重組載體及其構(gòu)建方法、降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌及制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組載體及其構(gòu)建方法、降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌及制備方法和應(yīng)用，重組載體包括pGEX?3x表達(dá)載體和降解甲氰菊酯酯酶基因<i>est3385</i>；降解甲氰菊酯酯酶基因<i>est3385</i>為SEQ ID NO.1所示的序列；降解甲氰菊酯酯酶基因<i>est3385</i>位于pGEX?3x表達(dá)載體的<i>Bam </i>H I和<i>Eco</i>RⅠ兩限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間，其構(gòu)建方法包括：抽提基因組DNA、設(shè)計(jì)引物、PCR擴(kuò)增、酶切、連接等步驟。本發(fā)明還包括含有上述重組載體得到工程菌，由上述重組載體經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞得到。該工程菌產(chǎn)量高，工藝簡單，對(duì)環(huán)境友好，滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，可應(yīng)用于降解甲氰菊酯。
【專利說明】
重組載體及其構(gòu)建方法、降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌及制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種重組載體及其構(gòu)建方法、降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌及制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]甲氰菊酯是菊酯類農(nóng)藥品種之一，在我國廣泛用于控制谷物、馬鈴薯、煙草、棉花和水果等主要農(nóng)作物的害蟲。自上世紀(jì)八十年代商業(yè)化生產(chǎn)以后，因其具有高效、低劑量、以及對(duì)哺乳動(dòng)物低毒等優(yōu)點(diǎn)，菊酯類農(nóng)藥成為一些劇毒農(nóng)藥(有機(jī)氯類和有機(jī)磷類農(nóng)藥)理想的替代品；甲氰菊酯等菊酯類農(nóng)藥的使用量需求不斷增長。然而隨著大量甲氰菊酯等菊酯類農(nóng)藥投入到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中菊酯類農(nóng)藥的殘留不斷累積，其對(duì)非靶標(biāo)及生態(tài)環(huán)境安全的影響，逐步顯現(xiàn)。研究表明，甲氰菊酯等菊酯類農(nóng)藥對(duì)大量非靶標(biāo)生物如天敵票瓜蟲有劇毒(Michaud JP.Relative toxicity of six insecticides to Cyclonedasanguinea and Harmonia axyridis.)，此外，菊酯類農(nóng)藥對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)中幾乎所有的非革巴標(biāo)(節(jié)肢動(dòng)物、脊椎動(dòng)物)均有劇毒(Solomon KR, Giddings JM, Maund SJ.Probabilistic risk assessment of cotton pyrethroids: 1.Distribut1nalanalyses of laboratory aquatic toxicity data.)。更為嚴(yán)重的是，一些擬菊酯農(nóng)藥品種具有引發(fā)神經(jīng)毒性、生殖毒性、細(xì)胞毒性等慢性毒性，其中少量菊酯類農(nóng)藥品種具有致畸性和致癌性，因此，美國環(huán)保署(EPA)將一些菊酯類農(nóng)藥品種列為可能的致癌物質(zhì)。目前，為保障我國農(nóng)業(yè)穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)，菊酯類農(nóng)藥依然將會(huì)在一段時(shí)期內(nèi)大量使用，因此，殘留于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的菊酯類農(nóng)藥，已經(jīng)成為生態(tài)環(huán)境乃至人類自身安全的潛在威脅，因此，迫切需要研發(fā)有效的方法清除農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中甲氰菊酯等菊酯類農(nóng)藥殘留。
[0003]甲氰菊酯等菊酯類農(nóng)藥可以通過生物和非生物的方法降解，目前，生物降解被認(rèn)為是一種安全、高效和廉價(jià)的消除甲氰菊酯等菊酯類農(nóng)藥殘留的方法。在生物降解中，微生物降解是重要的組成部分，許多性能優(yōu)異的降解菌資源及其相應(yīng)的降解基因和降解酶被分離和克隆鑒定(Yang CR, Jian JZ (2010) Recent advance in b1degradat1n inChina: New microorganism and pathway, b1degradat1n engineering, andb1energy from pollutant b1degradat1n.)，但是，在實(shí)際應(yīng)用過程中，受自然環(huán)境條件的影響，其清除菊酯類農(nóng)藥殘留的效果，確遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)室;此外，降解菌資源和降解酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，依然是制約微生物及相關(guān)酶制劑應(yīng)用于菊酯類農(nóng)藥殘留治理和修復(fù)的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸之一。
[0004]采用易于大規(guī)模發(fā)酵的微生物，表達(dá)性能優(yōu)異的降解酶基因，構(gòu)建的工程菌，為降解酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了條件。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組載體及其構(gòu)建方法，還提供了一種降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌及工程菌的制備方法，該工程菌可大量生產(chǎn)甲氰菊酯降解酯酶est3385，不僅產(chǎn)量高，而且工藝簡單，對(duì)環(huán)境友好，滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，可應(yīng)用于降解甲氰菊酯。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，提供了一種重組載體，所述重組載體包括pGEX_3x表達(dá)載體和降解甲氰菊酯酯酶基因est3385;所述降解甲氰菊酯酯酶基因est3385的DNA序列為SEQID N0.1所示的序列;所述降解甲氰菊酯酯酶基因est3385位于所述pGEX-3x表達(dá)載體的BamH I和EcoRI兩限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間。
[0007]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種上述的重組載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
51、抽提沼澤紅假單胞菌的基因組DNA;
52、根據(jù)所述步驟SI的基因組DNA設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物；
53、以所述SI的基因組DNA為模板，以步驟S2的擴(kuò)增弓丨物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
54、酶切所述擴(kuò)增產(chǎn)物和原始載體得到酶切后的擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切后的原始載體；
55、將所述酶切后的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到所述酶切后的原始載體上得到重組載體。
[0008]上述的構(gòu)建方法，優(yōu)選的，所述步驟S2中所述擴(kuò)增引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的DNA序列為SEQ ID N0.2所示的序列；所述下游引物的DNA序列為SEQ IDN0.3所示的序列。
[0009]上述的構(gòu)建方法，優(yōu)選的，所述步驟S3中所述P C R擴(kuò)增的條件為:9 4 °C預(yù)變性5min，94°C變性45 s，61°C復(fù)性30 s，72°C延伸60 s，35個(gè)循環(huán)，最后延伸10 min。
[0010]上述的構(gòu)建方法，優(yōu)選的，所述步驟S4中，采用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoRI雙酶切所述擴(kuò)增產(chǎn)物和原始載體。
[0011]上述的構(gòu)建方法，優(yōu)選的，所述步驟S5具體為:將所述酶切后的擴(kuò)增產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接到所述酶切后的原始載體上得到重組載體。
[0012]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌，所述降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌含有上述的重組載體。
[0013]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種上述降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌的制備方法，包括以下步驟:將重組載體熱激轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中得到降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌。優(yōu)選的，所述熱激轉(zhuǎn)化的溫度為42 °C，熱激轉(zhuǎn)化時(shí)間為50 S。
[0014]上述的制備方法，優(yōu)選的，所述感受態(tài)細(xì)胞為E.coli感受態(tài)細(xì)胞BL21。
[0015]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種上述的降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌或上述制備方法制備得到的工程菌在降解甲氰菊酯中的應(yīng)用。
[0016]上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述應(yīng)用方法為:將所述工程菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6Q0為
0.6?0.7，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷繼續(xù)培養(yǎng)得到菌液;將所述菌液與磷酸緩沖液、甲氰菊酯溶液混合、孵育，完成對(duì)甲氰菊酯的降解。
[0017]上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。
[0018]上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的濃度為0.5 mM。
[0019]上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為6?12ho
[0020]上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述孵育的溫度為15?65°C。
[0021 ] 上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述孵育的pH為5.0?9.0。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
(I)本發(fā)明提供了一種降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌，將沼澤紅假單胞菌酯水解酶的全長序列與表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得含有降解甲氰菊酯酯酶基因est3385的工程菌;利用大腸桿菌工程菌大量生產(chǎn)降解甲氰菊酯酯酶est3385，為工業(yè)化生產(chǎn)提供一種高產(chǎn)的工程菌。
[0023](2)本發(fā)明提供了一種降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌的應(yīng)用，利用誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的誘導(dǎo)條件，降解酯酶est3385的產(chǎn)量達(dá)到最大值，可生產(chǎn)濃度大于1.3 g/L的降解甲氰菊酯酯酶est3385。
[0024](3)本發(fā)明利用構(gòu)建的工程菌生產(chǎn)降解甲氰菊酯酯酶est3385，不僅產(chǎn)量高達(dá)1.3g/L，而且工藝簡單，對(duì)環(huán)境友好，滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
【附圖說明】
[0025]為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。
[0026]圖1為重組質(zhì)粒pGEX-3X-3385的構(gòu)建過程。
[0027]圖2為重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化圖。
[0028]圖3為純化蛋白Westernblotting。
[0029]圖4為不同孵育溫度對(duì)酶液的處理效果影響結(jié)果。
[0030]圖5為不同pH對(duì)酶液的處理效果的影響結(jié)果。
[0031 ]圖6為降解酯酶的底物特異性分析結(jié)果結(jié)果。
[0032]圖7為金屬離子和化學(xué)藥物對(duì)酶活的影響結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0033]以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例
[0034]以下實(shí)施例中所采用的材料和儀器均為市售。
[0035]實(shí)施例1:
一種本發(fā)明的降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌，其構(gòu)建方法包括以下步驟:
1、沼澤紅假單胞菌基因組DNA的抽提:將液體培養(yǎng)的沼澤紅假單胞菌經(jīng)離心收集后采用CTAB法進(jìn)行DNA抽提，瓊脂糖檢測(cè)DNA的濃度與完整性。具體操作如下:
I.1、將沼澤紅假單胞菌PSB-S菌株按照接種量為0.5 %(v/v)接種至液體培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基充滿培養(yǎng)瓶后密封)，在30 °C，光照強(qiáng)度為2000 Lx的光照條件下培養(yǎng)7 d。該液體培養(yǎng)基成分為:0.2 g/L Κ2ΗΡ04，0.8 g/L KH2PO4,0.2 g/L MgSO4,0.1 g/L CaSO4.2H20，0.0033g/L NaMoO4.2H20,0.005 g/L FeSO4.7H20，1.5 g/L 酵母提取物;pH 7.2。
[0036]1.2、將2 mL對(duì)數(shù)生長期的沼澤紅假單胞菌菌液在10000 rpm轉(zhuǎn)速下離心2 min收集菌體。
[0037]1.3、將步驟(2)中收集得到的菌體用500 yL TE緩沖液溶解后，加30 yL、濃度為10%(w/v)的SDS，3 mL蛋白酶K，混勻;于37 °C下培養(yǎng)I h得到培養(yǎng)液。
[0038]1.4、在步驟(3)的培養(yǎng)液中加入100 口口農(nóng)度為5 M的NaCl，混勻后加入80 yL的109i^CTAB/NaCl溶液(CTAB/NaCl溶液中NaCl的濃度為0.7 M，CTAB的濃度為10 g/L)，混勻得到混合液。
[0039]1.5、在步驟(4)的混合溶液中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混合液(酚/氯仿/異戊醇混合液中酚、氯仿、異戊醇的體積比為25:24:1)，混勻，于12000 rpm下離心5 min，取離心后的上清液。
[0040]1.6、在步驟(5)的上清液中加入等體積的氯仿/異戊醇(氯仿/異戊醇中氯仿和異戊醇的體積比為24:1)，混勻，于12000 rpm下離心5 min，取離心后的上清液。
[0041]1.7、在步驟(6)的上清液中加入3/5體積的異丙醇(異丙醇還可替換為無水乙醇，無水乙醇的體積為300?400 yL)沉淀DNA，沉淀完成后于10000 rpm下離心10 min。
[0042]1.8、將沉淀用70 %(v/v)乙醇洗滌2次，室溫干燥后加TE溶解。
[0043]1.9、在37 °C下用RNase消化I小時(shí)，即得到基因組DNA。
[0044]2、降解酯酶基因est3385的克隆
2.1、根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)沼澤紅假單胞菌降解酯酶基因est3385特異PCR擴(kuò)增引物，引物兩端引入酶切位點(diǎn)。引物序列如下:
F:CGCGGATCCGCATGAAGGACGTGGCG(SEQ ID N0.2)；
R:CCGGAATTCCGCATCGGCCG GTAGGT(SEQ ID N0.3)。
[0045]下劃線部分為引入的酶切位點(diǎn)。
[0046]2.2、利用上述引物對(duì)沼澤紅假單胞菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到完整的降解酯酶基因est3385的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0047]具體的擴(kuò)增體系為:10XPCR buffer: 5 yL； dNTP(10 mM):1 yL;上游引物/下游引物(10 μΜ)各I yL；ddH20 12 yL;總體積為20 yL。
[0048]擴(kuò)增程序?yàn)?4 °C預(yù)變性5 min,94 °C變性45 s，61 °C復(fù)性30 s，72 °C延伸60 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 °C延伸10 min。
[0049]將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，顯示在750 bp有單一條帶，與預(yù)期序列大小一致。
[0050]3、降解酯酶基因est3385原核表達(dá)載體的構(gòu)建，如圖1所示，重組質(zhì)粒的構(gòu)建按以下步驟進(jìn)行:
3.1、將PCR擴(kuò)增片段利用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoRI雙酶切，酶切位點(diǎn)位于est3385基因的首尾，并同時(shí)酶切pGEX-3x表達(dá)載體。
[0051]3.2、將酶切后的PCR產(chǎn)物和載體，進(jìn)行瓊脂糖電泳，回收降解甲氰菊酯酯酶est3385基因及酶切載體。酶切得到的降解甲氰菊酯酯酶est3385序列見Genbank登陸號(hào):KU377526(www.ncb1.nlm.nih.gov)。
[0052]est3385基因序列(SEQ ID N0.1): GTGGGCAAGGCCGCGGGCCTTGCGGCAATTCTGGCGGTGACGGGCTGTGC GGTTGGAGCGGCGCCTTCGGCTCAGGCGCAGACTGCCCAGGCGGCGCCAT CGAGTGCCTTCGCCGCCGTTCAGCCCTCGGGCAGCGGTTCGGTTGACGAC GCACAATCGGCGCAGCGCGAACGCAATCTCGCCGGCCGCGCGGTCGATAAGATGAAGGACGTGGCGCGGCAGGCGGGCGACATTTTTAGCCGGGTGCCGT
GTTTGCCGCCCAAGGGCGGGGTTCGTCCGCTCGGCTCGCTGCCCCATGTC
GCGAGCAAGCTGATCGCCGGCGATCCGGTGGTGATCGTGGCGTTCGGCTC
GTCTTCCACCCAGGGCCATGGCAGCTCGTCGCCGGCCTTCAATTATCCGA
ACCGGCTGGCCGCCCAGCTGCGCCGCCAATATCCGACCGCGGAAATCTCG
GTGATCAATCGCGGCAAGGGCGGCGAGGACGCGCCGGAAATGTTGGCGCG
GCTGAAAAGTTCAGTGCTCGATCTCAAGCCGGACCTGGTGATCTGGCAGG
TTGGCACCAATGCGATCTTGCGTGATCTCGATCCGGCCGACACCGCCAAA
ATGGTCGAAGAGGGCATTTCGGCGATCCAGGCCGCCGGCGCCGATCTGGT
GCTGGTCGATCCGCAATATGCGCCGCGCGTCAATGAGCGCGCCGAAAACG
CCGGGCGGATGATGAAGCTGCTCAACAAGGTCGCGGAAATCCGCCATGTC
GGCCTGTTCCCGCGCTTTGAAGTGATGCGTGATTGGCACGAGCGGCAATC
GGTGCCGATCGACAATTTCATCACTCCGGACGGGCTGCATATGAACGATT
GGGGCTATGCCTGCTTCGCCCAGCTGCTTGGCGACGACATCATTCGTTCG
GTCGGCCAGATCAAGCTCGGCATCCACGTGCCGTCCGACGTGCACACCTA
CCGGCCGATGTAAo
[0053]3.3、將回收后的降解甲氰菊酯酯酶^七3385基因和酶切載體用了4 DNA連接酶在16°C連接過夜得到重組載體。
[0054]4、制備工程菌:
4.1、在42°C熱激50 S，使重組載體轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(轉(zhuǎn)化方法參照[美]J.薩姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002)。
[0055]4.2、將步驟4.2得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含100 mg/L的氨芐青霉素的LB平板，37 °C過夜培養(yǎng)。
[0056]4.3、挑取平板上的陽性單菌落，采用DP106離心柱型質(zhì)粒小提試劑盒(天根生物科技(北京)有限公司)提取質(zhì)粒。
[0057]4.4、將提取后的質(zhì)粒利用PCR以及Bam H I和EcoRI雙酶切鑒定出有正確插入的克隆(即重組子)，進(jìn)一步測(cè)序確證，測(cè)序獲得的序列已經(jīng)登錄NCBI，登錄號(hào)為KU377526(www.ncb1.nlm.nih.gov)。將這種表達(dá)載體命名為pGEX_3x_3385，而含有這種表達(dá)載體的工程菌命名為Rosetta-pGEX-3x-3385，即為本發(fā)明的生產(chǎn)降解酯酶est3385的工程菌。
[0058]5、降解酯酶est3385的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白的純化與檢測(cè):
5.1、含有pGEX-3x-3385重組子的工程菌Rosetta-pGEX-3x-3385在含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37 0C培養(yǎng)過夜的得到培養(yǎng)液。
[0059]5.2、將步驟5.1的培養(yǎng)液以1:100體積比接種于20 mL的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為
0.6?0.7(培養(yǎng)時(shí)間一般為2?4 h)，加入誘導(dǎo)劑異丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.5 mM，于37 °(:繼續(xù)培養(yǎng)，并在培養(yǎng)時(shí)間為6?12 h內(nèi)取菌液檢測(cè)。取I mL菌液，離心收集菌體。在誘導(dǎo)前取I mL菌液作為對(duì)照。
[0060]5.3、分別在經(jīng)過誘導(dǎo)的菌體和對(duì)照組的菌體中加入400 yL裂解液(裂解液的組分為:50 mM NaH2P04、300 mM NaCKlO mM imidazol (ρΗ8.0)、10 yg/ml溶菌酶)，煮沸 10min，然后以12000 rpm離心5 min，分別收集上清。[0061 ] 5.4、將上清用15 %(v/v)SDS-PAGE凝膠在100 V,25 mA的電泳條件下電泳5 h，然后用考馬斯亮藍(lán)染液(考馬斯亮藍(lán)染液的成分包括:0.1 %(w/v)考馬斯亮蘭，45 %(v/v)甲醇，10 %(v/v)冰醋酸、余量的ddH20)染色15 min，最后用脫色液(脫色液的成分包括:40 v/v%甲醇，10 ν/ν%?>Κ醋酸，50 ν/ν%無菌水脫色I(xiàn) h后觀察電泳結(jié)果。電泳結(jié)果參見圖3。
[0062]從圖3的電泳結(jié)果中可知:在約55kDa處有可溶蛋白表達(dá)，此大小與序列中氨基酸序列加上標(biāo)簽GST基因融合蛋白的氨基酸分子大小基本一致，初步認(rèn)為此蛋白為融合表達(dá)降解酯酶est3385。
[0063]5.5、采用GE公司的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B試劑盒從總蛋白中純化GST和est3385融合蛋白；該試劑盒能夠特異性結(jié)合GST，利用該特異性結(jié)合GST特點(diǎn)純化融合蛋白。表達(dá)的降解酯酶est3385蛋白含有GST標(biāo)記，便于純化，可溶形式的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白純化。純化蛋白用15%( v/v)SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)，在55 kDa處可見單一條帶的表達(dá)蛋白(圖3 )，證明此蛋白為含標(biāo)簽GST的降解酯酶est3385。
[0064]6、降解酯酶est3385對(duì)甲氰菊酯的降解特性分析
6.1、溫度對(duì)降解酯酶降解效率的影響:
在5 mL離心管中加入4 mL磷酸緩沖液。在磷酸緩沖液中加入甲氰菊酯原藥和酶液(酶液即為步驟5中分離得到的降解酯酶est3385)得到混合液，使得混合液中甲氰菊酯的終濃度為100 mg/L，酶液的終濃度為10 mg/L。將上述混合液pH均為7.2，溫度分別為15、25、35、45、55、65°C的環(huán)境下下孵育I h，然后煮沸10 min，每個(gè)處理重復(fù)3次，最后萃取進(jìn)行氣相色譜分析甲氰菊酯殘留。
[0065]圖4為不同孵育溫度對(duì)酶液的處理效果影響結(jié)果，從圖4中可知:15°C?65°C下，甲氰菊酯的降解率均能達(dá)到60%以上，其中溫度為35°C時(shí)，降解率達(dá)到96.48% ο
[0066]6.2、pH對(duì)降解酯酶est3385活性的影響:
取6只5 mL的離心管，于離心管中加入4 mL的磷酸緩沖液。在磷酸緩沖液中均加入甲氰菊酯原藥和酶液得到混合液，使得混合液中甲氰菊酯的終濃度為100 mg/L，酶液的終濃度為10 mg/L。將上述混合液在35 °(:，？!1分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的條件下孵育1 h，然后煮沸10 min，每個(gè)處理重復(fù)3次，最后萃取進(jìn)行氣相色譜分析甲氰菊酯殘留。
[0067]圖5為不同pH對(duì)酶液的處理效果的影響，從圖5中可知:pH為4.0時(shí)，酶液對(duì)甲氰菊酯的降解率較低，當(dāng)pH為5.0?9.0時(shí)，酶液對(duì)甲氰菊酯的降解率明顯升高，其中pH為6.0時(shí)，酶液對(duì)甲氰菊酯的降解率最高，達(dá)到96.55%以上。
[0068]6.3、降解酯酶的底物特異性分析:
取4只5 mL的離心管，分別編號(hào)為1、2、3、4，于離心管1、2、3、4中均加入4 mL的磷酸緩沖液和酶液;接著于離心管I中加入甲氰菊酯，于離心管2中加入氯氰菊酯，于離心管3中加入聯(lián)苯菊酯，于離心管4中加入醚菊酯，使得離心管中，甲氰菊酯、氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、醚菊酯的終濃度均為100 mg/L;酶液的終濃度均為10 mg/L。將上述離心管于pH 7.2，37°C下孵育I h，然后煮沸10 min，每個(gè)處理重復(fù)3次，最后萃取進(jìn)行氣相色譜分析甲氰菊酯、氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、醚菊酯殘留。
[0069]圖6為降解酯酶的底物特異性分析結(jié)果，從圖6中可知:降解酯酶僅對(duì)甲氰菊酯高，對(duì)氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、醚菊酯的降解率均較低，具有良好的特異性。
[0070]6.4、金屬離子和化學(xué)藥物對(duì)酶活的影響: 取10只5 mL的離心管，于離心管中加入4 mL的磷酸緩沖液。在磷酸緩沖液中均加入甲氰菊酯原藥和酶液得到混合液，使得混合液中甲氰菊酯的終濃度為100 mg/L，酶液的終濃度為 10 mg/L。在上述混合溶液中分別加入Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+ (I mM) ,Tween-80,Tween-20 (I.0%)、SDS、EDTA (I mM);于 pH 7.2，37°C 下孵育 I h，然后煮沸 10 min，每個(gè)處理重復(fù)3次，最后萃取進(jìn)行氣相色譜分析甲氰菊酯。
[0071]圖7為金屬離子和化學(xué)藥物對(duì)酶活的影響結(jié)果，從圖7中可知:化學(xué)試劑吐溫-80能夠抑制降解酯酶est3385的降解活性，其他化學(xué)試劑SDS和EDTA對(duì)降解酯酶的降解活性沒有影響;金屬離子對(duì)降解酯酶est3385的降解活性具有明顯的抑制作用，且隨金屬離子的價(jià)位升高，對(duì)降解酯酶est3385的降解活性抑制作用上升，其中，F(xiàn)e3+能夠抑制降解酯酶est3385高達(dá)62%的降解活性。
[0072]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種重組載體，其特征在于，所述重組載體包括PGEX-3X表達(dá)載體和降解甲氰菊酯酯酶基因est3385;所述降解甲氰菊酯酯酶基因est3385的DNA序列為SEQ ID N0.1所示的序列;所述降解甲氰菊酯酯酶基因est3385位于所述pGEX-3x表達(dá)載體的Bam H I和EcoRI兩限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間。2.—種權(quán)利要求1所述的重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: S1、抽提沼澤紅假單胞菌的基因組DNA; S2、根據(jù)所述步驟SI的基因組DNA設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物； S3、以所述SI的基因組DNA為模板，以步驟S2的擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物； S4、酶切所述擴(kuò)增產(chǎn)物和原始載體得到酶切后的擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切后的原始載體； S5、將所述酶切后的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到所述酶切后的原始載體上得到重組載體。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟S2中所述擴(kuò)增引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的DNA序列為SEQ ID N0.2所示的序列;所述下游引物的DNA序列為SEQ ID N0.3所不的序列。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟S3中所述PCR擴(kuò)增的條件為:.94°C預(yù)變性5 min，94°C變性45 s，61°C復(fù)性30 s，72°C延伸60 s，35個(gè)循環(huán)，最后延伸10min05.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟S4中，采用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoRI雙酶切所述擴(kuò)增產(chǎn)物和原始載體;所述步驟S5具體為:將所述酶切后的擴(kuò)增產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接到所述酶切后的原始載體上得到重組載體。6.—種降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌，其特征在于，所述降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌含有權(quán)利要求1或2所述的重組載體。7.—種權(quán)利要求6所述降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:將重組載體熱激轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中得到降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌。8.—種權(quán)利要求6所述的降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌或權(quán)利要求7所述制備方法制備得到的工程菌在降解甲氰菊酯中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用方法為:將所述工程菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6qq為0.6?0.7，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷繼續(xù)培養(yǎng)得到菌液;將所述菌液與磷酸緩沖液、甲氰菊酯溶液混合、孵育，完成對(duì)甲氰菊酯的降解。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基;所述異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的濃度為0.5mM/L;加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為6?.12 h；所述孵育的溫度為15?65°C ;所述孵育的pH為5.0?9.0。
【文檔編號(hào)】A62D101/26GK105821068SQ201610181180
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年3月28日
【發(fā)明人】張松柏, 劉勇, 張德詠, 吳龍飛, 羅香文, 鄭立敏, 彭靜, 張卓, 杜嬌
【申請(qǐng)人】湖南省植物保護(hù)研究所