一種生產(chǎn)α-酮戊二酸的雙酶共表達菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)α?酮戊二酸的雙酶共表達菌株，屬于發(fā)酵工程和酶工程技術領域。本發(fā)明的雙酶共表達菌株真的L?谷氨酸氧化酶和過氧化氫酶之間的連接序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或者SEQ ID NO.7所示。本發(fā)明得到的共表達菌株，可以在額外添加Mn2+條件下實現(xiàn)無過氧化氫酶添加條件下α?酮戊二酸的高效生產(chǎn)；其中共表達菌株F006發(fā)酵得到的菌體細胞可以直接用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α?KG，底物轉(zhuǎn)化率可達98.7％，既無過氧化氫酶添加也無需添加Mn2+。
【專利說明】
_種生產(chǎn)a-酮戊二酸的雙酶共表達菌株
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)a-酮戊二酸的雙酶共表達菌株，屬于發(fā)酵工程和酶工程技術 領域。
【背景技術】
[0002] a-酮戊二酸(a-ketoglutarate,簡稱a-KG)作為一種重要的高值精細化學品（20-25萬元/噸），廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工和化妝品等工業(yè)領域中。在醫(yī)藥領域中，a-KG能減 輕腎病患者的腎臟負擔、減少并發(fā)癥和促進患者手術后快速恢復;與精氨酸等氨基酸復配， 能快速幫助運動員補充能量，廣泛應用于功能性營養(yǎng)強化劑;除此以外，由于a-KG特殊的化 學性質(zhì)，被廣泛用于化學合成行業(yè)。隨著a-KG應用領域的不斷拓展，導致國內(nèi)和國際市場對 a-KG的需求不斷增加。從海關了解到的數(shù)據(jù)，目前國際市場對食品級a-KG需求量缺口達5萬 噸以上，而目前食品級a-KG市場價格為20-25萬元/噸，且面臨有價無市的窘境。a-KG的生產(chǎn) 方法包括:化學合成法、酶催化法和微生物發(fā)酵法。目前，工業(yè)化生產(chǎn)a-KG主要采用有機合 成法，涉及一系列復雜的化學反應過程，從而引起原料來源、環(huán)境污染等方面一系列問題。 同時由于化學法合成a-KG過程中存在嚴重的安全問題，導致a-KG難以直接用于食品、醫(yī)藥 和化妝品等領域。因此，如何采用生物技術法大規(guī)模制備安全性高的a-KG，是國內(nèi)外學術界 和產(chǎn)業(yè)界所關注的焦點問題。
[0003] 本研究室前期構(gòu)建了L-谷氨酸氧化酶高效表達菌株E.coli FMME089,并通過高密 度發(fā)酵手段實現(xiàn)了 L-谷氨酸氧化酶的大規(guī)模制備，使酶法轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)a-KG的工業(yè)化 生產(chǎn)成為可能。然而在酶法轉(zhuǎn)化過程中需要添加過氧化氫酶，工業(yè)用過氧化氫酶中雜質(zhì)較 多對a-KG產(chǎn)品后期的分離純化造成困擾且外源添加過氧化氫酶造成成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，降低成本，本發(fā)明旨在原有L-谷氨酸生產(chǎn)a-KG體系的基礎上 實現(xiàn)不添加過氧化氫酶條件下的高效率轉(zhuǎn)化，構(gòu)建符合條件的L-谷氨酸氧化酶和過氧化氫 酶共表達菌株。
[0005] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種共表達L-谷氨酸氧化酶和過氧化氫酶的DNA片 段，所述DNA片段由編碼L-谷氨酸氧化酶的基因序列、連接序列、編碼過氧化氫酶的基因序 列依次連接而成。
[0006] 所述L-谷氨酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0007] 所述過氧化氫酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所 不。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述連接序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO .6或者SEQ ID NO .7所示。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是提供表達所述DNA片段的重組載體或者重共表達菌株。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組載體，是將所述DNA片段連接到pET28a表達 載體上得到的。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述共表達菌株，是將所述重組載體轉(zhuǎn)化到宿主大 腸桿菌中得到的共表達菌株。
[0012] 本發(fā)明的第三個目的是提供所述DNA片段經(jīng)表達后得到的酶系。
[0013] 本發(fā)明的第四個目的是提供所述酶系或者共表達菌株在轉(zhuǎn)化生產(chǎn)a-酮戊二酸方 面的應用。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應用，是以L-谷氨酸或谷氨酸鈉為底物，在pH 6.0-8.0，溫度30-42°(：下，轉(zhuǎn)化18-2411，利用所述酶系或者共表達菌株催化生產(chǎn)(1-酮戊二 酸。
[0015]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應用需要添加1~5mmol/L的MnCl2作為兩種酶 的激活劑。
[0016]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述底物的濃度為110_135g/L。
[0017]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述共表達菌株的菌體添加量為2~2.5g/L。
[0018] 本發(fā)明的第五個目的是提供一種所述生產(chǎn)a-酮戊二酸的雙酶共表達菌株的構(gòu)建 方法，所述方法在全細胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)a_酮戊二酸轉(zhuǎn)化體系基礎上預測所需L-谷氨酸 氧化酶和過氧化氫酶的用量，進而通過分子生物學手段從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)雙酶表達來 構(gòu)建L-谷氨酸氧化酶和過氧化氫酶的共表達菌株，實現(xiàn)兩種酶不同表達量的要求，以達到 該轉(zhuǎn)化體系下酮戊二酸高效生產(chǎn)，過程中無需過氧化氫酶的額外添加。
[0019] 所述方法，在構(gòu)建單酶表達菌株測定酶學性質(zhì)基礎上確定雙酶需求量，通過雙酶 不同構(gòu)建方式、SD序列與起始密碼子ATG之間的間隔以及RBS序列強度優(yōu)化等方法逐步實現(xiàn) 兩種酶各種所需表達量要求，同時通過轉(zhuǎn)化反應對共表達菌株性能進行驗證。
[0020] 所述全細胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)a-酮戊二酸轉(zhuǎn)化體系是以L-谷氨酸氧化酶重組菌 株E.coli FMME089進行全細胞轉(zhuǎn)化。
[0021] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述轉(zhuǎn)化體系是指以L-谷氨酸或者谷氨酸鈉為底物 生產(chǎn)a-KG的方法，在pH 6.0-8.0，溫度30-42°C下，轉(zhuǎn)化18_24h，催化生產(chǎn)a-酮戊二酸。
[0022] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述全細胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)a-酮戊二酸轉(zhuǎn)化體系 及轉(zhuǎn)化條件為：1 l〇g/L L-谷氨酸，2~2.5g/L菌體，pH 6.5磷酸緩沖液體系，30~42°C， 200rpm條件下轉(zhuǎn)化24h。
[0023]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述底物濃度為110_135g/L。
[0024]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌或共表達菌株為以E.coli BL21 (DE3)為宿主菌、以pET28a表達載體；L-谷氨酸氧化酶來源于Streptomyces ghanaensis ATCC14672,過氧化氫酶來源于E.coli K12。
[0025]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述L-谷氨酸氧化酶和過氧化氫酶的性質(zhì)是通過分 別構(gòu)建酶的高效表達菌株FXC001和FXC007，誘導表達、破碎、離心、過濾、掛柱、洗脫及脫鹽 等過程后測得。
[0026]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述過氧化氫酶的用量是通過轉(zhuǎn)化體系中直接添加 純化后的過氧化氫酶直接測得。
[0027]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述過氧化氫酶的需求量最低為1000U/mL。
[0028] 所述分子生物學手段是指通過基因克隆技術、PCR技術、融合表達技術、RBS強度預 測技術、質(zhì)粒構(gòu)建技術等，涉及分子生物學領域的一些分子操作。
[0029] 所述轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控雙酶表達是指通過雙酶不同構(gòu)建方式如單啟動子雙酶雙聯(lián)表 達、雙啟動子雙酶串聯(lián)表達、單啟動子雙酶融合表達等來構(gòu)建共表達質(zhì)粒，其中L-谷氨酸氧 化酶均位于過氧化氫酶之前，構(gòu)建完成的三株共表達菌株分別命名為F001，F(xiàn)002和F003。
[0030] 所述翻譯水平調(diào)控雙酶表達是指通過改變SD序列與起始密碼子之間的間隔或者 RBS序列強度調(diào)節(jié)核糖體與mRNA的結(jié)合強度，進而影響翻譯起始速率，在翻譯水平上調(diào)節(jié)蛋 白質(zhì)表達量。所述SD序列與起始密碼子ATG之間的間隔優(yōu)化是指通過優(yōu)化過氧化氫酶基因 前端的SD序列與起始密碼子之間的間隔調(diào)控過氧化氫酶的不同表達量，間隔設定在3bp~ 12bp，分別構(gòu)建了四株共表達菌株并命名為FXC003~FXC006。所述RBS序列強度優(yōu)化是指通 過RBS Calculator vl ? 1 (https://www.denovodna.com/software/)預測達至lj一定表達量 所需的過氧化氫酶基因前端RBS強度及翻譯起始速率TIF>24,000au，從而設計4組符合要 求的RBS序列，構(gòu)建雙酶串聯(lián)表達質(zhì)粒，L-谷氨酸氧化酶位于過氧化氫酶之前，構(gòu)建成功的 四株共表達菌株分別命名為H)04~R)07。
[0031] 在本發(fā)明中所有重組菌的性能評價均在同一條件下誘導測定產(chǎn)酶效果，隨后利用 菌體或者酶系轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)a-KG。
[0032]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述誘導的誘導劑添加為0D600在0.6~1.2之間時， 添加0.3~0.5mmol/L IPTG或者3~7g/L乳糖誘導。
[0033]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述誘導的誘導溫度為25-30°C。
[0034]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述誘導的誘導時間為4_8h。
[0035] 所述方法中，對于發(fā)酵培養(yǎng)基，本領域技術人員完全可以根據(jù)現(xiàn)有的大腸桿菌培 養(yǎng)基，選擇適合產(chǎn)酶的培養(yǎng)基或者是進一步對培養(yǎng)基進行優(yōu)化。
[0036] 所述方法中，對于轉(zhuǎn)化體系，本領域技術人員完全可以根據(jù)現(xiàn)有轉(zhuǎn)化，選擇合適的 類似緩沖液體系和轉(zhuǎn)化條件或者是進一步添加輔助因子。
[0037]本發(fā)明的有益效果：
[0038] 1、應用本發(fā)明方法先后得到11株L-谷氨酸氧化酶和過氧化氫酶共表達菌株，實現(xiàn) 了兩種酶的不同表達水平的高效表達；
[0039] 2、應用本發(fā)明合理實現(xiàn)了目標酶特定的表達量范圍；
[0040] 3、部分共表達菌株在額外添加Mn2+條件下，也可以實現(xiàn)無過氧化氫酶添加條件下 a_酮戊二酸的高效生產(chǎn)；
[0041 ] 4、共表達菌株F006發(fā)酵得到的菌體細胞可以直接用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)a-KG，底物轉(zhuǎn)化率 可達98.7%，既無過氧化氫酶添加也無需添加Mn2+;
[0042] 5、在110g/L L-谷氨酸，2~2.5g/L菌體，pH 6.5磷酸緩沖液體系，30°C，200rpm條 件下轉(zhuǎn)化18~24h，最優(yōu)菌株F006的a-酮戊二酸產(chǎn)量可以達到107.2g/L，轉(zhuǎn)化率為98.4%， 完全替代外源添加過氧化氫酶且無需添加Mn2+;增加菌體濃度，132g/L底物條件下a-酮戊二 酸的產(chǎn)量可以達到127. lg/L，轉(zhuǎn)化率96.9 %。
【附圖說明】
[0043] 圖1:重組LG0X純化及SDS-PAGE分析（1為發(fā)酵液，2為重組菌，3為Ni柱純化后LG0X， 4為脫鹽后LGOX);
[0044] 圖2:重組KatG純化及SDS-PAGE分析（1為BL21空質(zhì)粒菌，2為重組菌，3為純化后蛋 白）；
[0045] 圖3:30°C下LG0X的溫度穩(wěn)定性；
[0046]圖4:Lineweaver_Burk 雙倒數(shù)曲線；
[0047]圖5:KatG添加量對轉(zhuǎn)化的影響；
[0048]圖6:不同間隔共表達質(zhì)粒的構(gòu)建；
[0049] 圖7:不同RBS強度共表達菌株蛋白電泳圖；
[0050] 圖8:全細胞催化劑對轉(zhuǎn)化的影響。
【具體實施方式】
[0051 ]實施例1L-谷氨酸氧化酶性質(zhì)研究及過氧化氫酶需求量確定
[0052]分別將來源于Streptomyces ghanaensis ATCC14672的L-谷氨酸氧化酶（LG0X)基 因（氨基酸序列如3￡0 10勵.1所示，核苷酸序列如3￡0 10^).2所示），來源于￡.〇〇111(12 的過氧化氫酶基因KatG(氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，核苷酸序列如SEQ ID N0.4所 示），通過引物 1 (上游引物：5 ' -CATGCCATGGCAATGCTGCCCGCACCGGCCGCCT-3 '，序列如SEQ ID 勵.8;下游引物：5'-0〇^厶6(：11^11^〇6〇^6丁66厶1'〇'〇^厶6-3'，序列如5￡0 10勵.9)以及引 物：5/-0〇^46(：11^0460466111^440661'(：-3/，序列如5￡0 10勵.11)克隆表達于質(zhì)?？凇?283 中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21 (DE3)中，篩選出陽性菌株分別命名為FXC001和FXC007。重組 菌株于TB培養(yǎng)基中誘導表達，當0D6(x)為0.6-1.2之間時加入0.4mmol/L的IPTG進行30°C誘導 5~6h，隨后經(jīng)過破碎、離心、過濾、掛柱、洗脫及脫鹽處理后分別獲得兩種純化后的酶（圖1 和圖2)，蛋白大小分別為65kDa和80kDa。最后，對兩種酶進行性質(zhì)研究。
[0053] 1)測定30°C條件下LG0X的活性隨時間的變化值，擬合失活方程曲線（圖3)計算出 該酶的半衰期為4 ? 62h;隨后對其動力學參數(shù)進行了測定，得到圖4所示Lineweaver-Burk雙 倒數(shù)曲線，計算出LG0X的結(jié)合常數(shù)Km為6.32mmol ? L'Vmax為40_〇1 ? mirT1 ? mg^1，對應的 kcat為 1 ? 23min-、
[0054] 2)在轉(zhuǎn)化體系（11(^/11-谷氨酸，2~2.58/1^.(3〇11?11￡089菌體4116.5磷酸緩 沖液)基礎上，通過添加0~2000U/mL純化后的KatG測定24h內(nèi)a-KG的產(chǎn)量，結(jié)果見圖5，粗略 估算該轉(zhuǎn)化體系共需要該類過氧化氫酶的用量為1250U/mL或以上(此時轉(zhuǎn)化率超過95%)， 確定了共表達菌株中所需該基因的表達水平。
[0055] 實施例2雙酶共表達菌株轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控
[0056]以pET28a為表達載體設定了三種不同策略構(gòu)建共表達菌株，策略1采用單啟動模 式將LG0X和KatG串聯(lián)表達，通過與LG0X前相同的RBS序列連接KatG，構(gòu)建成功的共表達菌株 命名為F001;策略2采用雙啟動子模式與LG0X和KatG前面添加同樣的啟動子及相關序列，構(gòu) 建共表達菌株命名為F002;策略3采用單啟動子模式將LG0X和KatG通過Hind III直接串聯(lián) 在一起，構(gòu)建成功的共表達菌株命名為F003。其中，策略1會轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)一條mRNA，含有兩個核 苷酸結(jié)合位點，翻譯出兩條蛋白；策略2會轉(zhuǎn)錄出一大一小兩條mRNA，均含有核苷酸結(jié)合位 點，翻譯出兩條蛋白；策略3會轉(zhuǎn)錄出一條mRNA，僅含有一個核苷酸結(jié)合位點，翻譯出一條融 合蛋白。其中，策略2的KatG蛋白表達量由于策略1，希望能得到不同KatG表達量的菌株;策 略3可以實現(xiàn)LGOX和KatG的肽鏈數(shù)目一致，期望一個融合酶能夠完成目標反應，兩種酶的活 性與折疊結(jié)構(gòu)有關不易判斷。
[0057]重組菌接種于LB種子培養(yǎng)基上10_12h后，以4%的接種量轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中，當 OD6Q0為0.6-1.2之間時加入0.4mmol/L的IPTG進行30°C誘導5~6h;隨后離心獲得共表達菌 體，在110g/L L-谷氨酸、2~2.5g/L菌體等轉(zhuǎn)化條件下反應24h; 3株共表達菌株的產(chǎn)酶效果 和轉(zhuǎn)化效果整理成表格1，可以發(fā)現(xiàn)KatG酶活F002>F001 >F003，LG0X活性F003>F001 >F002， a-KG產(chǎn)量R)03>F001>F002,且a-KG產(chǎn)量R)01與R)03相差不大。因此，可以看出相同啟動子串 聯(lián)表達不利于雙酶表達，大片段基因融合表達可操作性較差且無法確定雙酶活性，單啟動 子雙酶串聯(lián)表達可以通過RBS調(diào)控基因的表達可操作性強，且能較好保存雙酶活性，是下一 步優(yōu)化的基礎。
[0058]表1不同構(gòu)建方式細胞濃度、產(chǎn)酶及轉(zhuǎn)化效果比較
L〇〇6〇」實施例3SD序列（Shine-Dalgarno sequence)與ATG間隔的影響 [00611 按照圖6質(zhì)粒構(gòu)建方式構(gòu)建重組質(zhì)粒(其中RBS*代表不同SD與ATG間隔的序列），設 定間隔分別為3bp、6bp、9bp和12bp，上游引物分別為KatG-rbsl(序列如SEQ ID N0.12)、 KatG-rbs2(序列如SEQ ID N0.13)、KatG-rbs3(序列如SEQ ID 勵.14)和1^七6-484(序列如 SEQ ID NO. 15)，下游引物為KatG-A(序列如SEQ ID NO. 16)(表2)，通過傳統(tǒng)的構(gòu)建方式構(gòu) 建并驗證重組菌株，將構(gòu)建并驗證成功的菌株分別命名為FXC003、FXC004、FXC005(即L-谷 氨酸氧化酶和過氧化氫酶通過SEQ ID從).5的連接序列進行連接）、？10)06。
[0062] 將四株重組菌株于TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)0D6QQ至0.6~1.2,添加0.4mmol ? L-:IPTG誘導5 ~6h，測定此時細胞濃度、LG0X活性及KatG活性，并收集細胞進行蛋白電泳及全細胞轉(zhuǎn)化生 產(chǎn)〇-隊（11(^葉九-谷氨酸，全細胞細胞4116.5磷酸鹽緩沖液體系，20(^.111111- 1，30°(：轉(zhuǎn) 化24h)。不同重組菌株的細胞濃度0D6QQ、LG0X酶活、KatG活性及全細胞轉(zhuǎn)化a-KG產(chǎn)量列于表 3，可以看出 LG0X 酶活 FXC003>FXC005>FXC006>FXC004，且 FXC004、FXC005、FXC006 相差不大， 而KatG活性FXC005>FXC004>FXC006>FXC003,其中FXC003遠低于其它三株僅為56U ? mL-、其 中FXC005菌株的KatG活性最接近實驗預測值1250U ? mL-Sa-KG產(chǎn)量最高為86.7g ? L-S轉(zhuǎn) 化率為79.6%。雖然有了較大的提高仍沒有滿足完全替代過氧化氫酶的目的，需要進一步 優(yōu)化。
[0063]表2本發(fā)明所使用的引物
[0065]表3不同間隔共表達菌株細胞濃度、產(chǎn)酶及轉(zhuǎn)化效果比較
[0067] 實施例4核糖體結(jié)合位點(RBS序列)強度對產(chǎn)酶的影響
[0068] 在FXC003中（RBS序列，即兩酶連接序列，為rbsl)，LG0X以Nco I和Hindlll為酶切 位點連接到pET28a，對應的 AGtot為4.21kcal ? mol-STIR為375.4au;KatG以Hindlll和Xhol I插入到pET28a-LG0X，對應的 A Gt〇t = 1 ? 85kcal ? mol-1，HR= 1087 ? 31au;又KatG活性為 56U ? mL-S約為需求量的4.5%(所需KatG活性為1250U ? mL-因此所需RBS的TIF在 24433.9au以上為宜。
[0069] 分別設計4組rbs序列，分別命名為rbs5(序列如SEQ ID N0.17)、rbs6(序列如SEQ 10腸.18)、487(序列如3￡〇10如.19)和吐88(序列如3￡〇10如.20)，其序列見表4，其 TIR均在24,000au以上。并分別設計上游引物KatG-rbs5(序列如SEQ ID N0.21)、KatG-rbs6 (序列如3￡〇10腸.22)、1^七6-487(序列如5￡〇10腸.23)和1^七6-488(序列如5￡〇10 NO.24)，下游引物為KatG-A(表2)，通過傳統(tǒng)的構(gòu)建方式構(gòu)建并驗證重組菌株，將構(gòu)建出正 確的陽性菌株并分別命名？004^005(即1-谷氨酸氧化酶和過氧化氫酶通過5￡〇10勵.6的 連接序列進行連接）、？006(8卟-谷氨酸氧化酶和過氧化氫酶通過5￡〇10^).7的連接序列 進行連接）、H)07。
[0070] 表4不同RBS及其特征
[0072] 將驗證成功的共表達菌株于TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)D6QQ至0.6~1.2,添加0.4mmol ? L一 :IPTG誘導5~6h，收集細胞進行蛋白電泳。結(jié)果如圖7所示，與對照(E.coli BL21和FXC001) 相比，共表達菌株生產(chǎn)LG0X蛋白大小約為65kDa，KatG蛋白大小約為80kDa，兩種蛋白都有表 達。其中F004和F005的KatG條帶明顯高于LG0X，F(xiàn)006中KatG和LG0X相差不大，F(xiàn)007中LG0X的 條帶明顯超過KatG?？傮wKatG的條帶亮度R)04>F005>R)06>F007,符合TIR預測。
[0073] 參照實施例3對F004、F005、F006和F007進行產(chǎn)酶效果表征，其結(jié)果見表5。發(fā)現(xiàn) LG0X 酶活 F007>F006>F004>F005，KatG 活性 F005>F006>F004>F007，且 F005 及 F006 的 KatG 活 性接近預測值1250U ? mL-S結(jié)合SDS-PAGE圖譜發(fā)現(xiàn)KatG蛋白表達量與KatG活性不成比例， 且TIF預測有一定的偏差(F006和F007)。將四株菌進行全細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)a-KG(110g ? d-谷 氨酸，全細胞細胞，？!16.5磷酸鹽緩沖液體系，20(^.111111'30°(：轉(zhuǎn)化2411)，發(fā)現(xiàn)€[-1^產(chǎn)量 R)06>F005>F004>F007，KatG活性對轉(zhuǎn)化效果較顯著，其中F006的轉(zhuǎn)化效果最好，a-KG產(chǎn)量 達到103. lg ? I/1，轉(zhuǎn)化率達到94.6%，較好的實現(xiàn)了雙酶轉(zhuǎn)化效果。
[0074] 表5重組菌產(chǎn)酶效果
[0076]實施例5共表達菌株F006轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化
[0077]以132g ? d-谷氨酸為底物，在lmmol ? 條件下，添加不同比例的全細胞催 化劑進行實驗，其中以同體積發(fā)酵液所獲得的細胞作為1倍全細胞催化劑（菌體濃度在 2.5g/L~3.5g/L之間）。分別添加1倍、1.5倍和2倍全細胞催化劑進行轉(zhuǎn)化實驗，30°C、 20(^1111- 1條件下2411轉(zhuǎn)化效果見圖8，1.5倍時€[-1?產(chǎn)量為121.88.1/1，轉(zhuǎn)化率為92.9%， 2倍時a-KG產(chǎn)量為127. lg ? I/1，此時轉(zhuǎn)化率為96.9%，a-KG產(chǎn)量提高了23.2%。
[0078]實施例6酶的應用
[0079]將上述所有共表達菌株發(fā)酵液離心獲得菌體，用于轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)a-KG。
[0080] 在底物為110~135g/L的L-谷氨酸，采用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，添加不同濃度的 Mn2+(lmM~5mM)，30°C轉(zhuǎn)化18~24h測定a-KG的產(chǎn)量。發(fā)現(xiàn)FXC005、R)05和R)06均可以達到轉(zhuǎn) 化率在95 %以上，實現(xiàn)不添加過氧化氫酶條件下的a-KG高效生產(chǎn)。
[00811 根據(jù)上述方法可以判斷出成功構(gòu)建出符合要求的共表達菌株FXC005、F005和 F006，其中最有菌株為R)06。
[0082]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1. 一種共表達L-谷氨酸氧化酶和過氧化氫酶的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段由 編碼L-谷氨酸氧化酶的基因序列、連接序列、編碼過氧化氫酶的基因序列依次連接而成;所 述連接序列的核苷酸序列如SEQIDN0.5、SEQIDN0.6或者SEQIDN0.7所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求所述的DNA片段，其特征在于，所述L-谷氨酸氧化酶的氨基酸序列如 SEQ ID N0.1 所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求所述的DNA片段，其特征在于，所述過氧化氫酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。4. 含有權(quán)利要求1所述DNA片段的重組載體。5. 含有權(quán)利要求1所述DNA片段的共表達菌株。6. 權(quán)利要求1所述的DNA片段經(jīng)表達后得到的酶系。7. 權(quán)利要求6所述的酶系或者權(quán)利要求5所述的共表達菌株在轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸方 面的應用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述應用是以L-谷氨酸或谷氨酸鈉為底 物，在pH 6.0-8.0，溫度30-42°C下，轉(zhuǎn)化18-24h，利用所述酶系或者共表達菌株催化生產(chǎn)α- 酮戊二酸。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述生產(chǎn)過程中添加1~5mmol/L的MnCl2。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化生產(chǎn)中初始底物的濃度為110-135g/L〇
【文檔編號】C12P7/50GK105821066SQ201610363824
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】劉立明, 樊祥臣, 劉佳, 林小寶
【申請人】江南大學