混合酶解-膜過(guò)濾制備中華鱉降壓肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及降壓肽的制備方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種中華鱉通過(guò)混合酶解?膜過(guò)濾的方法制備降壓肽，主要包括原料預(yù)處理、混合酶水解、滅酶、離心過(guò)濾、膜過(guò)濾、凍干等關(guān)鍵步驟，其中混合酶水解過(guò)程中混合酶的各配方質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為：木瓜蛋白酶39?44％、中性蛋白酶28?33％、胰蛋白酶24?28％。采用本發(fā)明混合酶水解方法制備，酶利用高，中華鱉降壓肽轉(zhuǎn)化率高，中華鱉降壓肽的抑制率也較高，同時(shí)混合酶水解和膜過(guò)濾兩個(gè)過(guò)程可以采用連續(xù)式進(jìn)行，達(dá)到連續(xù)化的操作，易于工業(yè)化生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率。
【專利說(shuō)明】
混合酶解-膜過(guò)濾制備中華鱉降壓肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及降壓肽的制備方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種混合酶解-膜過(guò)濾制備中 華鱉降壓肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中華鱉(Pelodiscus sinensis)俗稱甲魚(yú)、團(tuán)魚(yú)，主要產(chǎn)于中國(guó)、日本及東南亞等 國(guó)家和地區(qū)，中華鱉養(yǎng)殖業(yè)是我國(guó)淡水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中經(jīng)濟(jì) 效益較高的養(yǎng)殖種類。中醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為，中華鱉有滋陽(yáng)涼血、益腎壯陽(yáng)、清熱散結(jié)、益氣健胃功 效，中華鱉的肉、血、卵、膽、脂肪、甲、尿均可入藥，適用于骨蒸勞熱、久瘧久痢、脫肛等疾病。 中華鱉是傳統(tǒng)的健康養(yǎng)生食品，經(jīng)常食用有延年益壽功效，深得廣大消費(fèi)者的青睞。
[0003] 血壓是血液在血管內(nèi)流動(dòng)時(shí)對(duì)血管壁所施加的壓力，高血壓病是一種動(dòng)脈血管壓 力升高的慢性疾病，它最大的危害在于對(duì)全身血管造成長(zhǎng)期超極限的額外壓力，導(dǎo)致血管 的脆性損傷，最終引起血管的破裂、堵塞，各種心腦血管疾病、腎臟病、眼底疾病、神經(jīng)系統(tǒng) 疾病等都可由它引起，高血壓病是導(dǎo)致中老年人死亡的罪魁禍?zhǔn)字?。?jù)國(guó)際高血壓學(xué)會(huì) 發(fā)表的新聞公報(bào)(2009年），全球大約有9.72億人患高血壓或血壓偏高癥，相當(dāng)于世界成年 (18周歲以上)人口的26.4%，中國(guó)成人高血壓患病率為25.2%，其高患病率、致死率嚴(yán)重威 脅著人類的健康。
[0004] 降壓肽最早是1965年由Ferriera首次從南美洲蝮蛇的毒液中發(fā)現(xiàn)。研究者證明， 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin I-converting enzyme，ACE)通過(guò)對(duì)腎素-血管緊張素-醛 固酮系統(tǒng)（ReninAngiotensin System，RAS)和血管舒緩激肽-激肽-前列腺素系統(tǒng) (Bradykinin Kinin System，BKS)的控制實(shí)現(xiàn)對(duì)人體血壓進(jìn)行調(diào)節(jié)，其生理過(guò)程如圖1所 不。
[0005] ACE抑制劑(ACEI)的作用是通過(guò)抑制ACE的活性，使血管緊張素II的生成和激肽的 破壞均減少，從而達(dá)到降低血壓的目的。ACEI屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，作用于ACE的活性區(qū)域，它 們與ACE的親和力比血管緊張素I或舒緩激肽更強(qiáng)，而且也不易從ACE結(jié)合區(qū)釋放，使得ACE 失去其原有的活性，從而阻礙ACE催化水解舒緩激肽和血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素n兩 種生化反應(yīng)過(guò)程，起到降血壓的作用。
[0006] 目前，生物活性肽生產(chǎn)常用的方法有四種：（1)化學(xué)合成法、（2)酶解法、（3)重組 DNA技術(shù)、（4)發(fā)酵法。化學(xué)合成法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)高價(jià)值的中長(zhǎng)肽缺點(diǎn)是成本高，而且在 合成過(guò)程中可能產(chǎn)生對(duì)健康和環(huán)境有害的物質(zhì);重組DNA技術(shù)也被廣泛應(yīng)用，但這種方法需 要昂貴的材料和設(shè)備，投資大，成本高，其安全性還需進(jìn)一步檢測(cè)，且多限于多肽的生產(chǎn)，而 生物活性肽大都是短肽，所以重組DNA技術(shù)在這方面的應(yīng)用是有限的;發(fā)酵法是選取微生物 菌種進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生具有活性的肽序列，該方法生產(chǎn)活性肽安全易操作，但生 產(chǎn)時(shí)間較長(zhǎng)，該法在乳源性活性肽生產(chǎn)方面應(yīng)用較多;酶法生產(chǎn)活性肽則有許多優(yōu)點(diǎn)，該法 可生產(chǎn)大量短肽，反應(yīng)條件溫和反應(yīng)過(guò)程易于控制，生產(chǎn)時(shí)間短，且所用試劑和原料均是食 品級(jí)的，安全性高。因此，活性肽的研究和生產(chǎn)主要采用酶解的方法進(jìn)行。
[0007] 然而傳統(tǒng)酶法制備ACE抑制肽存在酶利用率不高、底物過(guò)度降解，以及操作不具備 連續(xù)性等問(wèn)題，而采用混合酶法-膜過(guò)濾使反應(yīng)盡可能向產(chǎn)物方向進(jìn)行，因而得到比傳統(tǒng)制 取工藝更高的轉(zhuǎn)化率，從而制備中華鱉降壓肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種混合酶解-膜 過(guò)濾制備中華鱉降壓肽的方法，該方法酶利用率高，混合酶有效提高了中華鱉降壓肽轉(zhuǎn)化 率，同時(shí)制備出的中華鱉降壓肽抑制作用也得到了提高。
[0009] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:一種混合酶解-膜過(guò)濾制備中華鱉降壓肽的方法，該 方法包括以下步驟：
[0010] (1)原料預(yù)處理:將中華鱉肉絞成肉糜，并加肉糜質(zhì)量1-10倍的水勻漿，得到以中 華鱉肉泥作為底物的底物溶液備用；
[0011] (2)混合酶水解:將步驟(1)制得的底物溶液置于溫度50-60°C水浴中，調(diào)節(jié)底物溶 液PH8-9.5，加混合酶攪拌酶解2-3小時(shí)，得酶解液；
[0012] (3)滅酶:將步驟(2)中的酶解液在95-100°C下持續(xù)15-20min滅酶處理，得到滅酶 后的混合液體；
[0013] (4)離心過(guò)濾：將上述步驟（3)得到的液體，采用4500-5000r/min轉(zhuǎn)速離心10- 30min，得上清液；
[0014] (5)膜過(guò)濾：調(diào)步驟(4)的上清液pH 7-7 ? 5，并在壓力0 ? 2-0 ? 25MPa、溫度20-30 °C條 件下，經(jīng)超濾膜或納濾膜超濾，收集分子量小于l〇〇〇Da的超濾液；
[0015] (6)凍干:將步驟(5)中的超濾液進(jìn)行冷凍干燥，即得到中華鱉降壓肽。
[0016] 所述混合酶水解和膜過(guò)濾過(guò)程可以同時(shí)連續(xù)進(jìn)行的，連續(xù)操作的具體裝置設(shè)計(jì)如 圖2所示，其中膜過(guò)濾組件包括調(diào)節(jié)pH、納濾脫鹽等步驟，同時(shí)在產(chǎn)品出口處截留的分子量 大的部分還可以回到原料液進(jìn)行再次酶解，提高生產(chǎn)效率。
[0017] 作為優(yōu)選，步驟(2)中混合酶的各配方質(zhì)量百分?jǐn)?shù)如下:木瓜蛋白酶39-44%、中性 蛋白酶28-33%、胰蛋白酶24-28%，因?yàn)锳CE是小分子肽，通過(guò)混合酶的酶解作用更有利于 獲得小分子的短肽，混合酶的同時(shí)加入起到加快水解長(zhǎng)鏈得到短肽的目的，同時(shí)混合酶生 產(chǎn)出來(lái)的ACE抑制酶的活性較高。
[0018]作為優(yōu)選，步驟(2)中將底物溶液加水調(diào)節(jié)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4-8%，混合酶加入量為底 物總質(zhì)量的1-3 %，單個(gè)酶只能水解底物的某一部位，所以對(duì)于水解來(lái)說(shuō)利用率不高，而混 合酶同時(shí)切入的位點(diǎn)多，有利于得到較多的小片段肽，此時(shí)酶的水解作用最充分，水解能力 最高，而且三種酶的利用率因其相互促進(jìn)和協(xié)調(diào)也得到提升。
[0019] 步驟(3)中酶解液在95-100 °C下持續(xù)15-20min進(jìn)行滅酶處理，使滅酶過(guò)程更徹底。
[0020] 作為優(yōu)選，在所述步驟(5)膜過(guò)濾之前，將步驟(4)得到的上清液中加水使其多肽 濃度為2-3%，因?yàn)殡S著酶解作用的進(jìn)行，溶液中多肽濃度逐漸升高，稀釋上清液有利于在 膜過(guò)濾中減小膜承受的壓力，防止膜通道的堵塞，有利于后續(xù)的膜分離。
[0021] 作為優(yōu)選，所述步驟(5)得到超濾液后還包括納濾脫鹽:將步驟(5)得到的超濾液 加水調(diào)節(jié)使其多肽濃度為2-3%，并在壓力0.5-0.6MPa、溫度20-30°C的條件下納濾脫鹽。因 為在調(diào)整pH過(guò)程加入酸或堿導(dǎo)致溶液中有鹽類物質(zhì)殘留，且酶解后有部分離子產(chǎn)生，納濾 脫鹽步驟能夠?qū)⒚擕}和短肽的過(guò)濾濃縮同步進(jìn)行，對(duì)低分子量降壓肽和鹽的分離有很好效 果。優(yōu)選當(dāng)分子量5000Da左右的物質(zhì)較多時(shí)，采用超濾膜過(guò)濾，然后再經(jīng)過(guò)納濾膜超濾；當(dāng) 分子量在l〇〇〇Da左右的物質(zhì)較多時(shí)，直接采用納濾膜超濾。
[0022] 采用以上制備方法后，本發(fā)明的一種混合酶解-膜過(guò)濾制備中華鱉降壓肽的方法 與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0023] 1.本發(fā)明采用混合酶水解的制備方法，提高了中華鱉降壓肽的抑制率，混合酶水 解方法制備的降壓肽轉(zhuǎn)化率也較高，利用混合酶可生產(chǎn)大量短肽，反應(yīng)條件溫和、易于控 制，所得廣品品質(zhì)好；
[0024] 2.膜過(guò)濾組件的過(guò)濾過(guò)程兼具分離、濃縮、純化和精制的功能，通過(guò)膜過(guò)濾的方法 有效分離出小分子物質(zhì)中華鱉降壓肽，同時(shí)納濾脫鹽步驟提高最終降壓肽產(chǎn)品的純度，不 僅使得降壓肽品質(zhì)更好，而且最終產(chǎn)品的得率也有所提高；
[0025] 3.所述混合酶水解和膜過(guò)濾過(guò)程可以同時(shí)連續(xù)進(jìn)行，連續(xù)操作的具體裝置設(shè)計(jì)如 圖2所示，截留的分子量大的部分還可以回到原料液進(jìn)行再次酶解。將混合酶水解和膜過(guò)濾 兩個(gè)過(guò)程可以采用連續(xù)的方式進(jìn)行，達(dá)到連續(xù)化的操作，易于工業(yè)化生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率， 采用混合酶水解-膜過(guò)濾連續(xù)進(jìn)行，由于產(chǎn)物也是連續(xù)采出，而使反應(yīng)盡可能向產(chǎn)物方向進(jìn) 行，因而得到比傳統(tǒng)制取工藝更高的轉(zhuǎn)化率。同時(shí)可以回收部分原料繼續(xù)水解，有利于節(jié)約 材料。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1是本發(fā)明的ACE在腎素-血管緊張素和舒緩激肽-激肽系統(tǒng)中的作用示意圖。
[0027] 圖2是本發(fā)明的混和酶-膜過(guò)濾連續(xù)操作的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] -種中華鱉降壓肽的制備方法，具體步驟如下：
[0031] (1)原料預(yù)處理：先將中華鱉宰殺后，除去脂肪，再用開(kāi)水燙15秒，去除中華鱉皮 膜，去除中華鱉的內(nèi)臟、骨、殼清洗干凈;將得到的中華鱉肉組織采用高速組織搗碎機(jī)進(jìn)行 攪碎處理，并加5倍的水勻漿后備用；
[0032] (2)混合酶解:加水調(diào)節(jié)（1)中底物溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，在50°C的水浴鍋中，調(diào) 節(jié)pH為8，加入底物總質(zhì)量1 %的混合酶，攪拌酶解2小時(shí)，得酶解液，其中混合酶各配方質(zhì)量 百分?jǐn)?shù):木瓜蛋白酶39 %、中性蛋白酶33 %、胰蛋白酶28 % ;
[0033] (3)滅酶:95°C下持續(xù)20分鐘進(jìn)行滅酶處理；
[0034] (4)離心過(guò)濾：將滅酶后的液體，4500r/min轉(zhuǎn)速離心30分鐘，得到的上清液，加水 調(diào)節(jié)使酶解液中的多肽濃度為2%，待膜過(guò)濾；
[0035] (5)膜過(guò)濾：上述調(diào)整多肽濃度后的酶解液在壓力0.2MPa、pH 7、溫度20°C條件下 微濾膜過(guò)濾，收集超濾液，加水調(diào)節(jié)超濾后的酶解液中多肽濃度為2 %，并在壓力0.5MPa、溫 度20°C的條件下納濾脫鹽，得到分子質(zhì)量在lOOODa以下的產(chǎn)物；
[0036] (6)凍干:將(5)最后得到的液體進(jìn)行冷凍干燥，即可得到降壓肽的產(chǎn)品。
[0037] 實(shí)施例2
[0038] -種中華鱉降壓肽的制備方法，具體步驟如下：
[0039] (1)原料預(yù)處理：先將中華鱉宰殺后，除去脂肪，再用開(kāi)水燙20秒，去除中華鱉皮 膜，去除中華鱉的內(nèi)臟、骨、殼清洗干凈;將得到的中華鱉肉組織采用高速組織搗碎機(jī)進(jìn)行 攪碎處理，并加10倍的水勻漿后備用；
[0040] (2)混合酶解:加水調(diào)節(jié)（1)中底物溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，在55°C的水浴鍋中，調(diào) 節(jié)pH為9，加入底物總質(zhì)量2 %的混合酶，攪拌酶解2小時(shí)，得酶解液，其中混合酶各配方質(zhì) 量百分?jǐn)?shù):木瓜蛋白酶42 %、中性蛋白酶30 %、胰蛋白酶28 % ;
[0041 ] (3)滅酶：100°C下持續(xù)15分鐘進(jìn)行滅酶處理；
[0042] (4)離心過(guò)濾:將滅酶后的液體，5000r/min轉(zhuǎn)速離心10分鐘，得到的上清液，加水 調(diào)節(jié)使酶解液中的多肽濃度為2.5%，待膜過(guò)濾；
[0043] (5)膜過(guò)濾:上述調(diào)整多肽濃度后的酶解液在壓力0? 25MPa、pH 7? 5、溫度25°C條件 下微濾膜過(guò)濾，收集超濾液，加水調(diào)節(jié)超濾后的酶解液中多肽濃度為2.5%，并在壓力 0.6MPa、溫度25°C的條件下納濾脫鹽，得到分子質(zhì)量在lOOODa以下的產(chǎn)物；
[0044] (6)凍干:將(5)最后得到的液體進(jìn)行冷凍干燥，即可得到降壓肽的產(chǎn)品。
[0045] 實(shí)施例3
[0046] -種中華鱉降壓肽的制備方法，具體步驟如下：
[0047] (1)原料預(yù)處理：先將中華鱉宰殺后，除去脂肪，再用開(kāi)水燙30秒，去除中華鱉皮 膜，去除中華鱉的內(nèi)臟、骨、殼清洗干凈;將得到的中華鱉肉組織采用高速組織搗碎機(jī)進(jìn)行 攪碎處理，并加3倍的水勻漿后備用；
[0048] (2)混合酶解:加水調(diào)節(jié)（1)中底物溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，在60°C的水浴鍋中，調(diào) 節(jié)pH為9.5，加入底物總質(zhì)量3 %的混合酶，攪拌酶解3小時(shí)，得酶解液，其中混合酶各配方質(zhì) 量百分?jǐn)?shù):木瓜蛋白酶44 %、中性蛋白酶32 %、胰蛋白酶24 % ;
[0049] (3)滅酶：100°C下持續(xù)15分鐘進(jìn)行滅酶處理；
[0050] (4)離心過(guò)濾：將滅酶后的液體，5000r/min轉(zhuǎn)速離心30分鐘，得到的上清液，加水 調(diào)節(jié)使酶解液中的多肽濃度為3%，待膜過(guò)濾；
[00511 (5)膜過(guò)濾:上述調(diào)整多肽濃度后的酶解液在壓力0? 25MPa、pH 7? 5、溫度30°C條件 下微濾膜過(guò)濾，收集超濾液，加水調(diào)節(jié)超濾后的酶解液中多肽濃度為3 %，并在壓力0.6MPa、 溫度30°C的條件下納濾脫鹽，得到分子質(zhì)量在lOOODa以下的產(chǎn)物；
[0052] (6)凍干:將(5)最后得到的液體進(jìn)行冷凍干燥，即可得到降壓肽的產(chǎn)品。
[0053] 實(shí)施例4
[0054] (1)原料預(yù)處理：先將中華鱉宰殺后，除去脂肪，再用開(kāi)水燙30秒，去除中華鱉皮 膜，去除中華鱉的內(nèi)臟、骨、殼清洗干凈;將得到的中華鱉肉組織采用高速組織搗碎機(jī)進(jìn)行 攪碎處理，并加6倍的水勻漿后備用；
[0055] (2)混合酶解:加水調(diào)節(jié)（1)中底物溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，在55°C的水浴鍋中，調(diào) 節(jié)pH為9，加入底物總質(zhì)量3 %的混合酶，攪拌酶解3小時(shí)，得酶解液，其中混合酶各配方質(zhì)量 百分?jǐn)?shù):木瓜蛋白酶44 %、中性蛋白酶28 %、胰蛋白酶28 % ;
[0056] (3)滅酶：100°C下持續(xù)20分鐘進(jìn)行滅酶處理；
[0057] (4)離心過(guò)濾：將滅酶后的液體，4500r/min轉(zhuǎn)速離心25分鐘，得到的上清液，加水 調(diào)節(jié)使酶解液中的多肽濃度為2%，待膜過(guò)濾；
[0058] (5)膜過(guò)濾:上述調(diào)整多肽濃度后的酶解液在壓力0? 25MPa、pH 7? 5、溫度28°C條件 下微濾膜過(guò)濾，收集超濾液，加水調(diào)節(jié)超濾后的酶解液中多肽濃度為2 %，并在壓力0.6MPa、 溫度25°C的條件下納濾脫鹽，得到分子質(zhì)量在lOOODa以下的產(chǎn)物；
[0059] (6)凍干:將(5)最后得到的液體進(jìn)行冷凍干燥，即可得到降壓肽的產(chǎn)品。
[0060] 下面通過(guò)相關(guān)的試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明混合酶解-膜過(guò)濾制備中華鱉降壓肽的方法的效 果。
[0061] 1.混合酶的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
[0062]為了進(jìn)一步說(shuō)明混合酶的效果，混合酶比采用scheffe多項(xiàng)式模型建立混料的配 比得回歸方程的方法:表1列出了采用混料設(shè)計(jì)進(jìn)行混合酶研究的試驗(yàn)方案、試驗(yàn)結(jié)果及其 預(yù)測(cè)值，如表1所示，對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行Scheffe多項(xiàng)式(不完全三次式)擬合分析，得回歸模型方 程：I = 0 ? 43Xi+0 ? 33X2+0 ? 31X3+0 ? 39XiX2+0 ? 35XiX2+0 ? 36X2X3+3 ? 02X1X2X3，其中Xi表示木瓜蛋 白酶的質(zhì)量百分比，X2表示中性蛋白酶的質(zhì)量百分比，X3表示胰蛋白酶的質(zhì)量百分比。經(jīng)分 析，得到最優(yōu)的配方為:Xi = 39%、X2 = 33%、X3 = 28%，即實(shí)施例1中的混合酶配方。
[0063] 表1混合酶的scheffe多項(xiàng)式模型分析表
[0065] 2 ?對(duì)照試驗(yàn)
[0066] 混合酶法連續(xù)制備的降壓肽與單一酶(試劑推薦條件:木瓜蛋白酶，60°C，pH 7.0; 中性蛋白酶45 °C，pH 7.0;胰蛋白酶pH 7.5，45 °C )方法制備的降壓肽對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 抑制作用的對(duì)照試驗(yàn):本發(fā)明混合酶法采用上述實(shí)施例1中的試驗(yàn)條件，單一酶法除pH和溫 度采用酶推薦條件外，其它條件與采用混合酶水解法相同。對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，很明 顯，混合酶比單一酶生產(chǎn)出的降壓肽抑制率提高4.43-20.86%。
[0067] 表2采用不同酶水解方法制備的降壓肽抑制率
[0069]以上就本發(fā)明較佳的實(shí)施例作了說(shuō)明，但不能理解為是對(duì)權(quán)利要求的限制。本發(fā) 明不僅局限于以上實(shí)施例，其具體方案允許有變化，凡在本發(fā)明獨(dú)立要求的保護(hù)范圍內(nèi)所 作的各種變化均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種混合酶解-膜過(guò)濾制備中華鱉降壓肽的方法，該方法包括以下步驟： (1) 原料預(yù)處理:將中華鱉肉絞成肉糜，并加肉糜質(zhì)量1-10倍的水勻漿，得到以中華鱉 肉糜作為底物的底物溶液備用； (2) 混合酶水解:將步驟（1)制得的底物溶液置于溫度50-60°C水浴中，調(diào)節(jié)底物溶液 PH8-9.5，加混合酶攪拌酶解2-3小時(shí)，得酶解液； (3) 滅酶:將步驟(2)中的酶解液在95-100 °C下持續(xù)15-20分鐘滅酶處理，得到滅酶后的 混合液體； (4) 離心過(guò)濾：將上述步驟(3)得到的液體，采用4500-5000r/min轉(zhuǎn)速離心10-30分鐘， 得上清液； (5) 膜過(guò)濾:調(diào)步驟(4)的上清液pH 7-7 · 5，并在壓力0 · 2-0 · 25MPa、溫度20-30 °C條件下 經(jīng)超濾膜或納濾膜超濾，收集分子量小于l〇〇〇Da的超濾液； (6) 凍干:將步驟(5)中的超濾液進(jìn)行冷凍干燥，即得到中華鱉降壓肽。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合酶解-膜過(guò)濾制備中華鱉降壓肽的方法，其特征在于:所 述步驟(2)中混合酶的各配方質(zhì)量百分?jǐn)?shù)如下：木瓜蛋白酶39-44%、中性蛋白酶28-33%、 胰蛋白酶24-28 %。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合酶解-膜過(guò)濾制備中華鱉降壓肽的方法，其特征在于:所 述步驟(2)中底物溶液加水調(diào)節(jié)使底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4-8 %，混合酶加入量為底物總質(zhì)量的 卜3%〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合酶解-膜過(guò)濾制備中華鱉降壓肽的方法，其特征在于:在 所述步驟(5)膜過(guò)濾之前，將步驟(4)得到的上清液中加水使其多肽濃度為2-3%。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合酶解-膜過(guò)濾制備中華鱉降壓肽的方法，其特征在于:所 述步驟(5)得到超濾液后還包括納濾脫鹽:將步驟(5)得到的超濾液加水調(diào)節(jié)使其多肽濃度 為2-3%，并在壓力0.5-0.6MPa、溫度20-30°C的條件下納濾脫鹽。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK105821108SQ201610298693
【公開(kāi)日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年5月6日
【發(fā)明人】楊華, 張慧恩, 戚向陽(yáng), 陳世達(dá)
【申請(qǐng)人】浙江萬(wàn)里學(xué)院