Amsh基因突變體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了AMSH基因突變體及其應(yīng)用，具體涉及分離的編碼AMSH突變體的核酸，分離的多肽，篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的方法，篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的系統(tǒng)，以及用于篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的試劑盒。其中，該分離的編碼AMSH突變體的核酸，與SEQ ID NO：1相比，具有c.364A>G突變。通過(guò)檢測(cè)該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易患腓骨肌萎縮癥。
【專利說(shuō)明】
AMSH基因突變體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及AMSH基因突變體及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及分離編碼AMSH突變 體的核酸、分離的多肽、篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的系統(tǒng)、用于篩選易患腓骨肌萎 縮癥的生物樣品的試劑盒、構(gòu)建體、重組細(xì)胞以及構(gòu)建藥物篩選模型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腓骨肌萎縮癥（Charcot-Marie-Tooth Disease, CMT)，又稱遺傳性運(yùn)動(dòng)感覺(jué)神經(jīng) ?。╤ereditary motor and sensory neuropathy, HMSN)。CMT 是一組最常見(jiàn)的具有高度 臨床和遺傳異質(zhì)性的周圍神經(jīng)單基因遺傳病，主要影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和/或感覺(jué)神經(jīng)元以及 相關(guān)的Schwann cells。根據(jù)電生理標(biāo)準(zhǔn)，CMT主要分為兩類：脫髓鞘型（CMT1)和軸突型 (CMT2)。CMT2又可分為14個(gè)亞型（CMT2A-CMT2N)。CMT患病率大概為1/2500,而CMT2A占 所有CMT病人的20-40 %。其中，CMT2A主要表現(xiàn)為遠(yuǎn)端肢體肌肉無(wú)力和/或萎縮，肢體遠(yuǎn)端 感覺(jué)喪失。后期手部出現(xiàn)骨間肌，大、小魚際肌萎縮、形成猿手畸形、但萎縮一般不超過(guò)肘關(guān) 節(jié)以上，腿部的損傷先從腓腸肌開始，后逐漸擴(kuò)展至骨間肌，小腿屈肌、最后累及大腿下1/3 肌肉，但其上部完全正常，形成"鶴腿"或倒置的酒瓶樣畸形，因足背屈無(wú)力常呈馬蹄內(nèi)翻畸 形。本病可影響患者運(yùn)動(dòng)功能，難以進(jìn)行精細(xì)的手指活動(dòng)。嚴(yán)重患者需使用膝-踝-足矯 正器或輪椅。本病預(yù)后一般較好，病程進(jìn)展緩慢，發(fā)病后仍能存活數(shù)十年。
[0003] 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MFN2、KIF1B基因的突變與CMT2A發(fā)病相關(guān)，但是仍有許多患者病因 未明，其他基因的突變可能也是導(dǎo)致該疾病的病因。因而，目前對(duì)腓骨肌萎縮癥尤其是其致 病基因的研究仍有待深入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的 在于提出一種能夠有效篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的手段。
[0005] 本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列工作完成的：
[0006] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，目前的致病基因和致病突變挖掘的研究中，多使用全外顯子組測(cè)序 法。全外顯子組測(cè)序是利用特制的DNA序列探針將全基因組中的外顯子區(qū)域捕獲下來(lái)，然 后針對(duì)每個(gè)外顯子進(jìn)行深度測(cè)序的技術(shù)。利用外顯子組測(cè)序找出孟德?tīng)栠z傳病致病基因的 案例很多，比如2009年美國(guó)Sarah B Ng等人利用外顯子組測(cè)序成功定位出mile綜合癥的 基因 DH0DH (可參見(jiàn)：Ki jima, K.，et al. , Mitochondrial GTPase mitofusin 2mutation in Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A. Hum Genet, 2005. 116 (1-2): 23-27?，通過(guò)參照 將其全文并入本文）。我國(guó)Wang等人利用外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了小腦共濟(jì)失調(diào)的新的突變 基因 TGM6(可參見(jiàn)：Zhao，C.，et al.，Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIFIBbeta. Cell, 2001. 105(5):587-597.，通過(guò)參照將 其全文并入本文）。隨著外顯子組測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用和日漸成熟，一批新的致病基因（突 變）被相繼發(fā)現(xiàn)，極大地推動(dòng)了相關(guān)疾病診斷及治療的研究進(jìn)展。
[0007] 因而，發(fā)明人針對(duì)收集的一個(gè)五代CMT2A患者家系，通過(guò)外顯子組測(cè)序、連鎖分析 聯(lián)合Sanger測(cè)序驗(yàn)證的方法進(jìn)行致病突變挖掘和驗(yàn)證，最終確定了腓骨肌萎縮癥的一個(gè) 新的致病基因--AMSH基因，以及其上的致病突變c. 364A>G突變。
[0008] 進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼AMSH突變體的核 酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述核酸與SEQ ID N0:1相比，具有c. 364A>G突變，即相對(duì)于野 生型AMSH基因，本發(fā)明的AMSH基因突變體的cDNA序列第364位堿基A突變?yōu)镚。根據(jù)本 發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)明人確定了 AMSH基因的突變體，該突變體與腓骨肌萎縮癥的發(fā)病密切相 關(guān)，從而通過(guò)檢測(cè)該突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易患腓 骨肌萎縮癥。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，與 SEQ ID N0:2相比，所述分離的多肽具有P.N122D突變，即該突變是由于c. 364A>G突變而 引起的，具體地，相對(duì)于野生型AMSH，本發(fā)明的分離的多肽（即AMSH突變體）的氨基酸序列 第122位氨基酸天冬酰胺突變?yōu)樘於彼帷Ｍㄟ^(guò)檢測(cè)生物樣品中是否表達(dá)該多肽，可以有 效地檢測(cè)生物樣品是否易患腓骨肌萎縮癥。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的 系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該系統(tǒng)包括：核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生 物樣品提取核酸樣本；核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相 連，用于對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列；判斷裝置，所述判 斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列或其互補(bǔ)序列， 與SEQ ID N0:1相比，是否具有c.364A>G突變，判斷所述生物樣品是否易患腓骨肌萎縮癥。 利用該系統(tǒng)，能夠有效地篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種用于篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣 品的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒含有：適于檢測(cè)AMSH基因突變體的試劑，其中 與SEQ ID N0:1相比，該AMSH基因突變體具有c. 364A>G突變。利用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例 的試劑盒，能夠有效地篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該構(gòu) 建體包含前面所述的分離的編碼AMSH突變體的核酸。由此，利用本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體 細(xì)胞獲得的重組細(xì)胞，能夠有效地用于篩選治療腓骨肌萎縮癥的藥物。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明還提出了一種重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該 重組細(xì)胞是通過(guò)前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞而獲得的。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，利 用本發(fā)明的重組細(xì)胞，能夠有效地篩選治療腓骨肌萎縮癥的藥物。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建藥物篩選模型的方法。根據(jù)本 發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：使動(dòng)物的至少一部分細(xì)胞表達(dá)前面所述的編碼AMSH突變體的 核酸。由此，利用本發(fā)明的藥物篩選模型，能夠有效地篩選治療腓骨肌萎縮癥的藥物。
[0015] 需要說(shuō)明的是，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的CMT2A的一個(gè)新致病基因AMSH的致病突變 c. 364A>G，可以用于早期篩查CMT2A致病突變攜帶者，進(jìn)而在攜帶者發(fā)病之前進(jìn)行早期干 預(yù)治療；也可用于CMT2A的分子診斷及與相關(guān)疾病的的鑒別診斷，并且快速、準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn) 便、早期診斷率高，檢測(cè)結(jié)果可以為腓骨肌萎縮癥的早期診斷、鑒別診斷及開發(fā)腓骨肌萎縮 癥治療藥物提供科學(xué)依據(jù)。
[0016] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中：
[0018] 圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的系統(tǒng)及其 組成部分的示意圖，其中，
[0019] 圖II為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的系統(tǒng)的示意 圖，
[0020] 圖III為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的核酸提取裝置的示意圖，
[0021] 圖1III為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的核酸序列確定裝置的示意圖；
[0022] 圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的腓骨肌萎縮癥患者家系的家系圖；
[0023] 圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，圖2所示腓骨肌萎縮癥患者家系中健康成 員和先證者，以及家系外正常人的AMSH基因c. 364A>G突變位點(diǎn)的代表性Sanger測(cè)序驗(yàn)證 峰圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過(guò)參考附 圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0025] AMSH基因突變體
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼AMSH突變體的核酸。根據(jù) 本發(fā)明的實(shí)施例，所述核酸與SEQ ID N0 :1相比，具有c. 364A>G突變。
[0027] 在本文中所使用的表達(dá)方式"編碼AMSH突變體的核酸"，是指與編碼AMSH突變體 的基因相對(duì)應(yīng)的核酸物質(zhì)，即核酸的類型不受特別限制，可以是任何包含與AMSH突變體的 編碼基因相對(duì)應(yīng)的脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或 cDNA。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體示例，前面所述的編碼AMSH突變體的核酸為DNA。根據(jù)本發(fā)明 的實(shí)施例，發(fā)明人確定了 AMSH基因的突變體，該突變體與腓骨肌萎縮癥的發(fā)病密切相關(guān)， 從而通過(guò)檢測(cè)該突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易患腓骨肌 萎縮癥，也可以通過(guò)檢測(cè)該突變體在生物體中是否存在，可以有效地預(yù)測(cè)生物體是否易患 腓骨肌萎縮癥。
[0028] 對(duì)于本發(fā)明說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，提及核酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，實(shí)際包 括互補(bǔ)雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，雖然多數(shù)情況 下只給出了一條鏈，但實(shí)際上也公開了與之互補(bǔ)的另一條鏈。例如，提及SEQ ID N0 :1，實(shí)際 包括其互補(bǔ)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測(cè)另一條鏈，反之亦然。
[0029] 該編碼AMSH突變體的核酸，是本申請(qǐng)的發(fā)明人通過(guò)外顯子組測(cè)序、連鎖分析聯(lián)合 Sanger測(cè)序驗(yàn)證的方法確定的腓骨肌萎縮癥的致病基因AMSH的新的致病突變。該致病突 變位點(diǎn)在現(xiàn)有技術(shù)中并未被提到。
[0030] 其中，野生型AMSH基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列：
[0032] 其編碼的蛋白質(zhì)具有如下所示的氨基酸序列：
[0034] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的AMSH基因突變體與SEQ ID N0:1相比，具有c. 364A>G突變，即相對(duì) 于野生型AMSH基因，本發(fā)明的AMSH基因突變體的cDNA序列第364位堿基A突變?yōu)镚。由 此，其所編碼的產(chǎn)物與野生型的AMSH相比，具有p. N122D突變，即該突變是由于c. 364A>G 突變而引起的，具體地，相對(duì)于野生型AMSH，本發(fā)明的分離的多肽（即AMSH突變體）的氨基 酸序列第122位氨基酸天冬酰胺突變?yōu)樘於彼帷?br>[0035] 目前，尚未見(jiàn)AMSH基因?yàn)殡韫羌∥s癥的致病基因，AMSH基因的c. 364A>G突變 為腓骨肌萎縮癥的致病突變的相關(guān)報(bào)道。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，與 野生型AMSH相比，該分離的多肽具有p. N122D突變，即該突變是由于c. 364A>G突變而引起 的，具體地，相對(duì)于野生型AMSH，本發(fā)明的分離的多肽（即AMSH突變體）的氨基酸序列第 122位氨基酸天冬酰胺突變?yōu)樘於彼帷８鶕?jù)本發(fā)明的一些具體示例，該多肽是由前述分離 的編碼AMSH突變體的核酸編碼的。通過(guò)檢測(cè)生物樣品中是否表達(dá)該多肽，可以有效地檢測(cè) 生物樣品是否易患腓骨肌萎縮癥，也可以通過(guò)檢測(cè)這些多肽在生物體中是否存在，可以有 效地預(yù)測(cè)生物體是否易患腓骨肌萎縮癥。
[0037] 篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的系統(tǒng)和試劑盒
[0038] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種能夠有效實(shí)施上述篩選易患腓骨肌萎 縮癥的生物樣品的方法的系統(tǒng)。
[0039] 參考圖1，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的系統(tǒng) 1000包括核酸提取裝置100、核酸序列確定裝置200以及判斷裝置300。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，核酸提取裝置100用于從生物樣品提取核酸樣本。根據(jù)本 發(fā)明的實(shí)施例，生物樣品的類型并不受特別限制，只要從該生物樣品中能夠提取到反映生 物樣品AMSH是否存在突變的核酸樣本即可。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，生物樣品可以為選自人 體血液、皮膚、皮下組織的至少一種，優(yōu)選外周血。由此，可以方便地進(jìn)行取樣和檢測(cè)，從而 能夠進(jìn)一步提高篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的效率。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，這里所 使用的術(shù)語(yǔ)"核酸樣本"應(yīng)做廣義理解，其可以是任何能夠反映生物樣品中AMSH是否存在 突變的樣本，例如可以是從生物樣品中直接提取的全基因組DNA，也可以是該全基因組中包 含AMSH編碼序列的一部分，可以是從生物樣品中提取的總RNA，也可以是從生物樣品中提 取的mRNA。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述核酸樣本為全基因組DNA。由此，可以擴(kuò)大生物 樣品的來(lái)源范圍，并且可以同時(shí)對(duì)生物樣品的多種信息進(jìn)行確定，從而能夠提高篩選易患 腓骨肌萎縮癥的生物樣品的效率。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，核酸樣本的類型并不受特別 限制，對(duì)于采用RNA作為核酸樣本，則核酸提取裝置進(jìn)一步包括RNA提取單元101和反轉(zhuǎn)錄 單元102,其中，提取單元101用于從生物樣品提取RNA樣本，反轉(zhuǎn)錄單元102與RNA提取單 元101相連，用于對(duì)RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以便獲得cDNA樣本，所得到的cDNA樣本構(gòu) 成核酸樣本。由此，可以進(jìn)一步提高利用RNA作為核酸樣本篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物 樣品的效率。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，核酸序列確定裝置200與核酸提取裝置100相連，用于對(duì)核 酸樣本進(jìn)行分析，以便確定核酸樣本的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，確定所得到核酸樣 本的核酸序列的方法和設(shè)備并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，可以采用測(cè)序的 方法確定核酸樣本的核酸序列。由此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述核酸序列確定裝置 200可以進(jìn)一步包括：文庫(kù)構(gòu)建單元201以及測(cè)序單元202。文庫(kù)構(gòu)建單元201用于針對(duì)核 酸樣本，構(gòu)建核酸測(cè)序文庫(kù)；測(cè)序單元202與文庫(kù)構(gòu)建單元201相連，用于對(duì)核酸測(cè)序文庫(kù) 進(jìn)行測(cè)序，以便獲得由多個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測(cè)序結(jié)果。
[0042] 關(guān)于針對(duì)核酸樣本，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)的方法和流程，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)不 同的測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行適當(dāng)選擇，關(guān)于流程的細(xì)節(jié)，可以參見(jiàn)測(cè)序儀器的廠商例如Illumina 公司所提供的規(guī)程，例如參見(jiàn)Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide(Part#1005361;Feb 2010)或 Paired-End SamplePrep Guide(Part#1005063;Feb 2010)，通過(guò)參照將其并入本文。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，從生物樣品提取核酸樣本的方法和 設(shè)備，也不受特別限制，可以采用商品化的核酸提取試劑盒進(jìn)行。
[0043] 需要說(shuō)明的是，在這里所使用的術(shù)語(yǔ)"核酸序列"應(yīng)作廣義理解，其可以是在對(duì)核 酸樣本進(jìn)行測(cè)序得到的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝后得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采 用通過(guò)對(duì)核酸樣本進(jìn)行測(cè)序所得到的測(cè)序數(shù)據(jù)（reads)作為核酸序列，只要這些核酸序列 中含有對(duì)應(yīng)AMSH的編碼序列即可。
[0044] 另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以對(duì)核酸樣本進(jìn)行篩選，富集AMSH外顯子，該篩選 富集可以在構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)之前，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)過(guò)程中，或者構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)之后進(jìn)行。由此， 文庫(kù)構(gòu)建單元201可以進(jìn)一步包括PCR擴(kuò)增模塊（圖中未示出），在該P(yáng)CR擴(kuò)增模塊中設(shè) 置有AMSH外顯子特異性引物，以便利用AMSH外顯子特異性引物，對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。由此，可以通過(guò)PCR擴(kuò)增，富集AMSH外顯子，從而能夠進(jìn)一步提高篩選易患腓骨肌萎 縮癥的生物樣品的效率。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，AMSH外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :3和4所示的核苷酸序列：
[0045] 正向引物：5'-GAAGTAGCAGGTATGGTACAGTA-3'（SEQ ID N0 :3);
[0046] 反向引物：5' -ATCTGTGTTACAACCCTGAGC-3'（SEQ ID NO :4)。
[0047] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)采用上述引物，可以在PCR反應(yīng)體系中顯著有效地完成 對(duì)AMSH外顯子的擴(kuò)增。需要說(shuō)明的是，這些SEQ ID N0 :3和SEQ ID N0 :4所示的核苷酸序 列是本發(fā)明的發(fā)明人在付出了艱苦的勞動(dòng)后，意外獲得的。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以用于進(jìn)行測(cè)序的設(shè)備并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的 實(shí)施例，可以采用第二代測(cè)序平臺(tái)，也可以采用第三代以及第四代或者更先進(jìn)的測(cè)序平臺(tái)。 根據(jù)本發(fā)明的具體示例，測(cè)序單元202可以為選自HISEQ2000、S0LiD、454和單分子測(cè)序裝 置的至少一種。由此，結(jié)合最新的測(cè)序技術(shù)，針對(duì)單個(gè)位點(diǎn)可以達(dá)到較高的測(cè)序深度，檢測(cè) 靈敏度和準(zhǔn)確性大大提高，因而能夠利用這些測(cè)序裝置的高通量、深度測(cè)序的特點(diǎn)，進(jìn)一步 提尚對(duì)核酸樣本進(jìn)彳丁檢測(cè)分析的效率。從而，提尚后續(xù)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)彳丁分析時(shí)的精確性和 準(zhǔn)確度。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，判斷裝置300與核酸序列確定裝置200相連，適于將核酸樣 本的核酸序列進(jìn)行比對(duì)，以便基于核酸樣本的核酸序列與SEQ ID N0 :1的區(qū)別判斷生物樣 品是否易患腓骨肌萎縮癥。由此，利用該系統(tǒng)，能夠有效地篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣 品。
[0050] 具體地，基于核酸樣本的核酸序列與SEQ ID N0:1相比，是否具有c. 364A>G突變， 判斷生物樣品是否易患腓骨肌萎縮癥。如前所述，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，核酸樣本的核 酸序列與SEQ ID N0 :1相比，具有c. 364A>G突變，是生物樣品易患腓骨肌萎縮癥的指示。 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)核酸序列與SEQ ID N0 :1進(jìn)行比對(duì)的設(shè)備并不受特別限制，可以采 用任意常規(guī)的軟件進(jìn)行操作，根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)例，可以采用SOAP軟件進(jìn)行比對(duì)。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種用于篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣 品的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該用于篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的試劑盒包 括：適于檢測(cè)AMSH基因突變體的試劑，其中與SEQ ID N0 :1相比，該AMSH基因突變體具有 c. 364A>G突變。利用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的試劑盒，能夠有效地篩選易患腓骨肌萎縮癥的 生物樣品。在本文中，所使用的術(shù)語(yǔ)"適于檢測(cè)AMSH基因突變體的試劑"應(yīng)做廣義理解，即 可以是檢測(cè)AMSH編碼基因的試劑，也可以是檢測(cè)AMSH突變體多肽的試劑，例如可以采用識(shí) 別特異性位點(diǎn)的抗體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述試劑為核酸探針或引物，優(yōu)選地，所 述核酸探針或引物具有如SEQ ID N0 :3-4所示的核苷酸序列。由此，可以高效地篩選易患 腓骨肌萎縮癥的生物樣品。
[0052] 需要說(shuō)明的是，在本文前面篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的系統(tǒng)部分中所描 述的特征和優(yōu)點(diǎn)，同樣適用于篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的試劑盒，在此不再贅述。
[0053] 構(gòu)建體及重組細(xì)胞
[0054] 根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該構(gòu) 建體包含前面所述的分離的編碼AMSH突變體的核酸，即本發(fā)明的AMSH基因突變體。由此， 利用本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞獲得的重組細(xì)胞，能夠有效地用于篩選治療腓骨肌萎縮 癥的藥物。其中，所述受體細(xì)胞的種類不受特別限制，例如可以為大腸桿菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物 細(xì)胞，優(yōu)選該受體細(xì)胞來(lái)源于哺乳動(dòng)物。
[0055] 在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)"構(gòu)建體"是指這樣的一種遺傳載體，其包含特定核酸序 列，并且能夠?qū)⒛康暮怂嵝蛄修D(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，以獲得重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，構(gòu) 建體的形式不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，其可以為質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體、粘粒 (Cosmid)、病毒的至少一種，優(yōu)選質(zhì)粒。質(zhì)粒作為遺傳載體，具有操作簡(jiǎn)單，可以攜帶較大片 段的性質(zhì)，便于操作和處理。質(zhì)粒的形式也不受特別限制，既可以是環(huán)形質(zhì)粒，也可以是線 性質(zhì)粒，即可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇。在本 發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)"核酸"可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包 括但不限于經(jīng)過(guò)修飾的或者未經(jīng)修飾的DNA、RNA，其長(zhǎng)度不受任何特別限制。對(duì)于用于構(gòu) 建重組細(xì)胞的構(gòu)建體，優(yōu)選所述核酸為DNA，因?yàn)镈NA相對(duì)于RNA而言，其更穩(wěn)定，并且易于 操作。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明還提出了一種重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該 重組細(xì)胞是通過(guò)前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞而獲得的。從而，本發(fā)明的重組細(xì)胞能夠 表達(dá)構(gòu)建體所攜帶的AMSH基因突變體。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，利用本發(fā)明的重組細(xì) 胞，能夠有效地篩選治療腓骨肌萎縮癥的藥物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，受體細(xì)胞的種類不受 特別限制，例如可以為大腸桿菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選所述受體細(xì)胞來(lái)源于非人哺乳動(dòng) 物。
[0057] 構(gòu)建藥物篩選模型的方法
[0058] 根據(jù)本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建藥物篩選模型的方法。根據(jù)本 發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：使動(dòng)物的至少一部分細(xì)胞表達(dá)前述的編碼AMSH突變體的核 酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述動(dòng)物為小鼠、豬、狗、靈長(zhǎng)類動(dòng)物。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例， 利用本發(fā)明的藥物篩選模型，能夠有效地篩選治療腓骨肌萎縮癥的藥物。
[0059] 需要說(shuō)明的是，本發(fā)明構(gòu)建藥物篩選模型的方法不受特別的限制，只要使動(dòng)物的 至少一部分細(xì)胞表達(dá)前述的AMSH基因突變體即可。例如，可以用采用基因轉(zhuǎn)化的方法，將 前面所述的本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)入受體動(dòng)物（非人），從而使達(dá)動(dòng)物的至少一部分細(xì)胞表達(dá) 前述的AMSH基因突變體；也可以采用無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)、CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)、定點(diǎn) 整合技術(shù)等，使受體動(dòng)物的AMSH基因發(fā)生c. 364A>G突變，并有效表達(dá)前述的多肽，從而該 受體動(dòng)物能夠發(fā)生腓骨肌萎縮癥，進(jìn)而能夠有效地用于篩選治療腓骨肌萎縮癥的藥物，也 即能夠有效用作藥物篩選模型。
[0060] 需要說(shuō)明的是，本發(fā)明采用新一代的全外顯子組測(cè)序技術(shù)，針對(duì)一個(gè)CMT2A患者 家系進(jìn)行全基因組外顯子組測(cè)序分析，從而發(fā)現(xiàn)了一個(gè)CMT2A新的致病基因AMSH，以及該 基因上的致病突變。由此，本發(fā)明豐富了 AMSH基因的致病基因和致病突變圖譜，進(jìn)一步闡 明了腓骨肌萎縮癥的分子發(fā)病機(jī)制，對(duì)于腓骨肌萎縮癥的早期致病基因篩查和干預(yù)治療提 供科學(xué)依據(jù)。
[0061] 下面參考具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，需要說(shuō)明的是，這些實(shí)施例僅僅是說(shuō)明 性的，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0062] 若未特別指明，實(shí)施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手 段，可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為 可商業(yè)獲得的。未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來(lái) 源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特 殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
[0063] 實(shí)施例1確定腓骨肌萎縮癥致病突變
[0064] 1、樣本收集
[0065] 發(fā)明人在山東省兗州、威海市發(fā)現(xiàn)一個(gè)CMT家系，其家系圖見(jiàn)圖2。如圖2所示，其 中，〇表示正常女性，□表示正常男性，表示男性患者，?表示女性患者，箭頭所指為先證 者（Y-04)。
[0066] 該CMT2A家系包含29個(gè)成員，其中CMT2A患者5名。先證者（Y-04)經(jīng)北京大學(xué) 第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診為CMT2A。先證者主要表現(xiàn)為約30年前（16-17歲）開始出現(xiàn) 走路慢，25-26歲起易跌倒，漸加重，3年后開始影響日常生活，寫字費(fèi)力，雙手小肌肉萎縮， 右手及左腿為著，無(wú)明顯感覺(jué)異常及麻木等，偶有肉跳及抽筋感，曾有言語(yǔ)不清，后緩解，無(wú) 呼吸困難、吞咽困難及嗆咳。既往：幼年發(fā)育正常，無(wú)癡呆及認(rèn)知障礙家族史。查體：神清語(yǔ) 利，無(wú)明顯舌肌萎縮及纖顫，吸吮、下頌反射未引出；余顱神經(jīng)（_);鶴腿征，雙手大魚際肌、 骨間肌萎縮，左下肢背屈差，四肢近端肌力V級(jí)，上肢反射低，下肢反射未引出；腹壁反射未 引出（略有肥胖）；胸肌反射陰性，病理征陰性；四肢遠(yuǎn)端針刺覺(jué)減退（上肢6-7分，下肢5 分）。所有家庭成員患者都存在相同的臨床表現(xiàn)，在家族中該疾病呈常染色體顯性遺傳。
[0067] 發(fā)明人采集了該家系中在世的所有成員的外周血，所有血樣均簽屬知情同意書， 并獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
[0068] 2、目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序
[0069] 發(fā)明人利用 Aglient SureSelect Human All Exon kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)結(jié)合Solexa高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)上述腓骨肌萎縮癥 患者家系中的3名患者（Y-05、Y-14、Y-04)和1名正常人（Y-01)的外顯子組序列進(jìn)行了測(cè) 序，其中以200名家系外正常人作為對(duì)照。
[0070] 具體如下：
[0071] 2.1DNA 提取
[0072] 取上述腓骨肌萎縮癥患者家系中的3名患者（Y-05、Y-14、Y-04)和1名正常人 (Y-01)的外周血，分別采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取試劑盒從外周血樣品 中提取基因組DNA，并利用分光光度計(jì)測(cè)量DNA的濃度及純度，所得各基因組DNA的0D 26。/ 〇D2S。均應(yīng)位于1. 7-2. 0之間，濃度不少于200納克/微升，總量不少于30微克。
[0073] 2.2目標(biāo)區(qū)域捕獲與測(cè)序
[0074] 利用超聲波儀（CovarisS2, Massachusetts, USA)將各基因組DNA樣本隨機(jī)打斷 成150-200bp左右的片段，隨后按照制造商提供的操作說(shuō)明書，在片段兩端分別連接上接 頭制備文庫(kù)（可參見(jiàn)：http://www. illumina. com/提供的Illumina/Solexa標(biāo)準(zhǔn)建庫(kù)說(shuō)明 書，通過(guò)參照將其全文并入本文）。文庫(kù)經(jīng)純化后經(jīng)過(guò)連接介導(dǎo)PCR(ligation_mediated PCR，LM_PCR)的線性擴(kuò)增與捕獲試劑SeqCap EZ Oligo pool進(jìn)行雜交富集，再經(jīng)過(guò)LM-PCR 的線性擴(kuò)增，文庫(kù)檢測(cè)合格后即可上機(jī)測(cè)序，以便獲得原始測(cè)序數(shù)據(jù)。其中，測(cè)序平臺(tái)為 Illumina Hiseq2000,讀取長(zhǎng)度為90bp，各樣本的平均測(cè)序深度最少為50X。
[0075] 3、變異檢測(cè)、注釋及數(shù)據(jù)庫(kù)比較
[0076] 利用Illumina basecalling Software 1. 7對(duì)上述獲得的原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行 處理，經(jīng)過(guò)過(guò)濾去污染后，使用S0APaligner/S0AP2(可參見(jiàn)：Li R, Li Y, Kristiansen K, et al,SOAP:short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics 2008,24(5):713-714；Li R, Yu C, Li Y, ea al,S0AP2:an improved ultrafast tool for short read alignment. Bioinformatics 2009, 25 (15): 1966-1967,通過(guò)參照將其全文并 入本文）比對(duì)到參考基因組UCSC NCBI37/hgl9,以便獲得比對(duì)到基因組上的唯一比對(duì)序 列。然后利用 SOAPsnp (可參見(jiàn)：Li R，Li Y，F(xiàn)ang X，Yang H，et al，SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing. Genome Res 2009, 19 (6):1124-1132， 通過(guò)參照將其全文并入本文）確定靶區(qū)域的基因型。
[0077] Indel (insertion-deletion，插入 / 缺失標(biāo)記）米用 BWA (通過(guò) Burrows-Wheeler 變換比對(duì)）（version 0.5. 9-rl6)比對(duì)到參考基因組Hgl9(snpl32)，然后利用GATK(Genome Analysis Toolkit) (version vl. 0? 4705)確定 indel 的類型（可參見(jiàn)：Li H, Durbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 2010 ；26 (5):589-595 ；McKenna, A, Hanna M, Banks E, et al. The genome analysis toolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research 2010 ;20 (9): 1297-1303.，通過(guò)參照將其全文并入本 文）。
[0078] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品Y-01有114150個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs)和7952處的插入/缺 失；樣品Y-04中有118247個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs)和8000處的插入/缺失；樣品Y-05中 有110759個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs)和7812處的插入/缺失；樣品Y-14中有117892個(gè)單核 苷酸多態(tài)性（SNPs)和7907處的插入/缺失。隨后通過(guò)dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)（http://hgdownload. cse. ucsc. edu/goldenPath/hgl9/database/snpl32. txt. gz)，HapMap 數(shù)據(jù)庫(kù)（ftp://ftp. ncbi. nlm. nih. gov/hapma p)，千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（ftp://ftp. lOOOgenomes. ebi. ac. uk/ voll/ftp)，炎黃數(shù)據(jù)庫(kù)（http://yh.genomi cs. org.cn/)等公共數(shù)據(jù)庫(kù)的過(guò)濾，去掉所有 已知的且在數(shù)據(jù)庫(kù)中等位基因頻率大于0. 005的變異（變異MAF值高，通常為不致病的普 通多態(tài)性），并利用SIFT軟件進(jìn)行SNP功能預(yù)測(cè)。
[0079] 然后根據(jù)遺傳模式是常染色體顯性且假設(shè)為全外顯率的情況下，選擇在三個(gè)患者 (Y-05、Y-14、Y-04)中存在，在正常對(duì)照（Y-01)中不存在的罕見(jiàn)雜合突變作為候選基因。定 位至AMSH基因上一個(gè)雜合錯(cuò)義突變c. 364A>G，p. N122D。
[0080] 進(jìn)一步，Sanger驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，AMSH基因的c. 364A>G突變?cè)谠摷蚁党蓡T的3個(gè)患者 (Y-05、Y-14、Y-04)和1個(gè)家系內(nèi)正常人（Y-01)中存在共分離。并且，這個(gè)突變?cè)?00例 正常人群中不存在突變。
[0081] 其中，已知 AMSH (associated molecule with the SH3domain of STAM)屬于 金屬蛋白酶JAMM(JABl/MPN/Mov34)家族的一個(gè)去泛素化蛋白酶，可選擇性切除lysine 63 (K63)聯(lián)接的多聚泛素化肽鏈的泛素，而對(duì)lysine 48 (K48)聯(lián)接的泛素沒(méi)有作用。AMSH 含有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：MIT domain (microtubule-interacting and transport domain)， SBM(SH3binding motif)， JAMM motif， NLS(nuclear localization signal)， DUR(the distal ubiquitin recognition site)，其中 JAMM motif 為 AMSH 去泛素化蛋白酶活性區(qū) 域。AMSH通過(guò)其功能結(jié)構(gòu)域與其它分子相互作用，參與多個(gè)生物學(xué)過(guò)程：
[0082] 1)負(fù)調(diào)節(jié)受體下調(diào)機(jī)制：G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs)、受體酪氨酸激酶（RTKs)如 EGFR、Trk等受體與細(xì)胞因子結(jié)合后，為防止受體持續(xù)激活對(duì)細(xì)胞造成的損害，激活受體 內(nèi)吞并被E3連接酶c-Cbl泛素化，泛素化受體與Hrs-STAM復(fù)合物相互作用，在早期內(nèi)吞 體（endosome)中被分選出來(lái)，依次與 ESCRT(endosomal sorting complex required for transport)-1，-II, -III復(fù)合物作用形成多泡體（MVBs)，進(jìn)而與溶酶體融合后受體在溶酶 體內(nèi)被水解而下調(diào)激活受體。AMSH通過(guò)其SH3結(jié)構(gòu)域與STAM結(jié)合，去除受體的泛素化，去 泛素化后的受體不被溶酶體降解而進(jìn)入再循環(huán)利用過(guò)程。
[0083] 2)維持ESCRT-III復(fù)合物正常功能：ESCRT-III復(fù)合物是MVBs分選途徑中重要 成員，參與泛素化蛋白的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，在細(xì)胞膜、高爾基網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和溶酶體間蛋白運(yùn)輸發(fā)揮關(guān) 鍵作用。AMSH通過(guò)其MIT結(jié)構(gòu)域與ESCRT-III復(fù)合物多個(gè)分子（CHMP1A，CHMP1B，CHMP2A， CHMP3)相互作用，發(fā)揮ESCRT-III復(fù)合物正常功能。
[0084] 3)調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路：AMSH又稱信號(hào)傳導(dǎo)銜接分子結(jié)合蛋白STAMBP (signal transducing adaptor molecule binding protein)，可與 Grb2 和 PI3K 相互作用，分別參 與RAS-MAPK，PI3K-AKT-mT0R信號(hào)通路。在TGF-0信號(hào)通路中，AMSH可與Smad6結(jié)合，并 通過(guò)阻礙Smad6與BMP I型受體及Smadl的結(jié)合，從而詰抗Smad6對(duì)信號(hào)通路的抑制效果， 延緩由BMP-7介導(dǎo)的Smadl磷酸化。BMP信號(hào)還可以通過(guò)JNK或者p38MAP激酶使AMSH磷 酸化，削弱AMSH對(duì)Smad6的詰抗效果。
[0085] 4)參與自噬通路：自噬是一種由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)過(guò)多或異常蛋白質(zhì)的降解 機(jī)制。自噬體成熟需要與MVBs融合，而具有正常功能的ESCRT-III復(fù)合物是MVBs形成所 必需的。AMSH通過(guò)維持ESCRT-III復(fù)合物正常功能參與自噬通路調(diào)節(jié)。
[0086] 由此，發(fā)明人認(rèn)為，AMSH基因?yàn)殡韫羌∥s癥的致病新基因，AMSH基因的 c. 364A>G(p. N122D)突變，為腓骨肌萎縮癥的致病突變。
[0087] 實(shí)施例2Sanger法測(cè)序驗(yàn)證
[0088] 分別對(duì)實(shí)施例1中所述的腓骨肌萎縮癥患者家系中的所有家系成員（包括患者和 正常家屬），以及200名家系外正常人的AMSH基因進(jìn)行檢測(cè)：針對(duì)AMSH基因的c. 364A>G突 變?cè)O(shè)計(jì)引物，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化和測(cè)序的方法獲得突變位點(diǎn)有關(guān)序列，根據(jù)確定 序列測(cè)定結(jié)果屬于突變型還是野生型，驗(yàn)證AMSH基因及該突變與腓骨肌萎縮癥之間的相 關(guān)性。
[0089] 具體方法步驟如下：
[0090] 1、DNA 提取
[0091] 按照實(shí)施例1中所述的提取DNA的方法，分別提取制備受試者外周靜脈血中的基 因組DNA，備用。
[0092] 2、引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)
[0093] 首先，參考人類基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)hgl9/build36. 3,設(shè)計(jì)得到具有SEQ ID N0:3-4 所示核苷酸序列的AMSH基因外顯子特異性引物，具體序列如下：
[0094] 正向引物：5'-GAAGTAGCAGGTATGGTACAGTA-3'（SEQ ID N0 :3);
[0095] 反向引物：5' -ATCTGTGTTACAACCCTGAGC-3'（SEQ ID NO :4)。
[0096] 接著，分別按照以下配比配制各基因組DNA樣本的PCR反應(yīng)體系以及進(jìn)行PCR反 應(yīng)：
[0097] 反應(yīng)體系（50 y 1):
[0098] 10X Pl'u bulTcr 5fjJ dNTP(2.5mM) 5^1 正向引物（20pM) 1^1 反向引物（2〇nM) 1私1 DNA模板 1蚪 Pfu DNA 聚合酶（2-3U4U) 2^1 水 35(al
[0099] PCR反應(yīng)條件：
[0100]
[0101] 由此，獲得各受試者基因組DNA樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0102] 3、測(cè)序
[0103] 將步驟2中獲得的各受試者基因組DNA樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行DNA測(cè)序。 其中，測(cè)序采用ABI3730型測(cè)序儀進(jìn)行。
[0104] 基于測(cè)序結(jié)果，在本發(fā)明的腓骨肌萎縮癥患者家系中對(duì)AMSH基因的該突變位點(diǎn) 進(jìn)行突變排查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該家系中所有患者均攜帶c. 364A>G(p. N122D)的雜合突變，而其 正常家屬以及200例家系外正常人群均不攜帶該突變。其中，圖3顯示了上述腓骨肌萎縮 癥患者家系中先證者和家系內(nèi)健康成員，以及家系外正常對(duì)照的AMSH基因c. 364A>G突變 位點(diǎn)的代表性Sanger測(cè)序驗(yàn)證峰圖。
[0105] 由此，進(jìn)一步證明AMSH基因?yàn)殡韫羌∥s癥的致病基因，AMSH基因的c. 364A>G突 變?yōu)樵摬〉闹虏⊥蛔儭?br>[0106] 實(shí)施例3檢測(cè)試劑盒
[0107] 制備一檢測(cè)試劑盒，其包含能夠檢測(cè)AMSH基因的c. 364A>G突變的引物，用于篩選 易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品，其中這些引物為AMSH基因外顯子特異性引物，其序列如實(shí) 施例2中所述SEQ ID NO :3-4所示。
[0108] 利用上述試劑盒篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的具體步驟為：按照實(shí)施例1 步驟2的2. 1"DNA提取"中所述的方法提取待測(cè)者DNA，以所提取的DNA為模板與上述AMSH 基因的外顯子特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)（PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參見(jiàn)實(shí)施例2)，并按照本 領(lǐng)域常規(guī)方法對(duì)PCR產(chǎn)物純化，將純化的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，然后通過(guò)觀察測(cè)序所得到的序列 是否具有c. 364A>G突變，能夠有效地檢測(cè)本發(fā)明的AMSH基因突變體在待測(cè)者DNA中是否 存在，從而能夠有效地檢測(cè)待測(cè)者是否易患腓骨肌萎縮癥，進(jìn)一步，能夠從待測(cè)者中篩選出 易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品。
[0109] 在本說(shuō)明書的描述中，參考術(shù)語(yǔ)"一個(gè)實(shí)施例"、"一些實(shí)施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特 點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不 一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何 的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
[0110] 盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不 脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本 發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離的編碼AMSH突變體的核酸，其特征在于，所述核酸與SEQ ID NO :1相比， 具有c. 364A>G突變， 任選地，所述核酸為DNA。2. -種分離的多肽，其特征在于，與SEQ ID NO :2相比，所述分離的多肽具有p. N122D 突變， 任選地，所述多肽是由權(quán)利要求1所述的核酸編碼的。3. -種篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的系統(tǒng)，其特征在于，包括： 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對(duì)所述核 酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列； 判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核 酸序列或其互補(bǔ)序列，與SEQ ID N0:1相比，是否具有c. 364A>G突變，判斷所述生物樣品是 否易患腓骨肌萎縮癥。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸提取裝置進(jìn)一步包括： RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從所述生物樣品提取RNA樣本；以及 反轉(zhuǎn)錄單元，所述反轉(zhuǎn)錄單元與所述RNA提取單元相連，用于對(duì)所述RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄反應(yīng)，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸序列確定裝置進(jìn)一步包括： 文庫(kù)構(gòu)建單元，所述文庫(kù)構(gòu)建單元用于針對(duì)所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測(cè)序文庫(kù)；以及 測(cè)序單元，所述測(cè)序單元與所述文庫(kù)構(gòu)建單元相連，用于對(duì)所述核酸測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè) 序，以便獲得由多個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測(cè)序結(jié)果。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述文庫(kù)構(gòu)建單元進(jìn)一步包括： PCR擴(kuò)增模塊，所述PCR擴(kuò)增模塊中設(shè)置有AMSH基因外顯子特異性引物，以便利用所述 特異性引物，對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 任選地，所述特異性引物具有如SEQ ID NO :3-4所示的核苷酸序列， 任選地，所述測(cè)序單元包括選自HISEQ2000、S0LiD、454和單分子測(cè)序裝置的至少一 種。7. -種用于篩選易患腓骨肌萎縮癥的生物樣品的試劑盒，其特征在于，含有： 適于檢測(cè)AMSH基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO :1相比，所述AMSH基因突變體具 有c. 364A>G突變， 任選地，所述試劑為核酸探針或引物， 任選地，所述核酸探針或引物具有如SEQ ID NO :3-4所示的核苷酸序列。8. -種構(gòu)建體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的分離的編碼AMSH突變體的核酸。9. 一種重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞是通過(guò)權(quán)利要求8所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受 體細(xì)胞而獲得的。10. -種構(gòu)建藥物篩選模型的方法，其特征在于，包括： 使動(dòng)物的至少一部分細(xì)胞表達(dá)權(quán)利要求1所述的核酸， 任選地，所述動(dòng)物為小鼠、豬、狗、靈長(zhǎng)類動(dòng)物。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105821062SQ201510013105
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2015年1月9日
【發(fā)明人】劉少君, 戴蘭蘭, 劉勇, 諶于藍(lán), 陳玉劍, 張建國(guó), 闕海萍
【申請(qǐng)人】深圳華大基因科技有限公司, 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所