一種纖維素降解菌群的宏基因組的提取方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種纖維素降解菌群的宏基因組的提取方法。本發(fā)明提供了一種纖維素降解菌群宏基因組DNA的提取方法，包括如下步驟：對(duì)纖維素分解菌群依次進(jìn)行菌體破壁、有機(jī)溶液抽提DNA、異戊醇沉淀DNA和溶解DNA，得到宏基因組DNA；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明通過(guò)在提取前采用高鹽溶液進(jìn)行洗脫，并通過(guò)加入溶菌酶和機(jī)械勻漿強(qiáng)化細(xì)胞破壁，并通過(guò)蛋白酶K破壁，不僅使微生物細(xì)胞壁更易破碎，DNA分子更易釋放，同時(shí)有效保證了過(guò)程的可重復(fù)性，進(jìn)而保證了提取的宏基因組DNA片段完整性、純度和菌群結(jié)構(gòu)完整性。本發(fā)明為天然纖維素利用菌群的研究和應(yīng)用,以及微生物分子生態(tài)學(xué)研究提供了有效的技術(shù)支撐。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種纖維素降解菌群的宏基因組的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種纖維素降解菌群的宏基因組的提取方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 木質(zhì)纖維素是自然界中產(chǎn)量最大的多糖物質(zhì)，廣泛存在于森林、草原和農(nóng)田中。其 產(chǎn)量豐富，價(jià)格低廉，而且多以農(nóng)業(yè)和工業(yè)廢棄物形式存在，是理想的生物能源類(lèi)物質(zhì)的生 產(chǎn)原料。研究表明，以木質(zhì)纖維素為原料的生物能源生產(chǎn)工藝不僅能夠?qū)崿F(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物的 再利用，而且可有效避免能源生產(chǎn)與糧食資源間的矛盾，成為最具潛力的生物能源工業(yè)化 生產(chǎn)途徑。
[0003] 然而，由于木質(zhì)纖維素組成復(fù)雜、結(jié)構(gòu)致密，其水解為可利用糖的過(guò)程需要多種酶 系的協(xié)同作用，導(dǎo)致利用成本居高不下。自然界中纖維素降解細(xì)菌菌群由多種細(xì)菌長(zhǎng)期共 生而成，能夠快速高效地降解積累的大量木質(zhì)纖維素。其中，木質(zhì)纖維素降解菌能提供極為 豐富的纖維素酶系和半纖維素酶系，而非纖維素降解菌株能提供的輔助因子，幫助纖維素 快速降解。近年來(lái)的研究顯示，利用菌群發(fā)酵纖維素有望實(shí)現(xiàn)一步法纖維素生物燃料的生 產(chǎn)，進(jìn)而較大程度的降低生產(chǎn)成本。因此，揭示天然菌群轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素的作用機(jī)理，成為 本領(lǐng)域研究的重要內(nèi)容。
[0004] 目前，已經(jīng)建立了多種研究菌群作用機(jī)理的方法。其中，宏基因組測(cè)序是相對(duì)成熟 的手段之一，已成功應(yīng)用在多種菌群樣品的結(jié)構(gòu)分析之中，包括土壤、水體等環(huán)境樣品和腸 道菌群、瘤胃、沼氣種泥等功能樣品。但是，由于纖維素菌群的自身特點(diǎn)，增加了其基因組 DNA的提取難度，因此，尚未建立完善的纖維素菌群的宏基因分析技術(shù)。
[0005] 影響天然纖維素菌群宏基因組提取效果的因素主要包括如下三點(diǎn)：第一，纖維素 菌群中的菌株多通過(guò)纖維小體結(jié)構(gòu)與纖維素微絲緊密結(jié)合，以"纖維素_酶-菌體"的交聯(lián)形 式存在于發(fā)酵液中，這種交聯(lián)會(huì)顯著影響菌體的破壁和基因組提取，導(dǎo)致獲得的DNA無(wú)法真 實(shí)反映菌群組成，影響菌群結(jié)構(gòu)分析的準(zhǔn)確性;第二，菌群發(fā)酵纖維素過(guò)程中會(huì)在細(xì)胞外積 累大量的代謝產(chǎn)物，包括有機(jī)酸、有機(jī)醇和表面活性劑在內(nèi)的多種物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)對(duì)基因 組提取試劑產(chǎn)生一定的干擾，影響DNA的提取效果;第三，菌群既包含革蘭氏陰性菌又包含 革蘭氏陽(yáng)性菌，還存在著大量的孢子，增加了DNA提取的難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一種纖維素降解菌群宏基因組DNA的提取方法。
[0007] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:對(duì)纖維素分解菌群依次進(jìn)行菌體破壁、有機(jī)溶 液抽提DNA、異戊醇沉淀DNA和溶解DNA，得到宏基因組DNA;
[0008] 所述菌體破壁包括如下步驟：
[0009] (1)將纖維素分解菌群的菌體用高鹽溶液進(jìn)行高鹽洗滌，收集高鹽洗滌后菌體；
[0010] (2)將所述高鹽洗滌后菌體用溶菌酶裂解，得到溶菌酶裂解后產(chǎn)物；
[0011] (3)將所述溶菌酶裂解后產(chǎn)物用蛋白酶K酶解，得到蛋白酶K酶解后產(chǎn)物；
[0012] (4)勻漿所述蛋白酶K酶解后產(chǎn)物，收集勻漿產(chǎn)物的上清液。
[0013] 上述方法中，步驟(1)中，所述高鹽洗滌為將所述纖維素分解菌群的菌體與所述高 鹽溶液混勻，離心收集沉淀，得到洗滌后菌體；
[0014] 步驟(2)中，所述裂解為將所述洗滌后菌體和溶菌酶溶液混勻后加熱反應(yīng)，得到溶 菌酶裂解后產(chǎn)物；
[0015] 步驟(3)中，所述酶解為將所述溶菌酶裂解后產(chǎn)物和蛋白酶K溶液混勻后再次加熱 反應(yīng)，得到蛋白酶K酶解后產(chǎn)物；
[0016] 步驟(4)中，所述勻漿為將所述蛋白酶K酶解后產(chǎn)物、玻璃珠和交聯(lián)聚乙烯吡咯烷 酮溶液混合，得到混合產(chǎn)物，用勻漿器勻漿所述混合產(chǎn)物，得到勻漿產(chǎn)物;離心收集所述勻 漿產(chǎn)物，得到勻漿產(chǎn)物的上清。
[0017] 上述方法中，所述高鹽洗滌次數(shù)大于等于2。
[0018] 上述方法中，步驟（1)中，所述纖維素分解菌群的菌體與所述高鹽溶液等體積混 勻；
[0019] 步驟(2)中，所述洗滌后菌體和所述溶菌酶溶液中酶的配比為1 g: 7，000，000U;
[0020] 步驟(3)中，所述溶菌酶裂解后產(chǎn)物和所述蛋白酶K溶液中酶的配比為1 g: 3，900U;
[0021]步驟(4)中，所述蛋白酶K酶解后產(chǎn)物、玻璃珠和交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮溶液的配比 為lg:0.5g:lmL〇
[0022] 蛋白酶K酶活為39U/mg，Sigma公司，產(chǎn)品號(hào)為P6556(粉劑）。
[0023] 溶菌酶酶活為70，000U/mg，Sigma公司，產(chǎn)品號(hào)為62971 (粉劑）。
[0024] 上述方法中，所述加熱反應(yīng)的條件為30-40°C反應(yīng)15-60min;
[0025] 所述再次加熱處理為30-65 °C反應(yīng)15-60min;
[0026] 所述勻漿的條件為4-6m/s線速度勻漿2次，每次20-40s。
[0027] 上述方法中，所述高鹽溶液為濃度大于等于75.5g/l的KC1水溶液；
[0028] 所述高鹽洗滌后菌體和所述溶菌酶溶液的加料比為lg: 1ml;
[0029] 所述溶菌酶裂解后產(chǎn)物和所述蛋白酶K溶液的加料體積比為1:1;
[0030] 所述溶菌酶溶液由 5-15g/L 的 Na2HP〇4，l-5g/L 的 KH2P〇4,5-10g/L 的 NaCl，50-200g/ L的溶菌酶和水組成；
[0031]所述蛋白酶 K 溶液由 5-15g/L 的 Na2HP〇4，l_5g/L 的 KH2P〇4,5-10g/L 的 NaCl，50-200g/L的蛋白酶K和水組成。
[0032] 所述玻璃珠為直徑0.1mm玻璃珠、直徑0.5mm玻璃珠和1.0mm玻璃珠按照等體積混 勻得到的玻璃珠；
[0033]所述交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮溶液由質(zhì)量比體積為5-15 %的PVPP、質(zhì)量比體積為1 -5% 的SDS、10-100mMTris、10-100mM EDTA、10-200mMNaCl和水組成。
[0034]上述方法中，所述有機(jī)溶液抽提DNA為將所述勻漿產(chǎn)物的上清液與酚-氯仿-異戊 醇溶液混勻，得到混合液，離心收集所述混合液的水相；
[0035]所述異戊醇沉淀DNA為將所述水相與體積百分含量為50 %-70 %異戊醇水溶液混 勻，靜置，離心收集沉淀，得到異戊醇沉淀后DNA;
[0036]所述乙醇洗滌DNA為將所述異戊醇沉淀后DNA與體積百分含量為70%乙醇水溶液 混勻，離心收集沉淀，得到洗滌后DNA;
[0037] 所述溶解DNA為用溶解液溶解所述洗滌后DNA，得到宏基因組DNA。
[0038]上述方法中，所述勻漿產(chǎn)物的上清液和所述酚-氯仿-異戊醇溶液的體積比為1:1; [0039]所述水相和所述體積百分含量為50%_70%異戊醇水溶液的體積比為1:1;
[0040]所述異戊醇沉淀后DNA與所述體積百分含量為70%乙醇水溶液的體積倍為1:3-5。 [0041]上述方法中，所述酚-氯仿-異戊醇溶液為酚、氯仿、異戊醇按照體積比為25:24:1 混勻得到的溶液；
[0042]所述溶解液為水。
[0043] 和/或，所述離心的條件均為14,000g離心10min-30min;
[0044] 所述靜置的條件為-4_20°C靜置0.5_6h。
[0045] 上述方法中，所述纖維素降解菌群為穩(wěn)定降解木質(zhì)纖維素原料的天然纖維素降解 菌群。
[0046] 所述纖維素降解菌群的菌體為將纖維素降解菌群10%接種量接種在菌群富集培 養(yǎng)基，置于50°C靜置培養(yǎng)3天后，收集發(fā)酵產(chǎn)物中的沉淀即為纖維素降解菌群的菌體。
[0047]穩(wěn)定降解木質(zhì)纖維素原料的天然纖維素降解菌群為將木質(zhì)纖維素原料和菌群在 菌群富集培養(yǎng)基中發(fā)酵3天，檢測(cè)每天木質(zhì)纖維素原料降解率，若3天木質(zhì)纖維素原料降解 率基本不變，為穩(wěn)定降解木質(zhì)纖維素原料的天然纖維素降解菌群。
[0048]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明通過(guò)在提取前采用高鹽溶液進(jìn)行洗脫，并通過(guò)加入溶 菌酶和機(jī)械勻漿強(qiáng)化細(xì)胞破壁，并通過(guò)蛋白酶K破壁，不僅使微生物細(xì)胞壁更易破碎，DNA分 子更易釋放，同時(shí)有效保證了過(guò)程的可重復(fù)性，進(jìn)而保證了提取的宏基因組DNA片段完整 性、純度和菌群結(jié)構(gòu)完整性。本發(fā)明為天然纖維素利用菌群的研究和應(yīng)用，以及微生物分子 生態(tài)學(xué)研究提供了有效的技術(shù)支撐。
【附圖說(shuō)明】
[0049]圖1為采用T-RFLP技術(shù)比較不同提取方法獲得的宏基因組DNA多樣性。
【具體實(shí)施方式】
[0050] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0051] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0052]以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0053] 1L菌群富集培養(yǎng)基為5g蛋白胨，1.5g酵母粉，5g氯化鈉，2.5g碳酸f丐溶于1L水中， 加入l〇g的A.vicel?PH-101(Sigma公司，貨號(hào)為11365)^11采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)為8.0，1211€ 滅菌15min〇
[0054] 蛋白酶K:Sigma公司，產(chǎn)品號(hào)為P6556(粉劑），酶活為39U/mg。
[0055] 溶菌酶:Sigma公司，產(chǎn)品號(hào)為62971(粉劑），酶活為70,000U/mg。
[0056] 玻璃珠：Sigma公司，0.1mm產(chǎn)品號(hào)為G8893,0.5mm產(chǎn)品號(hào)為G9268，1.0mm產(chǎn)品號(hào)為 Z250473,5.0mm 產(chǎn)品號(hào)為 18406。
[0057] KC1 溶液為75.5g KC1 溶液 1L水中，121。(：滅菌 15min。
[0058] 溶菌酶溶液的pH值為7 ? 4，由 11 ? 65g/L的Na2HP〇4，1 ? 65g/L的KH2PO4，9g/L的NaCl， lOOg/L的溶菌酶和水組成，采用0.22mi無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
[0059] 蛋白酶1(溶液的？田直為7.4，由11.658/1的恥2冊(cè)〇4，1.658/1的詘屮〇4,98/1的恥(：1， l〇〇g/L的蛋白酶K和水組成，采用0.22mi無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。
[0060]玻璃珠的直徑為0.1111111、0.5111111、1.〇1111]1和5.〇111111，其中，直徑0.11111]1玻璃珠、直徑0.5111111 玻璃珠和1.0mm玻璃珠的體積比為1:1:1; 5.0mm每管加3個(gè)。
[00611 交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)溶液的pH為7.4，由10% (質(zhì)量體積比）的PVPP、2% (質(zhì) 量體積比）的 SDS、50mMTri s、50mM EDTA、1 OOmMNaCl 和水組成。
[0062]酚-氯仿-異戊醇溶液為酚、氯仿、異戊醇按照體積比為25:24:1混勻。
[0063] 快速組織勾衆(zhòng)機(jī)為Master Prep〇
[0064] 實(shí)施例1、纖維素降解菌群的宏基因組提取
[0065] 一、天然纖維素降解菌群的篩選
[0066] 1、纖維素降解菌群的選取
[0067] 將10g/L的木質(zhì)纖維素原料(Sigma公司Avicel?PH-101，貨號(hào)為11365)與5g在纖 維素富集地區(qū)采集的土壤樣品共同加入菌群富集培養(yǎng)基中，于30-65°C培養(yǎng)，通過(guò)連續(xù)傳代 培養(yǎng)，選擇轉(zhuǎn)化纖維素能力穩(wěn)定的菌群，即為穩(wěn)定降解木質(zhì)纖維素原料的菌群。
[0068] 轉(zhuǎn)化纖維素能力穩(wěn)定菌群的穩(wěn)定性衡量指標(biāo)為將木質(zhì)纖維素原料和菌群在菌群 富集培養(yǎng)基中發(fā)酵3天，檢測(cè)每天木質(zhì)纖維素原料降解率，若3天木質(zhì)纖維素原料降解率基 本不變，為轉(zhuǎn)化纖維素能力穩(wěn)定菌群。
[0069]木質(zhì)纖維素降解率計(jì)算方法:采用稱(chēng)重的離心管收集菌群發(fā)酵液，12,000g離心 5min;棄去上清后用與發(fā)酵液等體積3M的檸檬酸溶液重懸浮菌液，12，000g離心5min;棄去 上清后用與發(fā)酵液等體積2M的氫氧化鈉溶液重懸浮菌液，12,000g離心5min;棄去上清后采 用與發(fā)酵液等體積去離子水重復(fù)清洗3遍后，65°C烘干稱(chēng)重;離心管增重的體積即為殘留木 質(zhì)纖維素含量，木質(zhì)纖維素降解率計(jì)算公式為：
[0070]木質(zhì)纖維素降解率=(1-殘留木質(zhì)纖維素含量/發(fā)酵液中初始木質(zhì)纖維素含量)* 100%
[0071 ]木質(zhì)纖維素原料取自北方農(nóng)村，土壤樣品取自海南省五指山地區(qū)。
[0072] 2、纖維素降解菌群發(fā)酵液的制備
[0073]將上述1獲得的轉(zhuǎn)化纖維素能力穩(wěn)定菌群作為種子液，采用菌群富集培養(yǎng)基作為 培養(yǎng)基，10%接種量，置于50°C靜置培養(yǎng)3天后，收集發(fā)酵液體即為纖維素降解菌群發(fā)酵液。 [0074] 二、菌群宏基因組DNA提取
[0075] 1、菌群破壁
[0076] (1)取上述一的2獲得的轉(zhuǎn)化纖維素能力穩(wěn)定菌群發(fā)酵液5mL，14,000g離心收集菌 體后，加入等體積KC1溶液，漩渦震蕩洗脫菌體，1，000g離心后取沉淀，再向沉淀中加入等體 積KC1溶液，用2mL旋蓋離心管14,000〖離心1〇111；[11收集菌體；
[0077] (2)收集的菌體稱(chēng)重，按照l(shuí)g菌體7，000，000U的比例向收集的菌體加入溶菌酶溶 液(菌體和溶菌酶溶液加料體積比為lg: lml)，漩渦震蕩混勻，置于30°C水浴鍋處理60min， 得到溶菌酶裂解后產(chǎn)物；
[0078] (3)向溶菌酶裂解后產(chǎn)物中加入等體積的蛋白酶K溶液（lg: 3，900U)，漩渦震蕩混 勻，置于30 °C水浴鍋處理60min，得到蛋白酶K酶解后產(chǎn)物；
[0079] (4)向蛋白酶K酶解后產(chǎn)物中加入0.5g玻璃珠和lmL交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)溶 液，混合(蛋白酶K酶解后產(chǎn)物、玻璃珠和交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮溶液的配比為lg: 0.5g: lmL) 后用快速生物樣品勻質(zhì)器6m/s線速度處理兩次，每次40s，得到勻漿產(chǎn)物；用14,000g離心 30min，收集上清液，得到破壁處理后產(chǎn)物。
[0080] 2、有機(jī)溶液抽提
[0081] 向上述1的(4)獲得的破壁處理后產(chǎn)物中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇抽提液，漩 渦震蕩混勻，14，000g離心30min，收集上清液，即為水相。
[0082] 3、DNA沉淀、洗滌和溶解
[0083] (1)向上述2得到的水相中加入等體積的體積百分含量為70%異戊醇水溶液混 勾，-4 °C沉淀6h，14，000g離心15min收集沉淀；
[0084] (2)向（1)獲得的沉淀加入5倍體積百分含量為70 %的乙醇水溶液洗滌2次，14， 000g離心15min收集沉淀；
[0085] (3)晾干上述(2)沉淀用無(wú)菌水溶解，即實(shí)驗(yàn)組宏基因組DNA。
[0086]實(shí)施例2、采用現(xiàn)有試劑盒提取唾液樣品宏基因組DNA (對(duì)比例）
[0087] 對(duì)比例1、取消KC1溶液洗脫和溶菌酶強(qiáng)化破壁步驟提取宏基因組DNA [0088] 一、天然纖維素降解菌群的篩選 [0089] 1、纖維素降解菌群的選取
[0090] 將10g/L的木質(zhì)纖維素原料(Sigma公司Avicel?PH-101，貨號(hào)為11365)與5g在纖 維素富集地區(qū)采集的土壤樣品共同加入菌群富集培養(yǎng)基中，于30_65°C培養(yǎng)，通過(guò)連續(xù)傳代 培養(yǎng)，選擇轉(zhuǎn)化纖維素能力穩(wěn)定的菌群，即為穩(wěn)定降解木質(zhì)纖維素原料的菌群。
[0091] 轉(zhuǎn)化纖維素能力穩(wěn)定菌群的穩(wěn)定性衡量指標(biāo)為將木質(zhì)纖維素原料和菌群在菌群 富集培養(yǎng)基中發(fā)酵3天，檢測(cè)每天木質(zhì)纖維素原料降解率，若3天木質(zhì)纖維素原料降解率基 本不變，為轉(zhuǎn)化纖維素能力穩(wěn)定菌群。
[0092]木質(zhì)纖維素降解率計(jì)算方法:采用稱(chēng)重的離心管收集菌群發(fā)酵液，12,000g離心 5min;棄去上清后用與發(fā)酵液等體積3M的檸檬酸溶液重懸浮菌液，12，000g離心5min;棄去 上清后用與發(fā)酵液等體積2M的氫氧化鈉溶液重懸浮菌液，12,000g離心5min;棄去上清后采 用與發(fā)酵液等體積去離子水重復(fù)清洗3遍后，65°C烘干稱(chēng)重;離心管增重的體積即為殘留木 質(zhì)纖維素含量，木質(zhì)纖維素降解率計(jì)算公式為：
[0093]木質(zhì)纖維素降解率=(1_殘留木質(zhì)纖維素含量/發(fā)酵液中初始木質(zhì)纖維素含量)* 100%
[0094]木質(zhì)纖維素原料取自北方農(nóng)村，土壤樣品取自海南省五指山地區(qū)。
[0095] 2、纖維素降解菌群發(fā)酵液的制備
[0096]將上述1獲得的轉(zhuǎn)化纖維素能力穩(wěn)定菌群作為種子液，采用菌群富集培養(yǎng)基作為 培養(yǎng)基，10%接種量，置于50°C靜置培養(yǎng)3天后，收集發(fā)酵液體即為纖維素降解菌群發(fā)酵液。 [0097] 二、菌群宏基因組DNA提取 [0098] 1、菌群破壁
[0099] (1)取上述一的2獲得的轉(zhuǎn)化纖維素能力穩(wěn)定菌群發(fā)酵液5mL，14,000g離心收集菌 體后，按照1 g菌體3，900U的比例向收集的菌體加入蛋白酶K溶液，漩渦震蕩混勻，置于30 °C 水浴鍋處理60min，得到蛋白酶K酶解后產(chǎn)物；
[0100] (2)向蛋白酶K酶解后產(chǎn)物中加入0.5g玻璃珠和lmL交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)溶 液，混合(蛋白酶K酶解后產(chǎn)物、玻璃珠和交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮溶液的配比為lg: 0.5g: lmL) 后用快速生物樣品勻質(zhì)器6m/s線速度處理兩次，每次40s，得到勻漿產(chǎn)物；用14,000g離心 30min，收集上清液，得到破壁處理后產(chǎn)物。
[0101] 2、有機(jī)溶液抽提
[0102] 向上述1的(4)獲得的破壁處理后產(chǎn)物中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇抽提液，漩 渦震蕩混勻，14，000g離心30min，收集上清液，即為水相。
[0103] 3、DNA沉淀、洗滌和溶解
[0104] (1)向上述2得到的水相中加入等體積的體積百分含量為70%異戊醇水溶液混 勾，-4 °C沉淀6h，14，000g離心15min收集沉淀；
[0105] (2)向（1)獲得的沉淀加入5倍體積百分含量為70 %的乙醇水溶液洗滌2次，14， 000g離心15min收集沉淀；
[0106] (3)晾干上述(2)沉淀用無(wú)菌水溶解，即實(shí)驗(yàn)組宏基因組DNA。
[0107] 對(duì)比例2、取消KC1溶液洗脫步驟提取宏基因組DNA
[0108] -、天然纖維素降解菌群的篩選
[0109] 1、纖維素降解菌群的選取
[0110] 將l〇g/L的木質(zhì)纖維素原料(Sigma公司Avicel?PH-101，貨號(hào)為11365)與5g在纖 維素富集地區(qū)采集的土壤樣品共同加入菌群富集培養(yǎng)基中，于30_65°C培養(yǎng)，通過(guò)連續(xù)傳代 培養(yǎng)，選擇轉(zhuǎn)化纖維素能力穩(wěn)定的菌群，即為穩(wěn)定降解木質(zhì)纖維素原料的菌群。
[0111] 轉(zhuǎn)化纖維素能力穩(wěn)定菌群的穩(wěn)定性衡量指標(biāo)為將木質(zhì)纖維素原料和菌群在菌群 富集培養(yǎng)基中發(fā)酵3天，檢測(cè)每天木質(zhì)纖維素原料降解率，若3天木質(zhì)纖維素原料降解率基 本不變，為轉(zhuǎn)化纖維素能力穩(wěn)定菌群。
[0112] 木質(zhì)纖維素降解率計(jì)算方法:采用稱(chēng)重的離心管收集菌群發(fā)酵液，12,000g離心 5min;棄去上清后用與發(fā)酵液等體積3M的檸檬酸溶液重懸浮菌液，12，000g離心5min;棄去 上清后用與發(fā)酵液等體積2M的氫氧化鈉溶液重懸浮菌液，12,000g離心5min;棄去上清后采 用與發(fā)酵液等體積去離子水重復(fù)清洗3遍后，65°C烘干稱(chēng)重;離心管增重的體積即為殘留木 質(zhì)纖維素含量，木質(zhì)纖維素降解率計(jì)算公式為：
[0113] 木質(zhì)纖維素降解率=(1-殘留木質(zhì)纖維素含量/發(fā)酵液中初始木質(zhì)纖維素含量)* 100%
[0114]木質(zhì)纖維素原料取自北方農(nóng)村，土壤樣品取自海南省五指山地區(qū)。
[0115] 2、纖維素降解菌群發(fā)酵液的制備
[0116] 將上述1獲得的轉(zhuǎn)化纖維素能力穩(wěn)定菌群作為種子液，采用菌群富集培養(yǎng)基作為 培養(yǎng)基，10%接種量，置于50°C靜置培養(yǎng)3天后，收集發(fā)酵液體即為纖維素降解菌群發(fā)酵液。
[0117] 二、菌群宏基因組DNA提取
[0118] 1、菌群破壁
[0119] (1)取上述一的2獲得的轉(zhuǎn)化纖維素能力穩(wěn)定菌群發(fā)酵液5mL，14,000g離心收集菌 體后，按照l(shuí)g菌體7，000，000U的比例向收集的菌體加入溶菌酶溶液，漩渦震蕩混勻，置于30 °C水浴鍋處理60min，得到溶菌酶裂解后產(chǎn)物；
[0120] (2)向溶菌酶裂解后產(chǎn)物中加入等體積的蛋白酶K溶液，漩渦震蕩混勻，置于30°C 水浴鍋處理60min，得到蛋白酶K酶解后產(chǎn)物；
[0121] (3)向蛋白酶K酶解后產(chǎn)物中加入0.5g玻璃珠和lmL交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)溶 液，混合(蛋白酶K酶解后產(chǎn)物、玻璃珠和交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮溶液的配比為lg: 0.5g: lmL) 后用快速生物樣品勻質(zhì)器6m/s線速度處理兩次，每次40s，得到勻漿產(chǎn)物；用14,000g離心 30min，收集上清液，得到破壁處理后產(chǎn)物。
[0122] 2、有機(jī)溶液抽提
[0123] 向上述1的(4)獲得的破壁處理后產(chǎn)物中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇抽提液，漩 渦震蕩混勻，14，000g離心30min，收集上清液，即為水相。
[0124] 3、DNA沉淀、洗滌和溶解
[0125] (1)向上述2得到的水相中加入等體積的體積百分含量為70%異戊醇水溶液混 勾，-4 °C沉淀6h，14，000g離心15min收集沉淀；
[0126] (2)向（1)獲得的沉淀加入5倍體積百分含量為70 %的乙醇水溶液洗滌2次，14， 000g離心15min收集沉淀；
[0127] (3)晾干上述(2)沉淀用無(wú)菌水溶解，即實(shí)驗(yàn)組宏基因組DNA。
[0128] 對(duì)比例3、現(xiàn)有方法提取
[0129] 將實(shí)施例1的一獲得的纖維素降解菌群發(fā)酵液采用購(gòu)自M P公司的 Fas tDNASo i lDNAKi t試劑盒進(jìn)行宏基因組DNA提取，得到對(duì)照組宏基因組DNA。
[0130] 操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。
[0131] 實(shí)施例4、實(shí)施例1與實(shí)施例2提取的宏基因組DNA比較
[0132] 1、濃度與純度檢測(cè)
[0133] 米用Nanodrop(賽默飛世爾科技，型號(hào)Nanodrop 2000c)分別測(cè)定實(shí)施例1與實(shí)施 例2提取的宏基因組DNA濃度與純度（以0D 260/280表示），如表1所示，并采用瓊脂糖電泳檢 測(cè)DNA濃度和完整度。
[0134]表1為提取DNA濃度與純度比較
[0136] 由表1可知，本發(fā)明提供的方法提取天然纖維素利用菌群宏基因組DNA相較于試劑 盒方法獲得的宏基因組DNA在濃度和純度方面均有顯著地提升。
[0137] 2、電泳檢測(cè)
[0138] 分別取實(shí)施例1與實(shí)施例2提取的宏基因組DNA為模板，采用Hot-start ExTaq(購(gòu) 自 Takara，寶生物工程(大連)有限公司）以6-FAM-8F(5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '）作為 正向引物，926R(5 ' -CCGTCAAITCCTTTRAGTIT-3 '）作為反向引物，進(jìn)行Touchdown PCR〇
[0139] PCR程序:94°C首先預(yù)變性3分鐘；之后為20個(gè)梯度降溫循環(huán)，94°C變性30秒后，退 火溫度從65°C每循環(huán)下降0.5°C至56°C，持續(xù)30秒，72°C延伸30秒;再94°C變性30秒，55°C退 火30秒，72°C延伸30秒，10個(gè)循環(huán);最后72°C延伸10分鐘。
[0140] 將PCR產(chǎn)物稀釋為相同濃度，采用Hha I和Hae III限制性內(nèi)切酶(購(gòu)自Takara，寶 生物工程(大連)有限公司）按照酶操作說(shuō)明書(shū)對(duì)樣品避光進(jìn)行酶切，酶切后產(chǎn)物分別采用 瓊脂糖電泳和ABI-3730測(cè)序儀進(jìn)行熒光信號(hào)和長(zhǎng)度分析。
[0141]結(jié)果如圖1所示，A為瓊脂糖電泳結(jié)果;B為ABI-3730測(cè)序儀檢測(cè)結(jié)果，1為實(shí)施例2 對(duì)照方法提取的宏基因組DNA(條帶1為實(shí)施例1方法提取的DNA，2-4為實(shí)施例2中的對(duì)比例 1-3提取方法提取的DNA)，2為實(shí)施例1本發(fā)明方法提取的宏基因組DNA(序號(hào)1為實(shí)施例1方 法提取DNA的檢測(cè)結(jié)果，2-4為實(shí)施例2中的三種對(duì)比例提取方法提取DNA的檢測(cè)結(jié)果）；可以 看出，本發(fā)明提供的方法提取獲得的天然纖維素利用菌群宏基因組DNA相較于試劑盒方法、 以及未采用本方法組合破壁強(qiáng)化處理方法，一方面提取的DNA濃度更高且碎片更少，另一方 面在保留菌群組成多樣性方面有著顯著地提升，能夠更真實(shí)的反映菌群的結(jié)構(gòu)信息。因此， 本發(fā)明提供的方法更適用于天然纖維素降解菌群的宏基因組DNA提取。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種纖維素降解菌群宏基因組DNA的提取方法，包括如下步驟:對(duì)纖維素分解菌群依 次進(jìn)行菌體破壁、有機(jī)溶液抽提DNA、異戊醇沉淀DNA和溶解DNA，得到宏基因組DNA; 所述菌體破壁包括如下步驟： (1) 將所述纖維素分解菌群的菌體用高鹽溶液進(jìn)行高鹽洗滌，收集高鹽洗滌后菌體； (2) 將所述高鹽洗滌后菌體用溶菌酶裂解，得到溶菌酶裂解后產(chǎn)物； (3) 將所述溶菌酶裂解后產(chǎn)物用蛋白酶K酶解，得到蛋白酶K酶解后產(chǎn)物； (4) 勻漿所述蛋白酶K酶解后產(chǎn)物，收集勻漿產(chǎn)物的上清液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于： 步驟（1)中，所述高鹽洗滌為將所述纖維素分解菌群的菌體與所述高鹽溶液混勻，離心 收集沉淀，得到洗滌后菌體； 步驟(2)中，所述裂解為將所述高鹽洗滌后菌體和溶菌酶溶液混勻，加熱反應(yīng)，得到溶 菌酶裂解后產(chǎn)物； 步驟(3)中，所述酶解為將所述溶菌酶裂解后產(chǎn)物和蛋白酶K溶液混勻，再次加熱反應(yīng)， 得到蛋白酶K酶解后產(chǎn)物； 步驟(4)中，所述勻漿為先將所述蛋白酶K酶解后產(chǎn)物、玻璃珠和交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮 溶液混合，得到混合產(chǎn)物，再用勻漿器勻漿所述混合產(chǎn)物，得到勻漿產(chǎn)物;離心收集所述勻 漿產(chǎn)物，得到勻漿產(chǎn)物的上清。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于： 所述高鹽洗滌次數(shù)大于等于2。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于： 步驟(1)中，所述纖維素分解菌群的菌體與所述高鹽溶液等體積混勻； 步驟(2)中，所述高鹽洗滌后菌體和所述溶菌酶溶液中酶的配比為lg: 7000，000U; 步驟(3)中，所述溶菌酶裂解后產(chǎn)物和所述蛋白酶K溶液中酶的配比為lg: 3900U; 步驟(4)中，所述蛋白酶K酶解后產(chǎn)物、所述玻璃珠和所述交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮溶液的 加料配比為lg:〇. 5g: lmL。5. 根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于： 所述加熱反應(yīng)的條件為30-40°C反應(yīng)15-60min; 所述再次加熱處理為30_65°C反應(yīng)15-60min; 所述勻漿的條件為4-6m/s線速度勻漿2次，每次20-40s。6. 根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于： 所述高鹽溶液為濃度大于等于75.5g/l的KC1水溶液； 所述高鹽洗滌后菌體和所述溶菌酶溶液的加料比為lg: lml; 所述溶菌酶裂解后產(chǎn)物和所述蛋白酶K溶液的加料體積比為1:1; 所述溶菌酶溶液由 5-15g/L 的 Na2HP〇4、l_5g/L 的 KH2P〇4、5-10g/L 的 NaCl、50-200g/L 的溶 菌酶和水組成； 所述蛋白酶 K 溶液由 5-15g/L 的 Na2HP〇4、l_5g/L 的 KH2P〇4、5-10g/L 的 NaCl、50-200g/L 的 蛋白酶K和水組成； 所述玻璃珠由直徑〇 . 1mm玻璃珠、直徑0.5mm玻璃珠和1.0mm玻璃珠按照等體積混勻得 到； 所述交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮溶液由質(zhì)量比體積為5-15%的PVPP、質(zhì)量比體積為1-5%的 SDS、10-100mMTris、10-100mM EDTA、10-200mMNaCl和水組成。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于： 所述有機(jī)溶液抽提DNA為將所述勻漿產(chǎn)物的上清液與酚-氯仿-異戊醇溶液混勻，得到 混合液，離心收集所述混合液的水相； 所述異戊醇沉淀DNA為將所述水相與體積百分含量為50%-70%異戊醇水溶液混勻，靜 置，離心收集沉淀，得到異戊醇沉淀后DNA; 所述乙醇洗滌DNA為將所述異戊醇沉淀后DNA與體積百分含量為70%乙醇水溶液混勻， 離心收集沉淀，得到洗滌后DNA; 所述溶解DNA為用溶解液溶解所述洗滌后DNA，得到宏基因組DNA。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于： 所述勻漿產(chǎn)物的上清液和所述酚-氯仿-異戊醇溶液的體積比為1:1; 所述水相和所述體積百分含量為50%_70%異戊醇水溶液的體積比為1:1; 所述異戊醇沉淀后DNA與所述體積百分含量為70%乙醇水溶液的體積倍為1:3-5。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于： 所述酚-氯仿-異戊醇溶液為酚、氯仿、異戊醇按照體積比為25:24:1混勻得到的溶液； 所述溶解液為水； 和/或，所述離心的條件均為14000g離心10min_30min; 所述靜置的條件為-4°C-(-20°C)靜置0.5-6h。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于： 所述纖維素降解菌群為穩(wěn)定降解木質(zhì)纖維素原料的天然纖維素降解菌群。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK105821033SQ201610307905
【公開(kāi)日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年5月11日
【發(fā)明人】閆建斌, 杜然
【申請(qǐng)人】清華大學(xué)