一種利用酶催化制備富含epa和dha甘油酯的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于油脂深加工、改性技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法。本發(fā)明以富含EPA和DHA的魚(yú)油為原料，利用脂肪酶高效選擇性催化魚(yú)油水解，并通過(guò)嚴(yán)格控制酶添加量、pH、水油比、溫度、時(shí)間等水解條件，通過(guò)分子蒸餾分離提純，獲得富集了EPA和DHA的甘油酯。為提高原料利用率，本發(fā)明還通過(guò)尿素包裹法回收分子蒸餾所得游離脂肪酸產(chǎn)物中的EPA和DHA，使之乙酯化后與分子蒸餾所得已富集了EPA和DHA的甘油酯進(jìn)行進(jìn)酯交換反應(yīng)，還進(jìn)一步提高了甘油酯中的甘三酯成分以及EPA和DHA成分。本發(fā)明方法所獲得的甘三酯型魚(yú)油中的EPA和DHA可分別提高到25％和15％以上。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于油脂深加工、改性技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)屬于多不飽和脂肪酸，是海產(chǎn)動(dòng)植物的特征性脂肪酸。作為人體不能自身合成的必需脂肪酸，它們具有預(yù)防及治療動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、癌癥、哮喘、脂肪肝、阿爾茨海默癥等多種疾病、促進(jìn)嬰幼兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)與感官器官的正常發(fā)育等保健功能。目前市場(chǎng)上的魚(yú)油甘油酯中的EPA和DHA的含量普遍偏低，僅能分別達(dá)到18%和12%左右，已不能滿(mǎn)足人們的保健及藥用需求。因此，提高EPA和DHA在甘油酯中的含量，可以提高魚(yú)油保健功效，具有重大的經(jīng)濟(jì)意義。
[0003]為提高EPA和DHA的含量，傳統(tǒng)上多采用化學(xué)法從魚(yú)油制備含有脂肪酸的乙醇酯，然后利用尿素包埋以及分子蒸餾，獲得富含EPA和DHA的乙酯型魚(yú)油產(chǎn)品。但已有研究指出乙酯型魚(yú)油在人體中的消化和吸收均較為困難，且可能有安全隱患。此外，在化學(xué)法制備過(guò)程中，往往需要用到較為極端的反應(yīng)條件(通常是高溫、高壓、不適當(dāng)?shù)腜H值)。在這些條件下，往往會(huì)造成一系列副反應(yīng)發(fā)生，如雙鍵的氧化、移位、移位，以及全順式構(gòu)型異構(gòu)化等，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量差。此外由于依賴(lài)色譜法進(jìn)行產(chǎn)物分離提純，會(huì)有能耗大、操作成本高等缺點(diǎn)，因而難以滿(mǎn)足工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)要求。
[0004]相較傳統(tǒng)化學(xué)法而言，酶催化能夠選擇性地水解和改變?cè)诟视凸羌苌系闹舅岱植?，并能克服傳統(tǒng)化學(xué)方法的缺陷，具有綠色、安全、經(jīng)濟(jì)、反應(yīng)專(zhuān)一、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。因此近來(lái)人們開(kāi)始研究利用脂肪酶制備富含EPA和DHA的甘油酯型魚(yú)油。目前已有的酶法制備甘油酯型魚(yú)油的手段主要包括酯合成、酯交換、水解三種，各有優(yōu)缺點(diǎn)。酯合成法采用甘油和游離脂肪酸為底物，游離脂肪酸需事先制備，造成了生產(chǎn)成本高，加之脂肪酸不易與甘油混合，甘油三酯產(chǎn)品得率往往偏低。酯交換法有醇解、酸解和酯-酯交換法三種，需分別使用醇、游離脂肪酸和酯(通常是甲、乙酯型魚(yú)油)作為原料，有成本較高、工藝復(fù)雜等問(wèn)題。相較而言，水解法直接使用魚(yú)油和水做原料，成本低廉，綠色安全，但其對(duì)酶的作用點(diǎn)有選擇性要求。此外，且水解反應(yīng)常將要保留的EPA和DHA也部分水解下來(lái)，故還需要嚴(yán)格控制水解程度。
[0005]魚(yú)油產(chǎn)品的分離提純通常采用分子蒸餾的方法。分子蒸餾是在高真空下進(jìn)行液-液分離的高效分離技術(shù)，具有蒸餾溫度和壓強(qiáng)低、各組分受熱時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，故能避免天然物質(zhì)在蒸餾過(guò)程中分解，非常適用于分離提純易氧化變性、高溫變性、高沸點(diǎn)的魚(yú)油。
[0006]脂肪酸的分離，通常采用尿素包合法。該法工藝簡(jiǎn)單，易于操作，形成的包合物非常穩(wěn)定，且和結(jié)晶法相比，其產(chǎn)品的過(guò)濾分離不需在很低的溫度下進(jìn)行，具有生產(chǎn)成本低、適于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是簡(jiǎn)單而有效的富集EPA和DHA的方法。
[0007]中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)CN1478875公開(kāi)了一種公開(kāi)了采用AgNO3水法對(duì)魚(yú)油的乙酯化產(chǎn)品進(jìn)行分離提純而獲得高含量的DHA、EPA方法。該法利用銀離子(Ag+)與不飽和雙鍵形成絡(luò)合物的特性，使乙酯化魚(yú)油中含不飽和雙鍵的DHA和EPA與之生成絡(luò)合物并分離出來(lái)。然而使用銀離子作為絡(luò)合劑，不僅成本高昂，而且銀離子對(duì)生物體具有毒害作用，不宜用于食品工業(yè)。
[0008]中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)CN101348807公開(kāi)了一種從魚(yú)油中富集n-3多不飽和脂肪酸甘油酯的方法。該發(fā)明用化學(xué)水解法水解魚(yú)油，并通過(guò)分離純化獲得高純度EPA及DHA，再以甘油和純化的EPA或DHA為原料，利用脂肪酶在有機(jī)相中分別催化合成EPA甘油酯或DHA甘油酯產(chǎn)品。該發(fā)明雖然效果較好，然而使用化學(xué)法水解，易發(fā)生副反應(yīng)而導(dǎo)致EPA和DHA損失。
[0009]中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)CN103509651A公開(kāi)了一種從魚(yú)油精煉副產(chǎn)物中提取富集乙酯型魚(yú)油的方法。該法以魚(yú)油精煉副產(chǎn)物的皂腳和固脂為原料，以濃鹽酸催化乙酯工藝回收皂腳、堿催化乙酯工藝回收固脂，再經(jīng)兩次三級(jí)分子蒸餾和一次尿素包合工藝，富集得到高含量的EPA和DHA乙酯型魚(yú)油。該法以濃鹽酸作為催化劑，對(duì)反應(yīng)器皿有防腐蝕的要求，且易發(fā)生副反應(yīng)導(dǎo)致EPA和DHA損失。該法需要兩次三級(jí)分子蒸餾工藝提純，工藝繁瑣，大大增加了成本，且乙酯型魚(yú)油有潛在的安全隱患。
[0010]石紅旗等在《中國(guó)海洋藥物》2001年第82期發(fā)表了《脂肪酶催化水解法濃縮魚(yú)油DHA甘油酯的研究》。該文采用國(guó)產(chǎn)假絲酵母脂肪酶在乳化劑的輔助下對(duì)魚(yú)油進(jìn)行選擇性水解，制得了富含EPA和DHA的產(chǎn)品，兩者總含量為47.9 %。然而該法需要額外添加乳化劑輔助水解。且該法水解所得游離脂肪酸副產(chǎn)物中仍然含有一定量的游離EPA和DHA，但文中并未提及對(duì)其回收利用，這就造成了副產(chǎn)物的浪費(fèi)。
[0011]楊博等在《中國(guó)油脂》2005年30卷8期、潘志杰等在《農(nóng)業(yè)機(jī)械》2012年分別發(fā)表了題目均為《脂肪酶催化魚(yú)油醇解富集EPA和DHA的研究》的文章。兩文均采用脂肪酶對(duì)魚(yú)油進(jìn)行部分醇解，將其他脂肪酸通過(guò)醇解移除，從而在甘油骨架上實(shí)現(xiàn)EPA和DHA的富集。宋詩(shī)軍在其碩士論文《酶法合成EPA、DHA甘油三酯的研究》中同樣以脂肪酶實(shí)現(xiàn)魚(yú)油的部分醇解，制得富集了 EPA和DHA的混合甘油酯，并進(jìn)一步利用偏甘油脂肪酶選擇性水解混合甘油酯中的甘油二酯，從而實(shí)現(xiàn)混合甘油酯的純化。邵佩霞在其碩士論文《富含多不飽和脂肪酸甘油酯的酶法制備》中通過(guò)乙醇對(duì)魚(yú)油進(jìn)行近乎完全的醇解，并對(duì)乙酯化的魚(yú)油進(jìn)行分子蒸餾以富集EPA和DHA的乙酯，然后再將EPA和DHA的乙酯與甘油進(jìn)行酯交換反應(yīng)從而得到富含EPA和DHA的混合甘油酯。然而所有這些方法均屬于醇解法。與水解法相比，使用乙醇比使用水的成本顯然更高，且乙醇屬于易燃易揮發(fā)溶劑，對(duì)生產(chǎn)安全不利。此外，醇解魚(yú)油所得脂肪酸乙酯副產(chǎn)物中仍然含有一定量以乙酯形式存在的EPA和DHA，但所有這些文獻(xiàn)中均未提及對(duì)其回收利用，造成了副產(chǎn)物的浪費(fèi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]為解決現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法。
[0013]本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0014]一種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法，包括以下步驟:
[0015](I)將一定量的魚(yú)油、緩沖溶液和酶加入反應(yīng)容器中，充入惰性氣體保護(hù)魚(yú)油不被氧化;在攪拌或震蕩下加熱反應(yīng)一段時(shí)間；反應(yīng)結(jié)束，將所得混合物離心后分液。上層為油相，即為富含EPA和DHA的甘油酯以及游離脂肪酸的混合物。下層為水相，其中含有酶或固定化酶，可供本步驟重復(fù)利用。
[0016](2)將步驟(I)所得上層油相進(jìn)行分子蒸餾，收集所得重相和輕相。重相主要是富含EPA和DHA的混合甘油酯，輕相主要是以飽和脂肪酸為主的游離脂肪酸。
[0017](3)取一定量的尿素、乙醇以及步驟(2)分子蒸餾所得輕相(脂肪酸)，在均勻攪拌下，于65°C加熱回流lh，然后冷卻至室溫;將混合物在低溫條件下靜置一段時(shí)間，使尿素分子充分包裹脂肪酸分子;然后進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液，通過(guò)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇得到淺黃色固狀物，用石油醚萃取固狀物數(shù)次;收集石油醚溶液蒸發(fā)除去溶劑，得到富集了游離EPA和DHA的混合脂肪酸。
[0018](4)將一定量步驟(3)得到的富集了游離EPA和DHA的混合脂肪酸、無(wú)水乙醇和脂肪酶加入到反應(yīng)容器中；在攪拌、惰性氣體保護(hù)以及40°C的條件下反應(yīng)12h;反應(yīng)后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇和水，再過(guò)濾掉脂肪酶，得到富含EPA和DHA的乙酯，過(guò)濾所得酶可為本步驟重復(fù)使用。
[0019](5)將一定量的步驟(2)所得甘油酯(即重相)、步驟(4)所得富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯、以及脂肪酶加入到反應(yīng)容器中，并充入惰性氣體保護(hù)，在攪拌、60°C和抽真空的條件下反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾收集脂肪酶，該酶可為本步驟重復(fù)使用;再通過(guò)分子蒸餾分離產(chǎn)物，收集所得重相，即為富集了 EPA和DHA的甘油三酯型魚(yú)油。
[0020]其中:
[0021 ]步驟(I)所述緩沖液和魚(yú)油的體積質(zhì)量比為0.5:1-3:1( g/mL)，優(yōu)選1: 1-1.5:1 (g/mL);酶的添加量為魚(yú)油質(zhì)量的0.1 - 0.5%。，優(yōu)選0.2%0。
[0022]步驟(I)所述魚(yú)油為富含EPA和DHA的魚(yú)油，優(yōu)選海魚(yú)魚(yú)油；所述緩沖溶液為0.lmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，溶液的pH值為5-9，優(yōu)選pH為6的磷酸鉀緩沖溶液;所述酶為脂肪酶或磷脂酶。
[0023]所述的酶選自:丹麥諾維信公司的435固定化脂肪酶(Lipozyme435)、固定化脂肪酶RM IM(Lipozyme RM IM)、固定化脂肪酶TL頂(Lipozyme TL頂)、磷脂酶，廣州紐克利生物科技有限公司的脂肪酶系列產(chǎn)品CALB、RML，日本天野生物酶制劑有限公司(AmanoEnzyme)的脂肪酶系列產(chǎn)品Lipase AY“Amano”40OSD、脂肪酶MER、Lipase AY“Amano”3OSD-K、Lipase DF “Amano” 15、Lipase A “Amano” 12-K;優(yōu)選為日本天野生物酶制劑有限公司的Lipase AY“Amano”400SDo
[0024]步驟(I)所述反應(yīng)溫度為25-50°C，優(yōu)選35°C ；所述反應(yīng)時(shí)間為8_24h，優(yōu)選1h；所述攪拌或震蕩的轉(zhuǎn)速為200r/min。
[0025]步驟(2)所述分子蒸餾的具體步驟為:將步驟(I)所得上層油相加入到二級(jí)分子蒸餾裝置的進(jìn)料罐中；通過(guò)第一級(jí)分子蒸餾，在90°C下對(duì)油相進(jìn)行脫水、脫氣;設(shè)定第二級(jí)分子蒸饋真空度0.1Pa、刮膜轉(zhuǎn)速300r/min、進(jìn)料量流速1.0mL/min，在一定溫度下分離油相，收集所得重相和輕相;所述第二級(jí)分子蒸餾的溫度為140-190°C，優(yōu)選150-160°C。
[0026]步驟(3)所述用于包裹脂肪酸的尿素和乙醇的質(zhì)量比為1:6-1:2，優(yōu)選1:3;尿素與輕相(游離脂肪酸)質(zhì)量比為1:1-3:1，優(yōu)選2.5:1。
[0027]步驟(3)所述低溫條件為-15-15V，優(yōu)選5 V ;所述在低溫下的靜置時(shí)間為0.5_3h，優(yōu)選1.5h。
[0028]步驟(4)所述富集了游離EPA和DHA的混合脂肪酸與無(wú)水乙醇的質(zhì)量比為1:1-4:1,優(yōu)選10:3(約3.3:1)，所述脂肪酶為諾維信435固定化脂肪酶(Lipozyme 435)或諾維信固定化脂肪酶TL頂(Lipozyme TL頂)，脂肪酶的添加量為富集了游離EPA和DHA的混合脂肪酸質(zhì)量的3%。
[0029]步驟(5)所述甘油酯和富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯的質(zhì)量比為1:7.2，即甘油酯游離羥基與乙酯的摩爾比為1:1，，所述脂肪酶為諾維信435固定化脂肪酶(Lipozyme 435)或諾維信固定化脂肪酶TL IM(Lipozyme TL IM)，脂肪酶的添加量為甘油酯和富含EPA和DHA的脂肪fe乙酷總質(zhì)量的2%。
[0030]步驟(5)所述分子蒸餾的具體步驟為:將產(chǎn)物加入到二級(jí)分子蒸餾裝置的進(jìn)料罐中；通過(guò)第一級(jí)分子蒸餾，在90 °C下對(duì)油相進(jìn)行脫水、脫氣；設(shè)定第二級(jí)分子蒸餾真空度0.1Pa、刮膜轉(zhuǎn)速300r/min、進(jìn)料量流速1.0mL/min，在一定溫度下分離油相，收集所得重相和輕相;第二級(jí)分子蒸餾的溫度為140_190°C，優(yōu)選150-160°C。
[0031]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0032](I)本發(fā)明的關(guān)鍵在于利用了脂肪酶催化水解的選擇性達(dá)到在甘油酯上富集EPA和DHA，即由于二者的空間位阻較大，不易被酶從甘油骨架上水解下來(lái)，并且通過(guò)嚴(yán)格控制反應(yīng)程度，最大程度地將EPA和DHA保留在甘油酯分子上。
[0033](2)本發(fā)明中以酶催化水解富集EPA和DHA，與醇解和酯交換等其他可用于富集EPA和DHA的酶反應(yīng)相比，是以水作為反應(yīng)物，具有廉價(jià)安全的優(yōu)點(diǎn)。此外，水解法有利于保留酶的活性和回收利用。
[0034](3)本發(fā)明中的水解、酯化、酯交換反應(yīng)均采用酶作為催化劑，與傳統(tǒng)化學(xué)反應(yīng)方式相比，具有綠色、環(huán)保、條件溫和、反應(yīng)選擇性高、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，并避免了EPA和DHA在反應(yīng)過(guò)程中因氧化等副反應(yīng)損失，且不需要使用防腐蝕的反應(yīng)裝置，有利于節(jié)省生產(chǎn)設(shè)備的投入。
[0035](4)本發(fā)明為提高原料中EPA和DHA的利用率，在生產(chǎn)流程中增加了對(duì)兩者的回收利用步驟。即利用尿素包合法提取水解反應(yīng)所得游離脂肪酸副產(chǎn)物中的少量EPA和DHA，并通過(guò)乙酯化和酯交換對(duì)兩者進(jìn)行回收利用，具有反應(yīng)效率高的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還提高了甘油酯中的甘油三酯含量以及EPA和DHA的含量。
【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1是本發(fā)明中利用I，3位選擇性脂肪酶催化魚(yú)油選擇性水解富集EPA和DHA的反應(yīng)原理示意圖。
[0037]圖2為本發(fā)明所述制備富集EPA和DHA的甘油三酯的工藝流程圖。
[0038]圖3是本發(fā)明所述魚(yú)油經(jīng)水解和分子蒸餾后所得重相(混合甘油酯中間產(chǎn)品)的甘油酯組成分析氣相色譜圖。
[0039]圖4是本發(fā)明所述魚(yú)油經(jīng)水解和分子蒸餾后所得重相(混合甘油酯中間產(chǎn)品)的脂肪酸組成分析氣相色譜圖。
[0040]圖5是本發(fā)明所述魚(yú)油水解并經(jīng)分子蒸餾后所得輕相(游離脂肪酸副產(chǎn)品)的脂肪酸組成分析氣相色譜圖。
[0041]圖6是本發(fā)明所述甘油三酯型魚(yú)油終產(chǎn)品的甘油酯組成分析氣相色譜圖。
[0042]圖7是本發(fā)明所述甘油三酯型魚(yú)油終產(chǎn)品的脂肪酸組成分析氣相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0044]實(shí)施例1
[0045]—種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法，工藝流程如圖2所示，包括以下步驟:
[0046](I)將30.0g挪亞圣諾生物有限公司的精制魚(yú)油、30.0mL磷酸鉀緩沖溶液(0.1mol/L，pH = 6)和6.0mg日本天野酶制劑有限公司的Lipase AY“Amano”400SD加入到10mL的錐形瓶中，并向燒瓶中充入氮?dú)庖耘懦諝?，封口。將錐形瓶放入搖床中，設(shè)定震蕩速率為200r/min，搖床溫度為35°C，維持反應(yīng)10h。反應(yīng)結(jié)束，將所得混合物離心分液。所得上層油相為富含EPA和DHA的甘油酯以及游離脂肪酸的混合物，下層為含有脂肪酶的水相。
[0047](2)共積累200g前述步驟(I)所得上層油相，將其加入到二級(jí)分子蒸餾裝置的進(jìn)料罐中。通過(guò)第一級(jí)分子蒸餾，在90°C下對(duì)油相進(jìn)行脫水、脫氣;設(shè)定第二級(jí)分子蒸餾真空度
0.1Pa、刮膜轉(zhuǎn)速300r/min、進(jìn)料量流速1.011117111；[11，在150<€下分離油相，收集蒸饋所得重相和輕相。重相為富含EPA和DHA的混合甘油酯，質(zhì)量為112g，對(duì)應(yīng)產(chǎn)率為56.0%;重相中含有70.7%甘油三酯，28.3%甘油二酯，0.85%甘油單酯，0.41 %游離脂肪酸(圖3);重相所含脂肪酸中，EPA占25.3%，DHA占21.1% (圖4)。分子蒸餾所得輕相主要是以飽和脂肪酸為主的游離脂肪酸，質(zhì)量為79.2g，對(duì)應(yīng)產(chǎn)率為39.6%，其中EPA含量為11.4%，DHA含量為2.01%(圖 5)。
[0048](3)取125g尿素、375g體積濃度為95%的乙醇，以及50g分子蒸餾所得輕相(游離脂肪酸)，加入到IL圓底燒瓶中，在均勻攪拌下，于65°C加熱回流lh，然后冷卻至室溫。將混合物在5°C下靜置1.5h，使尿素分子充分包裹脂肪酸分子。然后進(jìn)行過(guò)濾并收集濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去濾液中的乙醇，得到淺黃色固狀物。用50.0mL石油醚萃取固狀物，重復(fù)萃取步驟3次，收集所得石油醚溶液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去石油醚，即得到富集了 EPA和DHA的混合脂肪酸，質(zhì)量為8.3g，收率為16.6%，其中含有48.7^^厶和11.8%0擬。
[0049](4)多次重復(fù)前述步驟(I)?(3)，收集所得混合脂肪酸。取25.0g該混合脂肪酸，7.5g無(wú)水乙醇，和0.75g丹麥諾維信公司的Lipozyme 435固定化脂肪酶加入到反應(yīng)容器中。在磁力攪拌、充氮?dú)獗Ｗo(hù)和40°C的條件下反應(yīng)12h。反應(yīng)后通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇和反應(yīng)生成的水，再過(guò)濾掉LipOZyme435固定化脂肪酶，過(guò)濾所得酶可為本步驟重復(fù)使用。得到富含EPA和DHA的乙酯，其中的EPA乙酯含量為47.8%, DHA乙酯含量為11.4%。
[0050](5)將144g從步驟(2)累積所得的富含EPA和DHA的混合甘油酯、20g步驟(4)所得富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯，以及1.64g丹麥諾維信公司的Lipozyme 435固定化脂肪酶到反應(yīng)容器中，并充入氮?dú)獗Ｗo(hù)。在磁力攪拌、60°C和抽真空的條件下反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾收集脂肪酶。該酶可為本步驟重復(fù)使用。通過(guò)如步驟(2)所述的分子蒸餾條件分離產(chǎn)物，收集所得重相，即為富集了EPA和DHA的甘油三酯型魚(yú)油產(chǎn)品，質(zhì)量為145g，產(chǎn)率為88.4 % ;其中的甘油三酯含量為97.6%,甘油二酯含量為2.43 % (圖6);甘油酯產(chǎn)品的脂肪酸組成中，EPA占25.6%，0擬占17.4%(圖7)。[0051 ] 即經(jīng)過(guò)上述工藝流程后，魚(yú)油脂肪酸組成中的EPA和DHA含量，從原料中的18 %和12%分別提高到產(chǎn)品中的25.6%和17.4%，兩者之和從30%提高到43%。
[0052]甘油酯組成的檢測(cè):將30.0mg樣品溶于2.0mL正己烷中，通過(guò)0.45μπι的濾膜對(duì)溶液過(guò)濾。檢測(cè)條件為:采用安捷倫氣相色譜儀，使用DB-1ht毛細(xì)管柱(15mX 0.25mm 1.d.，0.1μm)，氮?dú)庾鳛檩d氣，恒定柱壓23.12psi，分流比20:1，進(jìn)樣量為Ιμπι。進(jìn)樣口和檢測(cè)口溫度為380°C，空氣和氫氣流速分別為300mL/min和30mL/min，尾吹氮?dú)饬魉贋?2.41mL/min。柱箱升溫程序:初溫100°C，在該溫度下保持lmin，然后以50°C/min速率升至160°C;第二階段以5°C/min的速率升至190°C，保持2min，第三階段以50°C/min的速率升至320°C ;保持2min，第四階段先以50°C/min升至380°C，保持5min。步驟(5)制得的富集了 EPA和DHA的甘油三酯型魚(yú)油產(chǎn)品和步驟(2)得到的混合甘油酯都是用此方法測(cè)。
[0053]脂肪酸組成的檢測(cè):首先依照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T17376-2008(動(dòng)植物油脂脂肪酸甲酯制備)所規(guī)定的方法對(duì)樣品進(jìn)行甲酯化，然后依照GB/T 17377-2008(動(dòng)植物油脂脂肪酸甲脂的氣相色譜分析)中的方法檢測(cè)甲酯化樣品中脂肪酸的組成。
[0054]實(shí)施例2
[0055]本實(shí)施實(shí)例除以下技術(shù)特征外同實(shí)施例1:
[0056]步驟(I)中所用緩沖溶液為0.lmol/L的磷酸鉀溶液(pH 7 )，所用緩沖溶液體積為45mL ；酶添加量為15mg ；反應(yīng)溫度為50 °C，反應(yīng)時(shí)間為8h。
[0057]步驟(2)中所用第二級(jí)分子蒸餾的溫度為140°C。分子蒸餾后，所得重相質(zhì)量為106.6g，對(duì)應(yīng)產(chǎn)率為53.3%;重相中含有69.0%甘油三酯，30.0%甘油二酯，0.80%甘油單酯，0.21 %游離脂肪酸;重相所含脂肪酸中，EPA占25.0 %，DHA占20.2 %。分子蒸餾所得輕相主要是以飽和脂肪酸為主的游離脂肪酸，質(zhì)量為81.2g，對(duì)應(yīng)產(chǎn)率為40.6%，其中EPA含量為12.4%，DHA含量為 1.95%。
[0058]步驟(3)中所用95%乙醇(體積濃度為95%的乙醇)的質(zhì)量為250g，輕相質(zhì)量為125g(重復(fù)兩次步驟(I)后積累可得)；靜置溫度為-15°C，靜置時(shí)間為0.5h。所得富集EPA和DHA的混合脂肪酸質(zhì)量為20.2g，收率為16.2%，其中含有50.2%EPA和10.6%DHA。
[0059]步驟(4)中所用無(wú)水乙醇用量為25g，所用酶為諾維信固定化脂肪酶TL頂。反應(yīng)后得到乙酯中的EPA乙酯含量為49.2%, DHA乙酯含量為10.1%。
[0060]步驟(5)中所用酶為諾維信固定化脂肪酶TL頂。經(jīng)分子蒸餾后得到甘油三酯型魚(yú)油產(chǎn)品，質(zhì)量為142g，產(chǎn)率為86.6%，其中的甘油三酯含量為96.4%，甘油二酯含量為2.79%;甘油酯的脂肪酸組成中，EPA占25.0%，DHA占17.1%。
[0061 ] 實(shí)施例3
[0062]本實(shí)施實(shí)例除以下技術(shù)特征外同實(shí)施例1:
[0063]步驟(I)中所用緩沖溶液為0.lmol/L的磷酸鉀溶液(pH 6.5)，所用緩沖溶液體積為90mL ；酶添加量為3.0mg ；反應(yīng)溫度為25 °C，反應(yīng)時(shí)間為24h。
[0064]步驟(2)中所用第二級(jí)分子蒸餾的溫度為160°C。分子蒸餾后，所得重相質(zhì)量為100.1g，對(duì)應(yīng)產(chǎn)率為50.1%;重相中含有64.5%甘油三酯，34.0%甘油二酯，1.20%甘油單酯，0.24 %游離脂肪酸;重相所含脂肪酸中，EPA占23.2 %，DHA占20.1 %。分子蒸餾所得輕相主要是以飽和脂肪酸為主的游離脂肪酸，質(zhì)量為85.2g，其中EPA含量為13.3 %，DHA含量為2.53%。
[0065]步驟(3)中所用95%乙醇(體積濃度為95%的乙醇)的質(zhì)量為750g，輕相質(zhì)量為31.25g;靜置溫度為15°C，靜置時(shí)間為3h。所得富集EPA和DHA的混合脂肪酸質(zhì)量為4.06g，收率為 14.7%，其中含有 46.1%ΕΡΑ 和 10.1%DHA。
[ΟΟ??]步驟(4)中所用無(wú)水乙醇用量為6.25g。反應(yīng)后得到乙酯中的EPA乙酯含量為46.0%，DHA乙酯含量為10.0%。
[0067]步驟(5)中所用酶為諾維信固定化脂肪酶TL頂。經(jīng)分子蒸餾后得到甘油三酯型魚(yú)油產(chǎn)品，質(zhì)量為139g，產(chǎn)率為84.7%，其中的甘油三酯含量為93.1%，甘油二酯含量為5.81%;甘油酯的脂肪酸組成中，EPA占23.9%，DHA占16.9%。
[0068]實(shí)施例4
[0069]本實(shí)施實(shí)例除以下技術(shù)特征外同實(shí)施例1:
[0070]步驟(I)中所用緩沖溶液為0.lmol/L的磷酸鉀溶液(pH 9)，所用緩沖溶液體積為15mL;酶添加量為9.0mg;反應(yīng)溫度為30 °C，反應(yīng)時(shí)間為20h。
[0071]步驟(2)中所用第二級(jí)分子蒸餾的溫度為190°C。分子蒸餾后，所得重相質(zhì)量為99.5g，對(duì)應(yīng)產(chǎn)率為49.8%;重相中含有60.0%甘油三酯，35.1%甘油二酯，3.50%甘油單酯，2.42%游離脂肪酸;重相所含脂肪酸中，EPA占22.3%，DHA占18.2%。分子蒸餾所得輕相主要是以飽和脂肪酸為主的游離脂肪酸，質(zhì)量為79.5g，對(duì)應(yīng)產(chǎn)率為39.8%，其中EPA含量為13.0%，DHA含量為2.17%。
[0072]步驟(3)中所用95%乙醇(體積濃度為95%的乙醇)的質(zhì)量為500g，輕相質(zhì)量為62.5g;靜置溫度為0°C，靜置時(shí)間為2h。所得富集EPA和DHA的混合脂肪酸質(zhì)量為7.9g，收率為 12.6%，其中含有 40.2%ΕΡΑ 和 10.3%DHA。
[0073]步驟(4)中所用無(wú)水乙醇用量為12.5g，所用酶為諾維信435固定化脂肪酶。反應(yīng)后得到乙酯中的EPA乙酯含量為49.2%, DHA乙酯含量為10.1%。
[0074]步驟(5)中所用酶為諾維信435固定化脂肪酶。經(jīng)分子蒸餾后得到甘油三酯型魚(yú)油產(chǎn)品，質(zhì)量為134g，產(chǎn)率為81.7%，其中的甘油三酯含量為90.2%，甘油二酯含量為7.10%;甘油酯的脂肪酸組成中，EPA占25.0%，DHA占16.5%。
[0075]實(shí)施例5
[0076]本實(shí)施實(shí)例除以步驟(I)中所用緩沖溶液為0.lmol/L的磷酸鉀溶液(pH 5)，步驟
(I)所用酶來(lái)自于實(shí)例I中所回收的脂肪酶，步驟(4)和步驟(5)所用酶分別為實(shí)例I中對(duì)應(yīng)步驟所回收的諾維信435固定化脂肪酶，其他技術(shù)特征外同實(shí)施例1。最后得到產(chǎn)品的甘油三酯含量為89.7%,甘油二酯含量為8.10%；甘油酯的脂肪酸組成中，EPA占25.2 %，DHA占17.3%。
[0077]實(shí)施例6
[0078]本實(shí)施實(shí)例除以步驟(I)中所用緩沖溶液為0.lmol/L磷酸鈉溶液(pH 6)，步驟(I)中所用酶為諾維信磷脂酶，其他技術(shù)特征外同實(shí)施例1。最后得到產(chǎn)品的甘油三酯含量為84.2%，甘油二酯含量為10.3% ;甘油酯的脂肪酸組成中，EPA占23.4%，DHA占16.8%。
[0079]實(shí)施例7
[0080]本實(shí)施實(shí)例除以步驟(I)中所用酶為廣州紐克利生物科技有限公司的脂肪酶CALB，其他技術(shù)特征外同實(shí)施例1。最后得到產(chǎn)品的甘油三酯含量為86.8%,甘油二酯含量為11.8%;甘油酯的脂肪酸組成中，EPA占22.6%，DHA占15.8%。
[0081]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將一定量的魚(yú)油、緩沖溶液和酶加入反應(yīng)容器中，充入惰性氣體保護(hù)，在攪拌或震蕩下加熱反應(yīng)一段時(shí)間;反應(yīng)結(jié)束，將所得混合物離心后分液，上層為油相，下層為水相； (2)將步驟(I)所得上層油相進(jìn)行分子蒸餾，收集所得重相和輕相； (3)取一定量的尿素、乙醇以及步驟(2)分子蒸餾所得輕相，在均勻攪拌下，于65°C加熱回流Ih，然后冷卻至室溫;將混合物在低溫條件下靜置一段時(shí)間；然后進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到淺黃色固狀物，用石油醚萃取固狀物數(shù)次，得到富集了游離EPA和DHA的混合脂肪酸； (4)將一定量步驟(3)得到的富集了游離EPA和DHA的混合脂肪酸、無(wú)水乙醇和脂肪酶加入到反應(yīng)容器中；在攪拌、惰性氣體保護(hù)以及40°C的條件下反應(yīng)12h;反應(yīng)后旋蒸，過(guò)濾，得至IJ富含EPA和DHA的乙酯； (5)將一定量的步驟(2)所得重相、步驟(4)所得富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯、以及脂肪酶加入到反應(yīng)容器中，并充入惰性氣體保護(hù)，在攪拌、600C和抽真空的條件下反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾;再通過(guò)分子蒸餾分離產(chǎn)物，收集所得重相，即為富集了EPA和DHA的甘油三酯型魚(yú)油。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，步驟(I)所述緩沖液和魚(yú)油的體積質(zhì)量比為0.5:1-3:1;酶的添加量為魚(yú)油質(zhì)量的0.1-0.5%ο ο3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，步驟(I)所述魚(yú)油為魚(yú)油;所述緩沖溶液為0.lmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，緩沖溶液的pH值為5-9;所述酶為脂肪酶或磷脂酶。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，步驟(I)所述反應(yīng)溫度為25-50°C;所述反應(yīng)時(shí)間為8-24h;所述攪拌或震蕩的轉(zhuǎn)速為200r/mino5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，步驟(2)所述分子蒸餾的具體步驟為:將步驟(I)所得上層油相加入到二級(jí)分子蒸餾裝置的進(jìn)料罐中；通過(guò)第一級(jí)分子蒸餾，在90°C下對(duì)油相進(jìn)行脫水、脫氣;設(shè)定第二級(jí)分子蒸餾真空度0.1Pa、刮膜轉(zhuǎn)速300r/min、進(jìn)料量流速1.0mL/min，在140-190°C下分離油相，收集所得重相和輕相。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，步驟(3)所述尿素和乙醇的質(zhì)量比為1:6-1:2;尿素與輕相質(zhì)量比為1:1-3:1。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，步驟(3)所述低溫條件為-15-15Γ;所述在低溫下的靜置時(shí)間為0.5-3h。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，步驟(4)所述富集了游離EPA和DHA的混合脂肪酸與無(wú)水乙醇的質(zhì)量比為1:1-4:1;所述脂肪酶為諾維信435固定化脂肪酶或諾維信固定化脂肪酶TL IM，脂肪酶的添加量為富集了游離EPA和DHA的混合脂肪酸質(zhì)量的3%。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，步驟(5)所述甘油酯和富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯的質(zhì)量比為1:7.2，所述脂肪酶為諾維信435固定化脂肪酶或諾維信固定化脂肪酶TL IM，脂肪酶的添加量為甘油酯和富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯總質(zhì)量的2%。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用酶催化制備富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，步驟(5)所述分子蒸餾的具體步驟為:將產(chǎn)物加入到二級(jí)分子蒸餾裝置的進(jìn)料罐中；通過(guò)第一級(jí)分子蒸餾，在90°C下對(duì)油相進(jìn)行脫水、脫氣;設(shè)定第二級(jí)分子蒸餾真空度0.1Pa、刮膜轉(zhuǎn)速300r/min、進(jìn)料量流速1.0mL/min，在140-190°C下分離油相，收集所得重相和輕相。
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK105821088SQ201610363457
【公開(kāi)日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年5月26日
【發(fā)明人】汪勇, 劉芳, 滕英來(lái)
【申請(qǐng)人】暨南大學(xué)