基于單增李斯特菌毒力基因的三重實時熒光定量pcr檢測用引物、mgb探針及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于單增李斯特菌毒力基因的三重實時熒光定量PCR檢測用引物、MGB探針及檢測方法。本發(fā)明針對單增李斯特菌<i>hlyA、</i><i>inlA</i>和<i>plcB</i>基因科學(xué)設(shè)計特異性引物，其DNA序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示；同時提供MGB探針，其DNA序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9所示?；谒鲆锖蚆GB探針，本發(fā)明整體優(yōu)化了實時熒光PCR檢測體系和的反應(yīng)程序條件，成功建立了高通量的單增李斯特菌的TaqMan ?MGB探針三重實時熒光定量PCR檢測方法，操作簡單、安全，最低檢測細(xì)菌濃度為100CFU/mL，整個擴增過程在50min以內(nèi)，具有更加高的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，可以很好地滿足食品安全中監(jiān)管中單增李斯特菌的快速檢測和鑒定，能快速、準(zhǔn)確測定樣本中單增李斯特菌的含量，同時可以分析單增李斯特菌菌株的三個毒力基因攜帶情況，可用于其流行病學(xué)溯源和毒力強弱分析。
【專利說明】
基于單増李斯特菌毒力基因的三重實時熒光定量PCR檢測用 引物、MGB探針及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種基于單增李斯特菌特異性毒力基 因hlyA、inlA和plcB的三重實時熒光定量PCR檢測用引物、TaqMan-MGB探針以及三重實時熒 光定量PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一種革蘭氏陽性胞內(nèi) 寄生菌，主要引起成人敗血癥和新生兒腦膜炎等疾病，發(fā)病后死亡率可達(dá)20-30 %。該菌對 環(huán)境抵抗力較強，在1~4°C可生長繁殖，_20°C可部分存活，并可抵抗反復(fù)冷凍，WHO已將其 列為4大食源性致病菌之一。單李增斯特菌被世界衛(wèi)生組織列為重點監(jiān)測的食源性病原菌 之一。中國目前雖然未曾爆發(fā)人感染單增李斯特菌病，但多位研究者從各地多種食品中均 分離出單增李斯特菌，其風(fēng)險性不容忽視。不同來源的單增李斯特菌攜帶的毒力差異較大， 準(zhǔn)確、快速地檢測單增李斯特菌及其毒力基因?qū)︻A(yù)防單增李斯特菌病有重要的意義，也可 為食源性單增李斯特菌的溯源和風(fēng)險評估提供重要技術(shù)支持。
[0003] 單增李斯特菌毒力基因主要集中在兩個毒力島LIPI-1和LIP-2，hlyA基因、plcB屬 于LIP-l，inlA屬于LIPIAlyA基因是單增李斯特菌最重要的毒力基因，編碼的李斯特菌溶 血素0(li Steri〇lysin，LL0)是單增李斯特菌最重要的一種毒力因子，為細(xì)菌入侵宿主細(xì)胞 及幫助細(xì)菌逃脫吞噬泡所必需。有研究顯示，缺失hlyA序列的單增李斯特菌無法入侵宿主 細(xì)胞，對宿主無毒性。InlA基因編碼內(nèi)化素，它與細(xì)菌的侵襲相關(guān)，位于菌體表面，與特異性 受體f丐黏蛋白（E-cadherin)結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)菌侵襲入細(xì)胞并內(nèi)化至吞小體，是建立感染的 前提。有研究結(jié)果顯示，InlA/InlB基因雙缺失后，單增李斯特菌菌株的毒力明顯減弱。于豐 宇等有關(guān)小鼠毒力實驗的LD50也顯不，內(nèi)化素基因（inlA、inlB、inlC、inlJ)的缺失可能是 導(dǎo)致菌株毒力降低的原因，目前有關(guān)報道表明致病性的LM都含有inlAdnlB^lcB編碼磷脂 酰膽堿磷脂酶(PC-PLC)，是細(xì)菌在宿主細(xì)胞間擴散并突破雙層膜時需要的關(guān)鍵因子之一， 還可幫助單增李斯特菌逃離吞噬小體。
[0004] 現(xiàn)有的傳統(tǒng)培養(yǎng)后生化鑒定的方法周期長，須兩次增菌培養(yǎng)后對可疑菌落進(jìn)行生 化鑒定，檢測周期長達(dá)6~7d，無法滿足大量樣本的快速、準(zhǔn)確檢測的需求;普通PCR方法一 般是檢測一個毒力因子，無法對單增李斯特菌的主要毒力基因進(jìn)行篩查式檢測，無法分析 不同來源的單增李斯特菌的毒力強弱，也無法與其血清型別分型、MLST分型等技術(shù)所得結(jié) 果相關(guān)聯(lián)進(jìn)行綜合分析，不利于不同來源的單增李斯特菌的分子溯源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有單增李斯特菌檢測技術(shù)的不足，提供一組基 于單增李斯特菌的三個特異性毒力基因:hlyA、inlA和plcB的三重實時熒光定性和/或定量 PCR檢測用的特異性引物。
[0006] 本發(fā)明另一要解決的技術(shù)問題是提供適用于單增李斯特菌的三個特異性毒力基 因三重實時熒光定性和/或定量PCR檢測用的MGB探針，具有分辨率高和特異性強的優(yōu)點。
[0007] 本發(fā)明還一要解決的技術(shù)問題是提供基于單增李斯特菌毒力基因的三重實時熒 光定性和/定量PCR檢測方法，是一種特異性強、靈敏度高和具良好穩(wěn)定性的高通量檢測方 法，并同時可以檢測單增李斯特菌攜帶hlyA、inlA和plcB三個特異毒力基因的情況，方便單 增李斯特菌菌株毒力的強弱及溯源分析。
[0008] 本發(fā)明提供的毒力基因三重實時熒光PCR檢測方法，適用于大量不同來源樣本的 單增李斯特菌毒力基因分布情況的快速檢測及流行病學(xué)調(diào)查，可與血清型別分型、MLST分 型等技術(shù)所得結(jié)果進(jìn)行綜合分析，便于不同來源的單增李斯特菌的分子溯源;三重實時熒 光PCR的毒力基因檢測結(jié)果可為分析單增李斯特菌菌株毒力強弱提供參考依據(jù)，對控制單 增李斯特菌引發(fā)的疾病的傳播和治療有積極意義。
[0009] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：
[0010]提供一組基于單增李斯特菌的三個特異性毒力基因：hlyA、inlA和plcB的三重實 時熒光定性和/或定量PCR檢測用的特異性引物，其序列分別如SEQ ID NO.USEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示。
[0017]本發(fā)明同時提供一種單增李斯特菌的TaqMan-MGB三重實時熒光PCR檢測用MGB探 針，序列如3￡〇10從).7、3￡〇10從).8和3￡〇10從).9所示：
[0024]基于所述特異性引物組和探針，本發(fā)明提供一種單增李斯特菌的TaqMan-MGB三重 實時熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0025] S1.吸取菌液，提取DNA，得反應(yīng)的DNA模板；
[0026] S2.采用本發(fā)明設(shè)計的引物和探針，進(jìn)行三重實時熒光PCR擴增，對單增李斯特菌 進(jìn)行定性和/或定量檢測；
[0027] 其中，步驟S2所述三重實時熒光PCR檢測的擴增體系中引物和探針配比優(yōu)選為：
[0028] hlyA:SEQ ID NO. 1:SEQ ID NO.2:SEQ ID N0.7 = 500nM:500nM:500nM；
[0029] inlA:SEQ ID NO.3:SEQ ID NO.4:SEQ ID N0.8 = 600nM:600nM:600nM；
[0030] plcB:SEQ ID NO.5:SEQ ID NO.6:SEQ ID N0.9 = 500nM:500nM:500nM；
[0031] 步驟S2所述三重實時熒光PCR檢測的反應(yīng)程序為：Stage 1:預(yù)變性95 °C 30s; Stage 2:951€58,581€348,40個循環(huán)，并于?41^1(：、陬0三個通道收集熒光信號 ；
[0032] 步驟S3所述定性檢測的方法為:待測基因出現(xiàn)擴增曲線，且Ct值〈36,則判斷為陽 性，如果36〈Ct〈40，判斷為可疑，可加大模板量重復(fù)實驗，如果有典型擴增曲線，判為陽性， 否則為陰性，無 Ct值或Ct等于40為陰性；
[0033] 步驟S3所述定量檢測的方法為:采用不同稀釋度的單增李斯特菌菌液lmL按步驟 S1提取基因組DNA，并按步驟S2進(jìn)行三重實時熒光定量PCR擴增，以Y軸為Ct值，X軸為log 10 (CFU)分別繪制hlyA、inlA和plcB標(biāo)準(zhǔn)曲線及得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式。根據(jù)三條標(biāo)準(zhǔn)曲線的公 式代入待測樣品擴增得到的Ct值，即可計算出對應(yīng)樣品中單增李斯特菌的含量。
[0034] 優(yōu)選地，步驟S1所述菌液的獲得方法是將菌株用腦心浸萃液增菌培養(yǎng)所得，培養(yǎng) 條件為:在培養(yǎng)溫度為36°C條件下培養(yǎng)24h。
[0035] 優(yōu)選地，步驟S1提取DNA具體方法為：取lmL菌液在12000r/min條件下離心處理去 上清，采用商品化細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA作為反應(yīng)的模板。
[0036] 優(yōu)選地，步驟S2所述三重實時熒光PCR檢測的反應(yīng)體系為30yL:Premix Ex Taq?(2 父）15此，1117厶、口1〇8引物、探針（20虛)分別為0.5此，、1111厶引物、探針（20處)分別為0.6此， R0X0.3yL，去離子水7.9yL，步驟S1所述DNA模板為2yL。
[0037]優(yōu)選地，步驟S3所述的稀釋度為6個：1 X 107CFU/mL、l X 106CFU/mL、l X 105CFU/mL、 1 X 104CFU/mL、1 X 103CFU/mL、1 X 102CFU/mL。
[0038]所述單增李斯特菌的TaqMan-MGB三重實時熒光定量PCR檢測方法可以很好地應(yīng)用 于單增李斯特菌的快速批量檢測中，或應(yīng)用于對單增李斯特菌株毒力基因hlyA、inlA和 PlcB的攜帶情況進(jìn)行檢測方面以及應(yīng)用于檢測分析單增李斯特菌毒力強弱方面。
[0039] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
[0040] 1.本發(fā)明首先通過對單增李斯特菌的攜帶毒力基因的針對性分析，科學(xué)選擇了三 個重要的毒力基因：hlyA、inlA和plcB，基于GenBank中hlyA、inlA和plcB基因序列(分別為 GenBank: KC770796 ? 1，GenBank: JF712529 ? 1，GenBank: EF445938 ? 1)，科學(xué)設(shè)計了一組共六 條特異性引物及三條探針序列，進(jìn)行比對分析后進(jìn)行篩選，最大程度減少引物和探針間二 級結(jié)構(gòu)的影響，PCR擴增時六條引物及三條探針之間互不干擾，擴增效率都符合定量檢測的 要求?；谒鎏禺愋砸?，成功建立一種快速、準(zhǔn)確、高通量的單增李斯特菌三重實時熒 光PCR檢測方法，填補現(xiàn)有技術(shù)的空白。
[0041] 2.本發(fā)明對探針的設(shè)計進(jìn)行了優(yōu)化，采用了3'端帶MGB修飾的探針(其3'端修飾了 基團-二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽(DPI3)，應(yīng)用更加短的探針序列(hlyA、inlA和plcB基因探針 長度分別為：18bp，19bp，15bp)達(dá)到多重實時熒光PCR所要求的Tm值，短的序列減少了引物、 探針之間二級結(jié)構(gòu)干擾的概率。獲得了具有更加高的靈敏度和特異性的探針。此外由于MGB 探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團，本身不發(fā)熒光，可以大大降低本底信號的值，提高了 多重?zé)晒釶CR檢測的靈敏度。
[0042] 3.在實時熒光PCR檢測實踐中，上下游引物間擴增的片段長度一般在200bp以內(nèi)， 太長會影響其擴增效率，進(jìn)而無法準(zhǔn)確實現(xiàn)定量檢測。定量要求的擴增效率一般在80 %~ 120%之間，本發(fā)明的hlyA、inlA和plcB目標(biāo)擴增片段設(shè)計為72&?、66&?、6%?，可很好的滿 足三重實時熒光PCR定量檢測的要求，擴增效率及標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均滿足要求，見圖1。
[0043] 4.除了特異性引物和優(yōu)越的探針設(shè)計以外，本發(fā)明對整體檢測方法和體系進(jìn)行了 優(yōu)化設(shè)計，本發(fā)明所建立的擴增體系引物和探針配比優(yōu)選為：
[0044] hlyA:SEQ ID N0.1:SEQ ID N0.2:SEQ ID N0.7 = 500nM:500nM:500nM
[0045] inlA:SEQ ID N0.3:SEQ ID N0.4:SEQ ID N0.8 = 600nM:600nM:600nM
[0046] plcB:SEQ ID N0.5:SEQ ID N0.6:SEQ ID N0.9 = 500nM:500nM:500nM
[0047] 退火延伸溫度是PCR擴增中關(guān)鍵的參數(shù)，本發(fā)明根據(jù)多重實時熒光PCR實際擴增情 況，擴增參數(shù)優(yōu)選在以下條件下進(jìn)行：Stage 1:預(yù)變性95°C30s; Stage 2:95°C5s，58°C34s， 40個循環(huán)，并于FAM、VIC、NED三個通道收集熒光信號；
[0048] 在此基礎(chǔ)上，如何確定擴增體系各組分的用量或體積，可根據(jù)經(jīng)驗并視實際擴增 的情況進(jìn)行調(diào)配。
[0049]本發(fā)明利用TaqMan MGB探針技術(shù)建立的單增李斯特菌三重實時熒光PCR快速檢測 方法，采用不同的熒光報告基團（FAM、VIC和NED)標(biāo)記，信號之間互不干擾，端修飾MGB) 探針，提高了探針結(jié)合的嚴(yán)謹(jǐn)度，最高可識別一個堿基的差異，增加了檢測的分辨率。同時， 發(fā)揮TaqMan-MGB探針的淬滅基團是一種非熒光的淬滅基團、本身不會產(chǎn)生熒光的優(yōu)勢，降 低了單增李斯特菌實時熒光PCR反應(yīng)的熒光本底信號的強度，進(jìn)一步提高整體方案的靈敏 度。
[0050] 本發(fā)明建立的TaqMan-MGB實時熒光定量PCR方法的特異性試驗表明僅對單增李斯 特菌的檢測結(jié)果為陽性;靈敏度試驗表明最低檢測細(xì)菌濃度為100CFU/mL。，本發(fā)明操作簡 便，通過熒光信號的積累實現(xiàn)對整個PCR過程進(jìn)行監(jiān)測，通過擴增曲線可直觀的進(jìn)行定性判 定，無須電泳等后續(xù)步驟;快速，擴增時間不超過50min;高通量，一次(管)可檢測三個毒力 基因，可顯著節(jié)約檢測成本;本發(fā)明可利用Ct值來對未知模板進(jìn)行定量的分析，可以很好地 滿足單增李斯特菌的快速檢測和鑒定及三個毒力基因的攜帶情況分析。
[0051] 本發(fā)明適用于大量樣本的單增李斯特菌毒力基因分布情況的快速檢測，提供分析 單增李斯特菌毒力強弱的參考依據(jù)，可結(jié)合血清學(xué)家系分型和MLST分子分型數(shù)據(jù)，為單增 李斯特菌的流行病學(xué)溯源提供極大方便，對控制單增李斯特菌引發(fā)的疾病的傳播和治療有 積極意義。
【附圖說明】
[0052]圖1是TaqMan-MGB三重實時熒光PCR檢測的特異性結(jié)果示意圖。
[0053] 圖2是TaqMan-MGB三重實時熒光PCR檢測的靈敏度結(jié)果示意圖。
[0054] 圖3是TaqMan-MGB三重實時熒光PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0055] 下面結(jié)合附圖和具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明方法。下述實施例和附圖僅用于示 例性說明，不能理解為對本發(fā)明的限制。除非特別說明，下述實施例中使用的生物材料、試 劑原料為常規(guī)市購或商業(yè)途徑獲得的生物材料和試劑原料，除非特別說明，下述實施例中 使用的方法和設(shè)備為本領(lǐng)域常規(guī)使用的方法和設(shè)備。
[0056]實施例1:建立單增李斯特菌三重實時熒光PCR檢測體系 [0057] 1.設(shè)計引物和探針：
[0058]通過對單增李斯特菌的攜帶毒力基因的針對性分析，選擇三個重要的毒力基因： 1115^、;[1114和口1013，然后根據(jù)66111^111<:上公布的單增李斯特菌1115^、;[1114和口1013基因序列，進(jìn) 行比對（用DNAStar)和分析，在序列的保守區(qū)域采用Primer Express 3.0設(shè)計得到具有以 下序列的引物：
[0065] 設(shè)計MGB探針，其序列為：
[0072]所述引物和探針也可以采用本領(lǐng)域常規(guī)方法合成。本實施例應(yīng)用的引物和探針均 委托英濰捷基公司合成。
[0073] 2.本實施例基于上述引物和探針，建立一種單增李斯特菌的三重實時熒光定量 PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0074] S1.吸取菌液，提取DNA，得反應(yīng)的DNA模板；
[0075] S2.采用本發(fā)明設(shè)計的引物和探針，進(jìn)行三重實時熒光PCR擴增，對單增李斯特菌 進(jìn)行定性和/或定量檢測；
[0076] 其中，步驟S2所述三重實時熒光PCR檢測的反應(yīng)體系為30yL:Premix Ex Taq?(2 X )15yL，hlyA、plcB引物探針（20福)分別為0.5yL，inlA引物探針（20福)分別為0.6yL， R0X0.3yL，去離子水8.2yL，步驟S1所述DNA模板為2yL;
[0077] 步驟S2所述三重實時熒光PCR檢測的反應(yīng)程序為：Stage 1:預(yù)變性95 °C 30s; Stage 2:951€58,581€348,40個循環(huán)，并于?41^1(：、陬0三個通道收集熒光信號 ；
[0078]步驟S3所述定性檢測的方法為:待測基因出現(xiàn)擴增曲線，且Ct值〈36,則判斷為陽 性，如果36〈Ct〈40，判斷為可疑，可加大模板量重復(fù)實驗，如果有典型擴增曲線，判為陽性， 否則為陰性，無Ct值或Ct等于40為陰性；
[0079] 步驟S3所述定量檢測的方法為：分別采用1 X 107CFU/mL、l X 106CFU/mL、l X 105CFU/mL、1 X 104CFU/mL、1 X 103CFU/mL、1 X 102CFU/mL6 個稀釋度的單增李斯特菌菌液lmL 按步驟S1提取基因組DNA，并按步驟S2進(jìn)行三重實時熒光定量PCR擴增，以Y軸為Ct值，X軸為 log 1Q(CFU)分別繪制hlyA、inlA和plcB標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)三條標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式代入待測樣品擴 增得到的Ct值，即可計算出樣品中單增李斯特菌的含量。
[0080]單增李斯特菌多重實時熒光定量PCR擴增的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法為:采用本發(fā)明建 立的TaqMan-MGB三重實時熒光PCR檢測方法，采用 1 X 107CFU/mL、l X 106CFU/mL、l X 105CFU/ mL、1 X 104CFU/mL、1 X 103CFU/mL、1 X 102CFU/mL6個濃度的單增李斯特菌lmL提取DNA進(jìn)行三 重實時熒光定量PCR實驗，分別繪制hlyA、inlA和plcB標(biāo)準(zhǔn)曲線，見附圖1所示。得到標(biāo)準(zhǔn)曲 線的方程分別為：hlyA: y = _3 ? 1798x+46.962、inlA:y = -3.1114x+47.312和 plcB:y = -3.06481+45.814;標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.99、0.99和0.98，擴增效率分別為106%、 112%和110%，表明檢測體系的三個基因擴增效率和線性相關(guān)系數(shù)良好，可以滿足三重實 時熒光定量PCR檢測的要求。
[0081] 單增李斯特菌的定量檢測和計算方法為：根據(jù)樣品熒光PCR得到的Ct值，根據(jù) 1115^、;[111八和卩1013標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:1115^:7 = -3.1798叉+46.962、;[111八:7 = -3.1114叉+47.312和 卩1013:7 = -3.06481+45.814;7為1115^、;[1113、口1013中任一種基因檢出的Ct值，代入相應(yīng)的方 程中，可以計算出單增李斯特菌菌液的濃度logio(CFU)值，從而可計算出lmL菌液中單增李 斯特菌的含量，實現(xiàn)單增李斯特菌的定量檢測。
[0082] 步驟S1所述菌液的獲得方法是將菌株用腦心浸萃液增菌培養(yǎng)所得，培養(yǎng)條件為： 在培養(yǎng)溫度為36 °C條件下培養(yǎng)24h，本實施例所述菌株購置于陸橋生物公司。
[0083] 步驟S1提取DNA具體方法為:取lmL菌液在12000r/min條件下離心處理去上清，采 用商品化細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（promega公司W(wǎng)izard Genomic DNAPurification K i t)提取DNA作為反應(yīng)的模板。
[0084]本發(fā)明實施例所述實時熒光PCR檢測使用的儀器為熒光定量PCR儀ABI7500。
[0085]實施例2:本發(fā)明方法的特異性、靈敏度試驗和重復(fù)性試驗 [0086] (1)檢測特異性分析
[0087]本發(fā)明采用大量菌株，分別用本發(fā)明建立的檢測方法進(jìn)行TaqMan-MGB三重實時熒 光PCR擴增，觀察實驗菌株有典型擴增曲線產(chǎn)生。表1中列舉了部分本實施例采用的菌株，表 1中所述的菌株均購置于陸橋生物公司。實驗發(fā)現(xiàn)，有且只有單增李斯特菌有指數(shù)擴增，其 他菌均無典型擴增曲線產(chǎn)生，表明本發(fā)明建立的針對單增李斯特菌毒力基因 hlyA、inlA、 plcB檢測的TaqMan-MGB三重實時熒光PCR方法特異性良好，實驗結(jié)果見附圖2所示。附圖2 中，1為單增李斯特菌;2~9分別為:英諾克李斯特菌、伊氏李斯特菌、表皮葡萄球菌、金黃色 葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、非01霍亂弧菌、副溶血性弧菌、弗氏檸檬酸桿菌。
[0088]表1實驗用部分菌株列表 1〇〇9〇]~(2)檢測靈敏度分析
[0091] 單增李斯特菌初始菌液濃度1 X 107CFU/mL經(jīng)10倍梯度稀釋成1 X 106CFU/mL、1 X 105CFU/mL、1 X 104CFU/mL、1 X 103CFU/mL、1 X 102CFU/mL和1 X lOkFU/mL菌液提取DNA進(jìn)行三 重實時熒光PCR檢測。實驗結(jié)果，本發(fā)明最低檢測細(xì)菌濃度為lOOCFU/mL，擴增結(jié)果見附圖3 所示。附圖3中，1~7分別為1~7分別為：1 X 107CFU/mL，l X 106CFU/mL，1 X 105CFU/mL，l X 104CFU/mL，1 X 103CFU/mL，1 X 102CFU/mL，1 X lOkFU/mL的單增李斯特菌。
[0092] (3)三重實時熒光定量PCR可重復(fù)性試驗
[0093]選取1 X 107CFU/mL，1 X 106CFU/mL，1 X 105CFU/mL，1 X 104CFU/mL，1 X 103CFU/mL 和 1 X 102CFU/mL的單增李斯特菌菌液提取模板進(jìn)行三重實時熒光PCR檢測，每個稀釋度做3個 平行，結(jié)果表明三種毒力基因的Ct值變異系數(shù)均在2%以下，說明本文建立的三重實時熒光 PCR檢測方法重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠。TaqMan-MGB三重實時熒光PCR重復(fù)性試驗結(jié)果見表2所 不。
[0094]表2三重實時熒光PCR檢測單增李斯特菌的可重復(fù)性測試
[0096]實施例3:不同來源的單增李斯特菌分離株的三重實時熒光PCR檢測及與MLST分型 聚類、血清學(xué)譜系分類信息
[0097] 1~72號共72株單增李斯特菌根據(jù)MLST分型并獲得相應(yīng)的STs，并聚類分成三個群 組，與血清型譜系lineageI、lineageI]^tUineageII]^g-致。序號1~42共42株單增李斯特 菌相對應(yīng)于血清型分類的lineageII，hlyA、inlA、plcB三個基因均為陽性;序號43~72共30 株單增李斯特菌屬于相對應(yīng)于血清型分類的lineagel，），其hlyA、plcB均為陽性，但inlA基 因陰性率較高(共20株，占67% )。說明三個主要的毒力基因的檢出情況可為單增李斯特菌 分離菌株的毒力強弱分析及流行病學(xué)溯源提供一定的分析依據(jù)。見表3所示。
[0098]表3 72株單增李斯特菌毒力基因三重實時熒光PCR毒力基因檢測結(jié)果及分布



[0103] *nl~n24為新發(fā)現(xiàn)的STs，尚待提交MLST(多位點序列分型，Multilocus sequence typing，MLST)網(wǎng)站后分配相應(yīng)的編號。
【主權(quán)項】
1. 一組基于單增李斯特菌的特異性毒力基因的三重實時熒光定性和/或定量PCR檢測 用的特異性引物，其特征在于，所述特異性毒力基因為hlyA、inlA和plcB，所述的引物的序 列分別如SEQ ID NO.USEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5和SEQ ID NO. 6所示。2. -種單增李斯特菌的TaqMan-MGB三重實時熒光PCR檢測用MGB探針，其特征在于，所 述探針的序列分別如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，探針5'端所述熒光報 告基團分別為FAM、VIC和NED，3 '端基團為MGB。3. -種單增李斯特菌的TaqMan-MGB三重實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，包括 以下步驟：51. 吸取菌液，提取DNA，得反應(yīng)的DNA模板；52. 采用權(quán)利要求1所述的引物和權(quán)利要求2所述的探針，進(jìn)行三重實時熒光PCR擴增， 對單增李斯特菌進(jìn)行定性和/或定量檢測； 其中，步驟S2所述三重實時熒光PCR檢測的擴增體系中引物和探針配比優(yōu)選為： hlyA:SEQ ID NO. 1:SEQ ID NO.2:SEQ ID N0.7 = 500nM:500nM:500nM； inlA:SEQ ID NO.3:SEQ ID NO.4:SEQ ID N0.8 = 600nM:600nM:600nM； plcB:SEQ ID N0.5:SEQ ID N0.6:SEQ ID N0.9 = 500nM:500nM:500nM； 步驟S2所述三重實時熒光PCR檢測的反應(yīng)程序為：Stage 1:預(yù)變性95°C30s; Stage 2: 95°〇58,581€348,40個循環(huán)，并于?41、￥1(：、陬0三個通道收集熒光信號； 步驟S3所述定性檢測的方法為:待測基因出現(xiàn)擴增曲線，且Ct值〈36,則判斷為陽性，如 果36〈Ct〈40，判斷為可疑，可加大模板量重復(fù)實驗，如果有典型擴增曲線，判為陽性，否則為 陰性，無 Ct值或Ct等于40為陰性； 步驟S3所述定量檢測的方法為:采用不同稀釋度的單增李斯特菌菌液lmL按步驟S1提 取基因組DNA，并按步驟S2進(jìn)行三重實時熒光定量PCR擴增，以Y軸為Ct值，X軸為l〇g1Q(CFU) 分別繪制hlyA、inlA和plcB標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)三條標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式代入待測樣品擴增得到的 Ct值，即可計算出樣品中單增李斯特菌的含量。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述單增李斯特菌的TaqMan-MGB三重實時熒光定量PCR檢測方法，其 特征在于，步驟S1所述菌液的獲得方法是將菌株用腦心浸萃液增菌培養(yǎng)所得。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述單增李斯特菌的TaqMan-MGB三重實時熒光定量PCR檢測方法，其 特征在于，所述培養(yǎng)的條件為:在培養(yǎng)溫度為36°C條件下培養(yǎng)24h。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述單增李斯特菌的TaqMan-MGB三重實時熒光定量PCR檢測方法，其 特征在于，步驟S2所述三重實時熒光PCR檢測的反應(yīng)體系為30yL:Premix Ex Taq?(2X )15μ L，hlyA、plcB引物探針（2〇μΜ)分別為0.5yL，inlA引物探針（ 2〇μΜ)分別為0.郎兒ROXO.^L， 去離子水7.9yL，步驟S1所述DNA模板為2yL。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述單增李斯特菌的TaqMan-MGB三重實時熒光定量PCR檢測方法，其 特征在于，步驟S1提取DNA具體方法為:取lmL菌液在12000r/min條件下離心處理去上清，采 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA作為反應(yīng)的模板。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述單增李斯特菌的TaqMan-MGB三重實時熒光定量PCR檢測方法，其 特征在于，步驟S3所述的稀釋度為6個：1 X 107CFU/mL、1 X 106CFU/mL、1 X 105CFU/mL、1 X 104CFU/mL、1 X 103CFU/mL、1 X 102CFU/mL〇9.權(quán)利要求3至8任一項所述單增李斯特菌的TaqMan-MGB三重實時熒光定量PCR檢測方 法的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于單增李斯特菌的快速批量檢測中或應(yīng)用于對單增李斯特菌 株毒力基因 hlyA、inlA和plcB的攜帶情況進(jìn)行檢測方面以及應(yīng)用于檢測分析單增李斯特菌 毒力強弱及單增李斯特菌分子溯源方面。
【文檔編號】C12N15/11GK105821123SQ201610206434
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月1日
【發(fā)明人】劉二龍, 袁慕云, 盧麗, 孫薇, 許龍巖, 呂英姿, 蔣湘
【申請人】劉二龍, 袁慕云, 盧麗, 孫薇, 許龍巖, 呂英姿, 蔣湘