一種蚯蚓腸道微生物總dna的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蚯蚓腸道微生物總DNA的提取方法，該提取方法一方面以蚯蚓新鮮糞便為樣品，并對樣品進行前處理，一方面將蛋白酶K(消化)與土壤DNA提取試劑盒聯(lián)用，從而使本發(fā)明提取方法解決了現(xiàn)有方法無法克服泥沙干擾，造成的蚯蚓腸道微生物總DNA提取效率低的問題；本發(fā)明提取方法大大提高了蚯蚓腸道微生物總DNA的提取效率和提取質(zhì)量，采用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的總DNA條帶明亮清晰，從而能夠更加準(zhǔn)確全面反應(yīng)蚯蚓腸道內(nèi)微生物的狀況，為后續(xù)微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的研究奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種蚯蚓腸道微生物總DNA的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種蚯蚓腸道微生物總DNA的提取方法，屬于生物技術(shù)科學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于農(nóng)業(yè)中化肥和農(nóng)藥的不合理使用，以及工業(yè)污染的排放，使得土壤污染成為 我國越來越嚴(yán)重的環(huán)境問題。蚯蚓作為土壤動物最常見一大類群，是土壤污染檢測重要的 生物標(biāo)志物，同時也是土壤生物修復(fù)的重要的動物。作為重要的是生態(tài)系統(tǒng)分解者，蚯蚓對 土壤中有機物的消化分解的能力是生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的有力保障，蚯蚓腸道的獨特微生物 群落在此過程中扮演著重要的角色。蚯蚓腸道微生物的研究過程中，微生物總DNA的提取顯 得尤為重要。然而蚯蚓腸道含有大量的泥沙，嚴(yán)重影響了微生物總DNA的提取效率。目前很 少有研究提取蚯蚓腸道微生物總DNA的方法，而且常采用提取糞便專用試劑盒，例如： QIAamp背DNA Stool Mini Kit，Qiagen等，這些方法并不能克服4丘蝴腸道中大量泥沙帶來 的干擾，提取效率低下。如何克服樣品中大量泥沙帶來的干擾，提高蚯蚓腸道微生物總DNA 提取效率重要保障。因此一種能夠有效解決泥沙帶來干擾的蚯蚓腸道微生物總DNA提取方 法的開發(fā)很有必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種蚯蚓腸道微生物總DNA的提取 方法，該提取方法能夠有效解決泥沙對蚯蚓腸道微生物總DNA提取效率帶來的干擾。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[0005] -種蚯蚓腸道微生物總DNA的提取方法，包括如下步驟：
[0006] 步驟1，提取某條實驗蚯蚓的新鮮糞便，冷凍儲存;將該實驗蚯蚓放回其原生長環(huán) 境12小時后，再次提取其新鮮糞便，將前后兩次提取的糞便混合，并于4°C下冷凍儲存；
[0007] 步驟2，往0.1~0.5g蚯蚓新鮮糞便(冷凍儲存不超過24小時的糞便）中依次加入20 yL蛋白酶K和100~200yL緩沖液，混合均勻后于56 °C下水浴加熱，加熱后得到液相A;
[0008] 步驟3,將步驟2的液相A使用土壤基因組DNA提取試劑盒進行DNA的提取，得到蚯蚓 腸道微生物總DNA;
[0009] 步驟4,使用微量紫外可見分光光度計，進行DNA含量的測定；
[0010] 步驟5,使用質(zhì)量百分濃度為1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測得到蚯蚓腸道微生物總 DNA的質(zhì)量。
[0011] 其中，步驟2中，所述緩沖液的配方為：每1L緩沖液中，含有137mmol氯化鈉、 2.7mmol氯化鉀、lOmmol磷酸氫二鉀以及2mmol磷酸二氫鉀。
[0012]其中，步驟2中，所述緩沖液的pH值為7.4。
[0013]其中，步驟2中，所述水浴加熱的時間為60分鐘。
[0014]相比于現(xiàn)有的蚯蚓腸道微生物總DNA的提取方法，本發(fā)明的蚯蚓腸道微生物總DNA 提取方法具有的有益效果為：
[0015] 首先，本發(fā)明取樣兩次且均采用無損傷取樣，增加了樣品量；
[0016] 其次，蛋白酶K(消化)與土壤DNA提取試劑盒聯(lián)用的方法克服了樣品中大量泥沙對 蚯蚓腸道微生物總DNA提取帶來的干擾，本發(fā)明腸道微生物總DNA提取效率提高了一倍以 上；
[0017]最后，本發(fā)明提取方法大大提高了蚯蚓腸道微生物總DNA的提取效率和提取質(zhì)量， 采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的總DNA條帶明亮清晰，從而能夠更加準(zhǔn)確全面反應(yīng)蚯蚓 腸道內(nèi)微生物的狀況，為后續(xù)微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的研究奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明實施例1和對比實施例得到的蚯蚓腸道微生物總DNA條帶對比效果 圖。
【具體實施方式】
[0019] 以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明。
[0020] 實施例1
[0021] 本發(fā)明蚯蚓腸道微生物總DNA的提取方法，包括如下步驟：
[0022] 步驟1，將某條實驗蚯蚓放置于潔凈的濾紙上，收集蚯蚓新鮮的糞便，并置于4°C下 冷凍儲存；
[0023] 步驟2,將該條蚯蚓放回原生長環(huán)境12小時后，再次將其放置于潔凈的濾紙上，收 集其新鮮的糞便;將前后兩次提取的糞便混合并置于4°C下冷凍儲存；
[0024] 步驟3,取蚯蚓新鮮糞便(冷凍儲存不超過24小時的糞便)0.2g置于離心管中，加入 20此蛋白酶K和100此緩沖液，并使用振蕩器振蕩2分鐘混勻，混合均勻后于56 °C下水浴加熱 60分鐘，得到液相A;
[0025] 步驟4,將液相A使用土壤DNA提取試劑盒（FasiDNAK.Spin Kit for Soil試劑盒） 進行DNA的提取，得到蚯蚓腸道微生物總DNA;
[0026] 步驟5,使用微量紫外可見分光光度計(Nanodrop 2000)，進行DNA含量的測定；
[0027]步驟6,使用質(zhì)量百分濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測得到微生物總DNA的質(zhì)量。
[0028]本發(fā)明提取方法中所使用緩沖液配方為：每1L緩沖液中，含有137mmol氯化鈉、 2.7mmol氯化鉀、lOmmol磷酸氫二鉀以及2mmol磷酸二氫鉀。使用該緩沖液時，采用濃鹽酸將 緩沖液的PH值調(diào)節(jié)至7.4。
[0029] 實施例1得到的蚯蚓腸道微生物總DNA濃度為183.4ng/yL，260/280為1.87。
[0030] 對比實施例
[0031]現(xiàn)有技術(shù)中蚯蚓腸道微生物總DNA的提取方法，包括如下步驟：
[0032]步驟1，取蚯蚓解剖獲得蚯蚓糞便；
[0033] 步驟2,取蚯蚓糞便0.2g，使用QIA勸p?DNA Stool Mini Kit試劑盒進行DNA的提 取，得到蚯蚓腸道微生物總DNA;
[0034] 步驟3,使用Nanodrop 2000,進行DNA含量的測定；
[0035]步驟4:使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的蚯蚓腸道微生物總DNA的質(zhì)量。
[0036] 對比實施例得到的蚯蚓腸道微生物總DNA濃度為73.3ng/yL，260/280為1.57。
[0037] 圖1為實施例1和對比實施例得到的蚯蚓腸道微生物總DNA的1%瓊脂糖凝膠電泳 圖，如圖1所示，實施例1的蚯蚓腸道微生物總DNA條帶明亮清晰，對比實施例的蚯蚓腸道微 生物總DNA條帶暗淡模糊。
[0038] 本發(fā)明提取方法解決了現(xiàn)有方法無法克服泥沙的干擾，造成蚯蚓腸道微生物總 DNA提取效率低的問題，本發(fā)明方法以蚯蚓新鮮糞便為樣品，先進行樣品的前處理，再采用 土壤提取試劑盒FastDNAK.Spin Kit for Soil進行蚯蚓腸道微生物總DNA的提取，提取效 率高，且采用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的總DNA條帶明亮清晰。
[0039]顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的 實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其 它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā) 明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。
【主權(quán)項】
1. 一種蚯蚓腸道微生物總DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟1，提取某條實驗蚯蚓的新鮮糞便，冷凍儲存;將該實驗蚯蚓放回其原生長環(huán)境12 小時后，再次提取其新鮮糞便，將前后兩次提取的糞便混合，并于4°C下冷凍儲存； 步驟2，往0.1~0.5g蚯蚓新鮮糞便中依次加入20yL蛋白酶K和100~200yL緩沖液，混合 均勻后于56 °C下水浴加熱，加熱后得到液相A; 步驟3,將步驟3的液相A使用土壤基因組DNA提取試劑盒進行DNA的提取，得到蚯蚓腸道 微生物總DNA; 步驟4，使用微量紫外可見分光光度計，進行DNA含量的測定； 步驟5,使用質(zhì)量百分濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測得到蚯蚓腸道微生物總DNA的 質(zhì)量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蚯蚓腸道微生物總DNA的提取方法，其特征在于:步驟2中，所 述緩沖液的配方為:每1L緩沖液中，含有137mmo 1氯化鈉、2.7mmo 1氯化鉀、1 Ommo 1磷酸氫二 鉀以及2mmol磷酸二氫鉀。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蚯蚓腸道微生物總DNA的提取方法，其特征在于:步驟2中，所 述緩沖液的pH值為7.4。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蚯蚓腸道微生物總DNA的提取方法，其特征在于:步驟2中，所 述水浴加熱的時間為60分鐘。
【文檔編號】C12N15/10GK105821036SQ201610389986
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】吳兵, 尹金寶, 張徐祥, 劉蘇
【申請人】南京大學(xué)