骨肉瘤miRNA標(biāo)記物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種miRNA標(biāo)記物，該miRNA標(biāo)記物是miRNA550?a1。本發(fā)明利用NCBI GEO數(shù)據(jù)檢索出符合要求的2套骨肉瘤miNRA數(shù)據(jù)集和4套骨肉瘤mRNA數(shù)據(jù)集，對上述數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，篩選到一種與骨肉瘤密切相關(guān)的miRNA——miRNA550?a1。miRNA550?a1可用于判斷骨肉瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移或者預(yù)判骨肉瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險。經(jīng)檢驗證明，miRNA550?a1可有效區(qū)分骨肉瘤轉(zhuǎn)移樣本與非轉(zhuǎn)移樣本。在此基礎(chǔ)上，miRNA550?a1還可以用于制備抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移或者預(yù)防骨肉瘤轉(zhuǎn)移的藥物。本發(fā)明為骨肉瘤的分子機(jī)理研究提供了新的思路，同時為臨床在分子水平上診斷骨肉瘤轉(zhuǎn)移提供了新的診斷方法，并為骨肉瘤轉(zhuǎn)移治療提供新的藥物靶點。
【專利說明】
骨肉瘤miRNA標(biāo)記物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種骨肉瘤miRNA標(biāo)記物及其應(yīng)用，具體涉及一種 與骨肉瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA550-al標(biāo)記物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]骨肉瘤（Osteosarcoma，0S)是一種最普遍的非造血系統(tǒng)來源的原發(fā)性惡性骨腫 瘤，容易發(fā)生在骨迅速生長的階段，大部分患者年齡在12-25歲之間，第二個高發(fā)年齡在50 歲以上。0S的典型發(fā)生部位是骨的干骺端，最易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。一旦發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，骨肉瘤患者 的生存率僅為20%。因此，及早對骨肉瘤進(jìn)行診斷、對其轉(zhuǎn)移進(jìn)行預(yù)測和干預(yù)對于提高骨肉 瘤患者的預(yù)后具有非常重要的意義。
[0003] microRNA(miRNA)是廣泛存在于動植物和病毒中的一類非編碼RNA分子，長度約為 21-22nt，通過miRNA剪切和抑制蛋白翻譯的方式負(fù)調(diào)控靶基因。據(jù)估計，生物體內(nèi)約有1/3 的基因受miRNA的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。由于miRNA 結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定性，不易被內(nèi)源的RNA降解酶(RNase)降解，故可以作為疾病的診斷標(biāo)志物。
[0004] 檢測miRNA的表達(dá)水平可以為癌癥的臨床診斷提供參考依據(jù)。miRNA的異常表達(dá)直 接導(dǎo)致了與癌癥發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因的表達(dá)異常，進(jìn)而誘發(fā)癌癥的發(fā)生。在未來的臨床 治療中，miRNA不僅可以作為骨肉瘤早期診斷和癌癥進(jìn)程的相關(guān)標(biāo)記物，還可以作為骨肉瘤 治療的靶位點。尋找與鑒定與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA及其靶基因為miRNA應(yīng)用于臨床 治療提供基礎(chǔ)。
[0005] 隨著測序成本的降低，我們可以通過miRNA的序列信息來研究miRNA與mRNA之間的 關(guān)系。現(xiàn)在NCBI GE0數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)有大量的miRNA信息，本發(fā)明通過對已發(fā)表的骨肉瘤轉(zhuǎn)錄 組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出與骨肉瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的miRNA，用熒光定量PCR(qPCR)驗證其在臨床 樣本中的表達(dá)，并在骨肉瘤細(xì)胞系中研究其對骨肉瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)理，為骨肉瘤診斷和治療提 供依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種可用于判斷骨肉瘤轉(zhuǎn)移的miRNA標(biāo)記物。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種用于評估骨肉瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險、診斷骨肉瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、判斷骨 肉瘤轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的miRNA，所述miRNA標(biāo)記物是miRNA550-al。所述miRNA550-al選自以下 組中的至少一種:miRNA550-al 初始 miRNA、miRNA550-al 前體 miRNA、成熟 miRNA550-al;所述 miRNA550-al初始miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)成成熟miRNA550-al;所述miRNA550-al 前體miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)成成熟miRNA550-al。
[0009] 應(yīng)當(dāng)知道，本發(fā)明的miRNA550-al包括組成型核酸分子的功能等同物，即變體，其 顯示完整miRNA550-al核酸分子相同的功能，盡管它們通過核苷酸殘基的缺失、置換或者插 入而突變。
[0010] 本領(lǐng)域人員熟知，為了保證miRNA的穩(wěn)定性，可以在miRNA的一端或者兩端增加保 護(hù)性堿基，如TT，也可對miRNA堿基進(jìn)行修飾，但是不影響miRNA的功能。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知，在不影響miRNA550-al功能的條件下，對miRNA550-al進(jìn)行堿基修飾或者在兩端增 加堿基獲得的序列同樣包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0011] 在本發(fā)明的一些具體的實施方式中，所述miRNA550-al是成熟miRNA550-al。
[0012]雖然在某些【具體實施方式】中所使用的是成熟miRNA550-al，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以預(yù)期，初始miRNA(pi-miRNA550-al)、前體miRNA(pre-miRNA550-al)將可以獲得與成熟 miRNA550-al同樣的技術(shù)效果，因為細(xì)胞有進(jìn)一步將初始miRNA(pi-miRNA550-al)、前體 miRNA(pre-miRNA 55〇-al)加工為成熟 miRNA55〇-al 的能力。
[0013] 本發(fā)明的miRNA550-al核酸分子可以以單鏈或雙鏈的形式存在。成熟的miRNA550-al主要呈單鏈形式，而miRNA550-al前體是部分自互補的，以形成雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的核酸 分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
[0014]進(jìn)一步，上述預(yù)判骨肉瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險、判斷骨肉瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、判斷骨肉瘤轉(zhuǎn)移復(fù) 發(fā)的工具包括但不限于，芯片、試劑盒。所述工具包括用于待測樣本中miRNA550-al表達(dá)水 平的試劑。所述試劑可以是針對miRNA550-al的引物或探針。
[0015] 本發(fā)明還提供了上述miRNA550-al在高通量測序平臺中的應(yīng)用。通過高通量測序 能獲知待檢測樣本骨肉瘤組織中miRNA550-al的表達(dá)水平，將待測樣本的結(jié)果同骨肉瘤癌 旁組織相比，容易判斷待測樣本是否存在轉(zhuǎn)移的風(fēng)險或者容易判斷待測樣本是否已經(jīng)發(fā)生 了轉(zhuǎn)移、或者判斷骨肉瘤轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)。因此，經(jīng)過高通量測序獲得miRNA550-al表達(dá)水平 與骨肉瘤相關(guān)性的應(yīng)用同樣包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0016] 本發(fā)明提供了一種用于預(yù)判骨肉瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險、診斷骨肉瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、判斷骨 肉瘤轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的芯片，所述芯片包括固相載體；以及固定在所述固相載體上的寡核苷 酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應(yīng)于miRNA550-al的部分或全部序列。所述寡核 苷酸探針還可包括針對現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報道的可用于判斷骨肉瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移或者判斷 骨肉瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險或者判斷骨肉瘤轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的miRNA的寡核苷酸探針。將多種miRNA的檢 測探針放置在同一芯片上通過檢測多種miRNA指標(biāo)聯(lián)合判斷骨肉瘤轉(zhuǎn)移的情況也包含在本 發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0017] 進(jìn)一步，所述固相載體包括固相載體可采用的基因芯片領(lǐng)域的各種常用材料，例 如但不限于尼龍膜，經(jīng)活性基團(tuán)（如醛基、氨基等)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料 片等。
[0018]所述的miRNA芯片的制備可采用本領(lǐng)域已知的生物芯片的常規(guī)制造方法。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)判骨肉瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險、診斷骨肉瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、判斷 骨肉瘤轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測受試者骨肉瘤組織中miRNA550-a 1的表達(dá)水平的試劑。與骨肉瘤癌旁組織中的miRNA550-a 1的表達(dá)水平比較，若通過試劑盒 檢測骨肉瘤組織中miRNA550-al的表達(dá)水平顯著升高，則判斷該受試者的骨肉瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險 很高或者已發(fā)生轉(zhuǎn)移、或者再次發(fā)生轉(zhuǎn)移。
[0020] 進(jìn)一步，所述試劑包括針對miRNA550-al的引物和/或探針。所述試劑還包括針對 現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報道的可用于判斷骨肉瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移，或者判斷骨肉瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險，或者 判斷骨肉瘤轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的miRNA的引物和/或探針。將多種miRNA的檢測引物和/或探針放 置在同一試劑盒中通過檢測多種miRNA指標(biāo)聯(lián)合判斷骨肉瘤轉(zhuǎn)移的情況也包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0021]本發(fā)明的miRNA550-al可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表達(dá) miRNA550-al的DNA片段的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得。所述載體包括病毒載體、真核載體。
[0022] 病毒載體可以是任何適當(dāng)?shù)妮d體，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關(guān)病毒載體、皰疹病毒(例如單純皰疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)載體、甲病毒載體。
[0023] 真核表達(dá)載體可以是任何適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，包括但不限于pCMV-Myc表達(dá)載體、 pcDNA3.0表達(dá)載體、pcDNA3.1表達(dá)載體、pEGFP表達(dá)載體、pEF Bos表達(dá)載體、pTet表達(dá)載體、 pTRE表達(dá)載體、或者在公知表達(dá)載體的基礎(chǔ)上經(jīng)改造的載體，比如pBin438、pCAMBIA1301 等。
[0024] 可以表達(dá)miRNA550-al的DNA片段可以通過如下方式獲?。簭腘CBI數(shù)據(jù)庫中 (http: //www.ncbi .nlm.nih ? gov/nuccore)尋找miRNA550_al在基因組上的位置及具體序 列信息，根據(jù)基因組序列確定miRNA550-al初始miRNA的位置，在miRNA550-al初始miRNA位 置設(shè)計特異性引物，擴(kuò)增即可獲得表達(dá)miRNA550-al的DNA片段。
[0025]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0026]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 miRNA550_al表達(dá)水平與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，通過檢測受 試者miRNA550-al的表達(dá)水平，可以判斷受試者是否患有骨肉瘤或者判斷受試者是否存在 骨肉瘤轉(zhuǎn)移或者骨肉瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的風(fēng)險，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治 療方案。
【附圖說明】
[0027]圖1 qPCR檢測miRNA550_al在發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者的癌組織和癌旁組織的表達(dá) 情況；
[0028]圖2 qPCR檢測miRNA550_al在骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況；
[0029]圖3 anti-miRNA-550al對miRNA550-al侵襲的抑制作用；
[0030]圖4 anti-miRNA-550al對MG-63細(xì)胞侵襲的影響。
【具體實施方式】
[0031]下面通過【具體實施方式】來進(jìn)一步闡明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0032]實施例1篩選與骨肉瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的miRNA [0033] 1、骨肉瘤miRNA的數(shù)據(jù)檢索
[0034] 構(gòu)建檢索詞（"osteosarcoma"[MeSH Terms]OR"osteosarcoma"[All Fields] )AND (〃gse〃[Filter]AND〃Homo sapiens"[Organism])，按照預(yù)先設(shè)定的樣本篩選策略，在NCBI GE0(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫檢索，得到了2套骨肉瘤miNRA數(shù)據(jù)集和4套骨肉瘤 mRNA數(shù)據(jù)集。
[0035] 預(yù)先設(shè)定的樣本篩選策略:限制研究類型為"expression profiling by array"、 "non-coding RNA profiling by array"，符合以下標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)集將納入我們的研究中：① 所選數(shù)據(jù)集必須同時包括全基因組的mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和miRNA表達(dá)數(shù)據(jù);②這些數(shù)據(jù)來自 于骨肉瘤病例組和對照組的活檢組織或培養(yǎng)的細(xì)胞;③本研究均考慮經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化或者原始數(shù) 據(jù)集。
[0036] 2、骨肉瘤mRNA及miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)整合分析
[0037] 2.1篩選差異表達(dá)的miRNA和mRNA
[0038] 通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析軟件對2套骨肉瘤miNRA原始數(shù)據(jù)和4套骨肉瘤mRNA原始數(shù)據(jù) 進(jìn)行背景校正和標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行t-test得到P值，計算效應(yīng)量，然后利用Fi sher檢驗合并P值， 采用隨機(jī)效應(yīng)模型合并效應(yīng)量，篩選差異表達(dá)miRNA及mRNA，尋找交集，共篩選出15個差異 表達(dá)的miRNA，其中表達(dá)水平上調(diào)的基因5個，表達(dá)水平下調(diào)的基因10個。
[0039] 2.2骨肉瘤差異表達(dá)的miRNA靶基因的識別
[0040] miRTarBase 數(shù)據(jù)庫（http: //mirtarbase .mbc .nctu ? edu ? tw)下載人類 miRNA 革巴基 因信息，同時篩選在癌癥樣本中具有差異表達(dá)的miRNA基因，共得到453個miRNA-靶基因關(guān) 系對。
[0041] 2.3骨肉瘤差異表達(dá)miRNA及差異表達(dá)靶基因組成的生物信息網(wǎng)絡(luò)圖
[0042]利用Cytoscape軟件構(gòu)建由骨肉瘤差異表達(dá)miRNA及差異表達(dá)靶基因組成的生物 信息網(wǎng)絡(luò)圖。
[0043] 2.4骨肉瘤差異表達(dá)的靶基因的功能注釋
[0044] 通過DAVID對差異表達(dá)的基因進(jìn)行G0功能富集和KEGG通路富集。KEGG通路富集的 結(jié)果顯示136個差異表達(dá)的靶基因能夠在KEGG庫中篩出，集中在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞 通訊、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等信號通路。
[0045] 2.5骨肉瘤差異表達(dá)miRNA的篩選
[0046]基于骨肉瘤疾病mRNA、miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)整合分析結(jié)果，我們得到了差異表達(dá)的 miRNA--miRNA550-al〇
[0047] 實施例2 qPCR驗證差異表達(dá)的miRNA550_al
[0048] 1、針對NCBI GEO數(shù)據(jù)庫檢索得到的miRNA數(shù)據(jù)集的整合分析結(jié)果，選擇miRNA550-al進(jìn)行qPCR驗證。
[0049]驗證選擇發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織和未發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織各5例進(jìn)行驗證。上 述樣本組織均來自骨肉瘤患者的手術(shù)切除標(biāo)本。取得的所有標(biāo)本均得到組織倫理委員會的 同意。組織樣本的臨床資料包括:性別、年齡、腫瘤轉(zhuǎn)移情況、病理分級、復(fù)發(fā)與否及其他生 化檢測指標(biāo)等。
[0050] 2、骨肉瘤癌組織及癌旁組織RNA提取過程
[0051 ]向組織中加入液氮，充分研磨成粉末，加入Trizol，靜置5min;加入約1/5體積的氯 仿，上下顛倒充分混勾，室溫下靜置5-10min;4°C、12000rpm高速離心15min后小心吸取上清 液移入新的1.5ml離心管，加入等體積的-20°C異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上lOmin;4°C、 12000rpm高速離心15min后，棄上清，向沉淀中加入2/5體積的70%乙醇（4°C保存），4°C、 12000rpm離心沉淀5min;棄上清，將沉淀室溫晾干后加入適量DEPC處理過的水充分溶解； Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度。RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn):RNA樣本的0D260/ 0D280比值在1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶;70°C水浴保溫1小時后的 電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。
[0052] 3、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[OO53] 使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lyg總RNA進(jìn)行逆反錄合成cDNA。采用25yl 反應(yīng)體系，每個樣品取lyg總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入以下組分:DEPC水、5 X逆 轉(zhuǎn)錄緩沖液、10mm〇l/L dNTP，0.1mmol/L DTT，30wiimol/L Oligo dT，200U/yl MMLVRT，模板 尺嫩。42°(：孵育lh，72°C10min，短暫離心。
[0054] 4、qPCR 反應(yīng)
[0055] 使用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0設(shè)計mRNA焚光定量上下游PCR引物，合成 引物序列，使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒操作，具體步驟按說明書進(jìn)行操作，采 用25yl反應(yīng)體系，每個樣本設(shè)置3個平行管，所有擴(kuò)增反應(yīng)重復(fù)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果 的可靠性。配制以下反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 12.5yl，正向引物(5yMAU)lyl，反向引物 (5yM/yl)lyl，模板cDNA 2.0yl，無酶水8.5yl。各項操作均于冰上進(jìn)行。以SYBR Green I作 為焚光標(biāo)記物，在Light Cycler焚光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳 確定目的條帶，△△ CT法進(jìn)行相對定量。
[0056] 5、結(jié)果
[0057]如圖1所示，與未發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織相比，已發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中 miRNA550-al的表達(dá)水平顯著升高，與實施例1中miRNA數(shù)據(jù)集整合分析結(jié)果一致。
[0058] 實施例3 miRNA550-al在骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá) [0059] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0060]將骨肉瘤細(xì)胞系MG-63、U2-0S于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將人正常成骨細(xì)胞系 hFOBl. 19于F12與DMEM混合培養(yǎng)基（1:1)和10 %胎牛血清中培養(yǎng)，置于37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱 中。
[0061] 2、qPCR
[0062] 2.1細(xì)胞總RNA提取
[0063] 利用QINGEN公司的RNA提取試劑盒進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取，按照說明書指示進(jìn)行。 [0064] 2.2 qPCR
[0065] 步驟同實施例2。
[0066] 3、結(jié)果
[0067] 如圖2所示，與人正常成骨細(xì)胞系hF0B1.19相比，骨肉瘤細(xì)胞系MG-63、U2-0S中 miRNA550-al的表達(dá)明顯升高(P〈0.05)。
[0068] 實施例 4anti-miRNA-550al 對 miRNA550-al 表達(dá)的抑制作用
[0069] 1、設(shè)計合成針對miRNA550-al的反義寡核苷酸(anti-miRNA550-al)
[0070] 在NCBI數(shù)據(jù)庫（http: //www.ncbi ? nlm.nih ? gov/nuccore)中找到miRNA550_al 的 序列信息，根據(jù)miRNA550-al的序列信息由TaKaRa設(shè)計合成anti-miRNA550-al和隨機(jī)對照 序列。
[0071] 2、細(xì)胞培養(yǎng)
[0072] MG-63培養(yǎng)方法同實施例3。
[0073] 3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0074] 將MG-63細(xì)胞分為兩組，分別為抑制陰性對照組(ant i-NC)、miRNA550-a 1抑制組 (anti-miRNA550-al)。將陰性對照組及抑制組分別轉(zhuǎn)染anti-NC和anti-miRNA550-al，運用 轉(zhuǎn)染試劑Lipof ectamine TM 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法參照說明書。anti-NC和anti-miRNA550-al的工作濃度均為5yM。轉(zhuǎn)染后48h收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實驗。
[0075] 4、qPCR 實驗
[0076] 細(xì)胞總RNA提取和PCR步驟同實施例3。
[0077] 結(jié)果表明與抑制陰性對照組（anti-NC)相比，miRNA550_al抑制組（anti-miRNA550-al)的miRNA550-al的水平顯著下降，表明anti-miRNA550-al能夠有效抑制 miRNA550-al 的表達(dá)。
[0078]實施例5研究miRNA550_al對骨肉瘤癌細(xì)胞侵襲能力的影響
[0079] 1、細(xì)胞培養(yǎng)同實施例4
[0080] 2、侵襲實驗
[00811 轉(zhuǎn)染48h的MG-63細(xì)胞使用胰酶消化并計數(shù)，取105個細(xì)胞置于1.5mL EP管中，加入 200yl無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入經(jīng)過鋪基質(zhì)膠的transwell小室中，下層小室加入10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，放人37 °C、5 % C02孵箱培養(yǎng)24h。取transwe 11小室，用棉簽擦除里面的細(xì) 胞，并用PBS輕輕洗掉里面剩余細(xì)胞。固定染色后顯微鏡下隨機(jī)取5個視野進(jìn)行計數(shù)。
[0082] 3、結(jié)果
[0083] 與抑制陰性對照組（anti-NC)相比，miRNA-2116抑制組（anti-miRNA550-al)穿過 已經(jīng)鋪過基質(zhì)膠的transwell小室基底膜的細(xì)胞減少了45%。表明anti-miRNA550_al能夠 顯著抑制MG-63細(xì)胞的侵襲能力，即表明miRNA550-al有利于MG-63細(xì)胞的迀移和侵襲。 [0084] 上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. miRNA550-al在制備預(yù)判骨肉瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險、診斷骨肉瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、判斷骨肉瘤轉(zhuǎn) 移是否復(fù)發(fā)的工具中的應(yīng)用，其特征在于，所述miRNA550-al選自以下組中的至少一種： miRNA550-al 初始 miRNA、miRNA550-al 前體 miRNA、成熟 miRNA550-al;所述 miRNA550-al 初始miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)成成熟miRNA550_al;所述miRNA550_al前體miRNA能 在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)為成熟miRNA550-al。2. 根據(jù)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miRNA550-al是成熟miRNA550-al。3. 權(quán)利要求1所述的miRNA550-al在高通量測序平臺中的應(yīng)用，其特征在于，通過高通 量測序獲知待測樣本骨肉瘤組織中所述miRNA550-al的表達(dá)水平，分析獲知所述miRNA550-al與骨肉瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。4. 一種預(yù)判骨肉瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險、診斷骨肉瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、判斷骨肉瘤轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的 芯片，其特征在于，所述芯片包括固相載體；以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針， 所述寡核苷酸探針包括特異性地對應(yīng)于權(quán)利要求1所述的miRNA550-al的部分或全部序列。5. -種預(yù)判骨肉瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險、診斷骨肉瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、判斷骨肉瘤轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的 試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括用于檢測受試者骨肉瘤組織中權(quán)利要求1所述的 miRNA550-al的表達(dá)水平的試劑;與未發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中所述miRNA550-al的表達(dá)水 平比較，若骨肉瘤組織中所述miRNA550-al的表達(dá)水平顯著升高，則判斷該受試者的骨肉瘤 發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險高、或者已發(fā)生轉(zhuǎn)移、或者轉(zhuǎn)移已復(fù)發(fā)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑包括針對所述miRNA550-al的 引物和/或探針。7. 權(quán)利要求1所述的miRNA550-al在制備抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移、侵襲或者預(yù)防骨肉瘤轉(zhuǎn)移、 侵襲的藥物中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物包含所述miRNA550-al抑制劑。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miRNA550-al抑制劑能夠抑制 miRNA550-al的表達(dá)或者能夠抑制miRNA550-al的功能。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miRNA5 50-al抑制劑是所述 miRNA550-al的反義寡核苷酸或所述miRNA550-al模擬物。
【文檔編號】C12Q1/68GK105821131SQ201610272993
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】章燦, 何洪波, 隆峰, 萬軍, 劉育鵬, 李宇晟
【申請人】中南大學(xué)湘雅醫(yī)院