因serA的抗反饋調(diào)節(jié)突變體serA2構(gòu)建入所述大腸桿菌基 因工程菌；
[0016] 2)種子培養(yǎng):將步驟1構(gòu)建獲得的大腸桿菌基因工程菌接入培養(yǎng)基中，在合適條件 下培養(yǎng)獲得種子培養(yǎng)液；
[0017] 3)發(fā)酵培養(yǎng)：將種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)液中，在合適的條件下誘導(dǎo)生產(chǎn)L-Ser〇
[0018] 所述磷絲氨酸磷酸酶基因 serB、磷絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因 serC和磷酸甘油酸激酶 基因pgk均可參見Genbank No.AP009048基因組中的相應(yīng)基因片段，所述抗反饋調(diào)節(jié)的磷酸 甘油酸脫氫酶基因86^2的核苷酸序列如5￡〇10從).5所示。
[0019] 在本發(fā)明的一些實施方式中，所述步驟1)中，通過pSC載體(L-絲氨酸基因工程菌 的構(gòu)建及發(fā)酵條件優(yōu)化，大連工業(yè)大學(xué)，碩士論文，劉巖(系中科院上海高等研究院聯(lián)合培 養(yǎng)研究生），2015)將磷絲氨酸磷酸酶基因serB、磷絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因serC和磷酸甘油 酸激酶基因pgk和磷酸甘油酸脫氫酶基因serA的抗反饋調(diào)節(jié)突變體serA2構(gòu)建入所述所述 大腸桿菌基因工程菌(CCTCC M 2016070)。所述pSC載體包括卡那霉素抗性基因、pR和pL兩 個啟動子和此31和此32兩個多克隆位點(diǎn)，載體口3(：的核苷酸序列如3￡〇10從).6所示。
[0020] 在本發(fā)明的一些實施方式中，所述步驟3)中，在合適的條件下誘導(dǎo)生產(chǎn)L-Ser的具 體條件可以為：當(dāng)菌體處于對數(shù)生長前期時，在35-38°C下，發(fā)酵約32-38小時，所述對數(shù)生 長期前期通常指菌體生長至〇D 6〇() = 15-17的階段。
[0021] 在本發(fā)明的一些實施方式中，所述步驟3)中，誘導(dǎo)生產(chǎn)L-Ser時發(fā)酵液中的葡萄糖 濃度小于5g/L，發(fā)酵培養(yǎng)液pH為6.8-7.0。
[0022] 本發(fā)明利用生產(chǎn)菌E.coli SWZ-02/pSC-06(大腸桿菌基因工程菌）發(fā)酵生產(chǎn)L-Ser，在發(fā)酵培養(yǎng)約35h，L-Ser產(chǎn)量可達(dá)21.7g/L，糖轉(zhuǎn)化率為17-19 %，與現(xiàn)有谷氨酸棒桿菌 生產(chǎn)L-Ser技術(shù)相比具有發(fā)酵時間短、生產(chǎn)強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)得到的L-絲氨酸可以廣泛應(yīng) 用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域。此外，本發(fā)明提供的大腸桿菌基因工程菌與現(xiàn)有大腸桿菌 生產(chǎn)L-Ser技術(shù)相比具有產(chǎn)量高，轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0023] 圖1顯示為重組質(zhì)粒pSC06的物理圖譜。
[0024] 圖2顯不為重組質(zhì)粒pSC06的酶切鑒定;M:MarkeA-EcoT14I digest; 1:SacI單酶切 后的DNA片段。
【具體實施方式】
[0025] 以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實 施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0026] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實施方案;還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個"、"一"和"這個"包括復(fù)數(shù)形式。
[0027]當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端 點(diǎn)以及兩個端點(diǎn)之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實 現(xiàn)本發(fā)明。
[0028] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng) 域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及 相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998;METH0DS IN ENZYM0L0GY,Vol.304,Chromatin(P.M.ffassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0029] 實施例1
[0030] 質(zhì)粒pSC06的構(gòu)建：
[0031 ]所述重組表達(dá)載體 pSC-PR-serB-PL-serA2-PR-serC_PL-pgk，標(biāo)記為 pSC-〇6 的構(gòu) 建方法為:提供磷絲氨酸磷酸酶基因serB、磷絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因serC和磷酸甘油酸激 酶基因 pgk和磷酸甘油酸脫氫酶基因 serA的抗反饋調(diào)節(jié)突變體serAfblX標(biāo)記為serA2)DNA片 段的是重組質(zhì)粒pSC-serA2 serB和pSC-serC-pgk(參見L-絲氨酸基因工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵 條件優(yōu)化，大連工業(yè)大學(xué)，碩士論文，劉巖（系中科院上海高等研究院聯(lián)合培養(yǎng)學(xué)生）， 2015)。以重組質(zhì)粒pSC-serC-pgk DNA為模板，在上下游引物中均設(shè)計限制性內(nèi)切酶Sac I， 擴(kuò)增p R - s e r C - p L - p g k基因串聯(lián)盒的核苷酸序列（上游引物為：P 1 : 5 ' - GAGCTCACGTTAAATCTATCACCG-3 '（SEQ ID NO ? 1，下劃線SacI酶切位點(diǎn)）。下游引物為:P2:5 ' -GAGCTCTTAAGCATGCGTCGACACGCGTACGTATTGATGGAGTCAGTACCGAC-3'（SEQ ID N0.2下劃線為 限制性內(nèi)切酶的核酸序列，包含的酶切位點(diǎn)有Sac I、AflII、Sph I、Sal I、Mlu I、SnaB I))，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、Sac I單酶切后，與經(jīng)相同酶切后的重組質(zhì)粒pSC-serA2serB進(jìn)行T4 連接(pR-serC-pL-pgk基因串聯(lián)盒的核苷酸序列中不具備但表達(dá)載體pSC-serA2serB多克 隆位點(diǎn)上具有限制性內(nèi)切酶Sac頂每切位點(diǎn)），構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pSC-PR-serB-PL-serA2-PR-serC-PL-pgk，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布至含50mg/L卡那霉素的LB平 板，挑取單克隆菌落轉(zhuǎn)接至含50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi) 切酶Sac I單酶切鑒定。根據(jù)序列分析，當(dāng)正向連接時重組質(zhì)粒pSC-PR-serB-PL-serA2-PR-serC-PL-pgk經(jīng)Sac I單酶切后，應(yīng)分別獲得7677bp和3385bp大小的DNA片段。如圖2所示， DNA凝膠電泳的結(jié)果與預(yù)期值相符。將酶切驗證正向連接正確的質(zhì)粒pSC-PR-serB-PL- SerA2-PR-serC-PL-pgk送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明 重組表達(dá)質(zhì)粒pSC-PR-serB-PL-serA2-PR-serC_PL-pgk構(gòu)建成功，標(biāo)記為質(zhì)粒pSC06,質(zhì)粒 PSC06的物理圖譜如圖1。
[0032]本實施例中LB培養(yǎng)基組分為:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L。
[0033] 實施例2 [0034] sdaA基因的敲除：
[0035]根據(jù)E.coli JW1803_2(該菌株購自美國耶魯大學(xué)大腸桿菌菌株庫，E.coli Genetic Resources at Yale,CGSC,The Coli Genetic Stock Center，其sdaA基因已經(jīng)被 kana插入失活)的基因組序列設(shè)計引物，具體如下：
[0036] 上游引物：5'-CAGGCATTACATCTGGGTCGTTATCACC-3'（SEQ ID N0.3)
[0037] 下游引物：5'-GGTGCAGGAAGITCAGCCAGAATGTC-3'（SEQ ID N0.4)
[0038] 該菌株信息詳見：http://cgsc. bio logy .yale.edu/Mutation.php? ID = 102886 [0039]擴(kuò)增該菌sdaA基因座及上下游約500bp片段，將該DNA片段轉(zhuǎn)化含有質(zhì)粒pKD46(購 自美國耶魯大學(xué)大腸桿菌菌株庫）的E . col i W3110，利用Red同源重組技術(shù)敲除E . col i W3110基因組的sdaA基因片段，再轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pCP20(購自美國耶魯大學(xué)大腸桿菌菌株庫），去 除kan片段后得到sdaA基因失活的菌株，標(biāo)記為SWZ-01。
[0040] 實施例3
[0041 ] 大腸桿菌基因工程SWZ-01/pSC06的構(gòu)建：
[0042]提取重組表達(dá)質(zhì)粒pSC06電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SWZ-01的感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB平板 (卡那霉素Kan，50iig/ml)進(jìn)行培養(yǎng)，挑取重組單菌落，LB液體培養(yǎng)基(Kan，50iig/ml)中培養(yǎng) 10-12h后，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證正確后，獲得重組大腸桿菌SWZ-01/pSC06。
[0043] 實施例4
[0044] 大腸桿菌誘變菌株SWZ_02/pSC06的獲得：
[0045] 以重組大腸桿菌SWZ-01/pSC06為出發(fā)菌株，接種200yL工程菌SWZ-01/pSC-06的甘 油管保藏菌液至50mL LB培養(yǎng)基中，37°C活化培養(yǎng)12h后，按照5%的接種量轉(zhuǎn)接至50mL新鮮 LB培養(yǎng)基中；當(dāng)菌體生長至0D600為0.8-1.0時，取20yL的菌體懸浮液，在等離子體誘變ARTP 系統(tǒng)(ARTP-n，北京思清源）中處理不同的時間，然后再涂布至LB培養(yǎng)基平板上，挑選平板 上的單克隆菌體，轉(zhuǎn)接至試管中進(jìn)行發(fā)酵篩選培養(yǎng)，在約2000左右單克隆菌株篩選中，篩 選獲得L-Ser的高產(chǎn)菌株，為了避免重組質(zhì)粒pSC06的核苷酸序列在等離子體誘變過程中發(fā) 生突變，將篩選獲得的菌株多次無抗性傳代后，消除重組質(zhì)粒，從而獲得宿主菌SWZ-02(宿 主菌的保藏號為：CCTCC M 2016070)，并將前期構(gòu)建保存的質(zhì)粒pSC06重新電轉(zhuǎn)化至宿主 中，構(gòu)建重組菌SWZ-02/pSC06,作為后期實驗用菌。
[0046]本實施例中LB培養(yǎng)基組分為:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L。
[0047] 實施例5
[0048] 誘變菌株SWZ-02/pSC06發(fā)酵生產(chǎn)L-Ser:
[0049] 將菌株SWZ-02/pSC06,接入含50μg/ml卡那霉素的50ml LB培養(yǎng)基中，50ml培養(yǎng)基 放入250ml的培養(yǎng)瓶中，37°C、200rpm，培養(yǎng)10~12h;培養(yǎng)后0D600吸光值在5~6之間。
[0050]以10% (v/v)的比例轉(zhuǎn)接上步種子培養(yǎng)液至裝有2.5L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中發(fā) 酵。發(fā)酵初始溫度為35°C，當(dāng)菌體生長至對數(shù)生長期前期時，升溫至38°C培養(yǎng)，誘導(dǎo)菌株產(chǎn) L-Ser。當(dāng)發(fā)酵液中初始葡糖糖基本耗盡時，開始流加800g/L的葡萄糖溶液，并調(diào)控流速使 發(fā)酵液中的葡萄糖濃度小于5g/L。發(fā)酵過程中，利用流加濃氨水的方法使發(fā)酵培養(yǎng)基pH保 持在6.8-7.0左右。發(fā)酵約35h時，停止發(fā)酵，取菌液離心，取上清液測定L-Ser的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn) 發(fā)酵液中最高可積累21.7g/L的L-Ser。與實驗室前期構(gòu)建的工程菌粒(11.4g/L)相比，提高 了90.4，是目前報道的大腸桿菌產(chǎn)L-Ser的最高產(chǎn)量。
[0051 ]上述培養(yǎng)過程中所使用的LB培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下：
[0052]種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其組分為:蛋白胨1 Og/L，酵母粉5g/L，氯化鈉1 Og/L。
[0053]發(fā)酵培養(yǎng)基：3g/L MgS〇4 ? 7H20,0.017g/L CaCl2 ? 2H20,3g/L KH2P〇4，lg/L NaCl， 5g/L(NH4)2S〇4,0.07g/L FeS〇4 ? 7H20,0.11g/L Na-Citrate ? 2H20,0.2g/L酵母膏，8g/L葡 萄糖和 1.5mL/L微量元素液 1000X母液（7g/L CoCl2 ? 6H20,2.5g/L CuS〇4 ? 5H20,25g/L H3B03，16g/L MnCh ? 4H20，1.5g/L Na2Mo〇4 ? 2H20,3g/L ZnS〇4 ? 7H20)，pH值為pH 6.8-7.0。 [0054] L-Ser產(chǎn)量的測定方法如下：
[0055]采用高效液相色譜異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生法檢測發(fā)酵液中L-絲氨酸的含 量，具體衍生方法參照文獻(xiàn):楊智、陽利龍、祝文兵、等，異硫氰酸苯酯柱前衍生化RP-HPLC法 測定人血漿中10種氨基酸的濃度[J]，中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2011，16(5): 549-552。 [0056]而液相色譜的分析條件為:發(fā)酵液中的L-Ser濃度通過島津LC-20A測定。采用的色 譜柱為:Agilent Extend C_18(250mmX4? 6mm，5iim)色譜柱。流動相為：（A)0? 05mol/L乙酸 鈉(pH為6.50±0.05)和⑶甲醇：乙腈:水(20:60:20)，流速為lmL/min。梯度洗脫程序為： 0-12min，流動相(B)濃度保持7%;12-13min流動相(B)濃度由7%升至100%;流動相(B)濃 度保持100%至18min，18-19min流動相(B)濃度由100%降至7%，19-25min流動相(B)濃度 保持7%，回到初始條件。使用紫外檢測器檢測標(biāo)樣及樣品中L-Ser在254nm的吸收峰值，進(jìn) 樣體積1 OyL，柱溫45 °C。
[0057]綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。 [0058]上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
[0059]保藏編號：CCTCC NO:M 2016070
[0060]保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心 [0061 ]保藏單位地址:湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi) [0062]保藏日期：2016.2.23
[0063]分類命名：大腸桿菌SWZ-02 Escherichia coli SWZ-02
【主權(quán)項】
1. 一種大腸桿菌基因工程菌，其保藏號為CCTCC Μ 2016070。2. 如權(quán)利要求1所述的大腸桿菌基因工程菌在生產(chǎn)L-Ser中的用途。3. -種L-Ser的生產(chǎn)方法，包括如下步驟:在合適的條件下誘導(dǎo)如權(quán)利要求1所述的大 腸桿菌基因工程菌生產(chǎn)L-Ser。4. 如權(quán)利要求3所述的L-Ser的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述L-Ser的生產(chǎn)方法中具體可 以包括如下步驟： 1) 將磷絲氨酸磷酸酶基因 serB、磷絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因 serC和磷酸甘油酸激酶基因 pgk和磷酸甘油酸脫氫酶基因 serA的抗反饋調(diào)節(jié)突變體serA2構(gòu)建入權(quán)利要求1所述的大腸 桿菌基因工程菌； 2) 種子培養(yǎng):將步驟1構(gòu)建獲得的大腸桿菌基因工程菌接入培養(yǎng)基中，在合適條件下培 養(yǎng)獲得種子培養(yǎng)液； 3) 發(fā)酵培養(yǎng):將種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)液中，在合適的條件下誘導(dǎo)生產(chǎn)L-Ser。5. 如權(quán)利要求4所述的L-Ser的生產(chǎn)方法，其特征在于，通過pSC載體將磷絲氨酸磷酸酶 基因 serB、磷絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因 serC和磷酸甘油酸激酶基因 pgk和磷酸甘油酸脫氫酶 基因 serA的抗反饋調(diào)節(jié)突變體serA2構(gòu)建入權(quán)利要求1所述的大腸桿菌基因工程菌。6. 如權(quán)利要求4所述的L-Ser的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟3)中，在合適的條件下 誘導(dǎo)生產(chǎn)L-Ser的具體條件為：當(dāng)菌體處于對數(shù)生長前期時，在35-38°C下，發(fā)酵32-38小時。7. 如權(quán)利要求4所述的L-Ser的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟3)中，誘導(dǎo)生產(chǎn)L-Ser 時發(fā)酵液中的葡萄糖濃度小于5g/L，發(fā)酵培養(yǎng)液pH為6.8-7.0。
【文檔編號】C12R1/19GK105820991SQ201610203856
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月1日
【發(fā)明人】趙志軍, 史吉平, 姜標(biāo), 劉巖, 崔云風(fēng), 石斌超, 李晶, 王晨陽
【申請人】中國科學(xué)院上海高等研究院