在體外檢測(cè)或/及定量乙型肝炎病毒的方法及其所使用的引物、探針的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)及/或定量乙型肝炎病毒的引物、引物對(duì)及探針，該引物其序列編碼為SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3或SEQ ID No:4，上述引物可組成引物對(duì)，探針編碼序列為SEQ ID No:5或SEQ ID No:6。本發(fā)明還提供了一種在體外檢測(cè)或/及定量乙型肝炎病毒的方法。本發(fā)明提供的一種在體外檢測(cè)或/及定量乙型肝炎病毒的方法及其所使用的引物、探針，其與乙型肝炎病毒具有高結(jié)合力，能夠準(zhǔn)確地判別樣本中是否含有乙型肝炎病毒。本發(fā)明所述引物及/或探針能快速且準(zhǔn)確地在體外檢測(cè)樣本中是否含有乙型肝炎病毒，并且通過分析檢測(cè)結(jié)果獲知該樣本中乙型肝炎病毒的含量。
【專利說明】
在體外檢測(cè)或/及定量乙型肝炎病毒的方法及其所使用的 引物、探針
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明有關(guān)于一種在體外檢測(cè)病毒的方法，特別指一種在體外檢測(cè)或/及定量乙 型肝炎病毒的方法及其所使用的引物、探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 雖然乙型肝炎疫苗在臺(tái)灣以及許多國(guó)家已經(jīng)全面施打，乙型肝炎（chronic hepatitis B)仍為全世界最常見的感染性疾病之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界仍有三億五千萬人為 乙型肝炎慢性感染者，而其中超過75%在亞太地區(qū)，在臺(tái)灣估計(jì)有接近四百萬人感染慢性 乙型肝炎。感染乙型肝炎的患者，除了會(huì)導(dǎo)致急性肝炎、慢性肝炎等疾病外，同時(shí)較正常人 有較高機(jī)會(huì)罹患肝硬化（liver cirrhosis)或者肝癌（hepatocellular carcinoma)，而全 世界每年約有一億人死于乙型肝炎相關(guān)疾病。以臺(tái)灣來說，肝癌死亡率高居癌癥相關(guān)死亡 率的第二位，2011年有8, 022人死于肝癌；而慢性肝病及肝硬化則為十大死因中的第八名， 2011年有5, 153人死于肝臟相關(guān)疾?。粨Q言之，因肝癌與肝臟疾病死亡的總數(shù)，占了臺(tái)灣所 有死亡原因的接近一成左右。
[0003] 乙型肝炎病毒屬于Hepadnaviridae病毒屬，為去氧核醣核酸病毒（DNA virus)， 具有3, 200個(gè)核苷酸，而乙型肝炎病毒至少有十種基因型（A-J型），各該基因型的序列間差 異大于8%。亞太地區(qū)最常見的乙型肝炎病毒基因型為基因型B及基因型C病毒，臺(tái)灣又 以基因型B特別常見。基因型B的乙型肝炎病毒可再進(jìn)一步細(xì)分為B1-B6六個(gè)亞型，其中， B2-B5等亞型在臺(tái)灣較為常見。乙型肝炎病毒基因型有關(guān)于受其感染后轉(zhuǎn)為慢性肝炎的機(jī) 會(huì)及罹患肝癌的機(jī)會(huì)有關(guān)，如被基因型A及基因型D的乙型肝炎病毒感染的患者具有較高 的機(jī)會(huì)轉(zhuǎn)為慢性肝炎；而被基因型C或基因型D的慢性乙型肝炎患者有較高的機(jī)會(huì)罹患肝 硬化或者肝癌。依據(jù)臺(tái)灣最近研究顯示，相對(duì)于基因型B的慢性乙型肝炎攜帶者，帶有基因 型C的慢性肝炎攜帶者有2. 35倍罹患肝癌的機(jī)會(huì)。
[0004] 除上所述乙型肝炎基因型可作為預(yù)測(cè)患者罹患肝癌或肝硬化的工具外，乙型肝炎 患者血液中的病毒DNA濃度可以作為預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎患者將來罹患肝癌及肝硬化機(jī)會(huì) 的工具。具體來說，先前研究證實(shí)，不論乙型肝炎患者是否為HbeAg陽性、是否有肝硬化、肝 功能高低，乙型肝炎患者血中的DNA病毒量可用以單獨(dú)預(yù)測(cè)該患者將來罹患肝癌的機(jī)會(huì)。 另有研究證實(shí)，罹患肝癌且接受手術(shù)治療的患者，其血液中乙型肝炎DNA濃度與肝癌術(shù)后 復(fù)發(fā)機(jī)會(huì)相關(guān)。此外，部份慢性乙型肝炎患者血中的HbsAg雖然已經(jīng)被清除，但是仍會(huì)被測(cè) 出血中含有乙型肝炎病毒DNA，因此，在將來使用化學(xué)治療藥劑（chemotherapy agents)或 者免疫抑制劑（immunosuppressive agents)進(jìn)行治療時(shí)，乙型肝炎在這些患者中出現(xiàn)再活 化的機(jī)會(huì)也較大，則仍應(yīng)該定期追蹤其血中乙型肝炎病毒DNA濃度，用以預(yù)測(cè)乙型肝炎病 毒是否再活化。
[0005] 由上可知，被乙型肝炎病毒感染的患者除應(yīng)檢測(cè)其乙型肝炎病毒基因型，并且 應(yīng)定期追蹤體內(nèi)乙型肝炎病毒的有無及其濃度，才能對(duì)于肝臟相關(guān)疾病達(dá)到預(yù)防及治 療的效果。目前臨床上雖然建議慢性乙型肝炎患者每3-6個(gè)月要進(jìn)行抽血及超聲波檢 查，以追蹤是否有乙型肝炎的急性發(fā)作或者肝硬化、肝癌的發(fā)生。但是，目前抽血檢查 的常規(guī)追蹤項(xiàng)目中未將慢性乙型肝炎基因型及乙型肝炎病毒DNA在血中濃度列入，其 主要原因在于，目前臨床上所使用的檢測(cè)方法具有檢測(cè)費(fèi)用高昂、檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng)的缺失， 例如即時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)需要至少兩個(gè)以上引物及探針始能克服乙型 肝炎序列異質(zhì)性，否則其準(zhǔn)確性不高，并且要至少花費(fèi)新臺(tái)幣1600元的檢測(cè)費(fèi)用。而 以全自動(dòng)檢測(cè)儀器（COBAS K Ampliprep real-time PCR system，RocheMolecular Systems, Branchburg, NJ)分析血液中病毒DNA定量費(fèi)用約須新臺(tái)幣2000元，并且檢測(cè)時(shí)間 須約2-4周才能完成。
[0006] 由此可知，目前現(xiàn)有的檢測(cè)方法無法普遍地被應(yīng)用于檢測(cè)追蹤慢性乙型肝炎感染 患者，達(dá)到預(yù)防或追蹤相關(guān)肝臟疾病發(fā)生的功效。因此，開發(fā)出一種新穎的檢測(cè)或/及定量 乙型肝炎病毒的方法為目前醫(yī)學(xué)研究的重要課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種檢測(cè)乙型肝炎病毒的探針，其序列編碼為SEQ ID No. 5或SEQ ID No. 6,其與乙型肝炎病毒具有高結(jié)合力，而能夠準(zhǔn)確地判別樣本中是否含有 乙型肝炎病毒。一般來說，該探針得以人工合成方式或以設(shè)計(jì)好的專一性引物經(jīng)聚合酶鏈 式反應(yīng)制備而成。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種在體外定量及/或檢測(cè)乙型肝炎病毒的方法，其 能夠快速準(zhǔn)確地獲得檢測(cè)結(jié)果，并通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比對(duì)，得知待測(cè)樣本中乙型肝炎病毒 的含量，且能夠降低檢測(cè)成本。
[0009] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)乙型肝炎病毒的引物，其對(duì)于乙型肝炎病 毒具有高度專一性，藉此得到放大待測(cè)樣本中乙型肝炎病毒的片段，而能夠判斷待測(cè)樣本 中是否含有乙型肝炎病毒以及其含量。
[0010] 為能達(dá)成上述目的，在本發(fā)明實(shí)施例中所揭一種用于檢測(cè)及/或定量乙型肝炎病 毒的引物或引物對(duì)，其中，該引物的序列編碼為SEQ ID N〇:l、SEQ ID N〇:2、SEQ ID N〇:3或 SEQ ID No:4,而該引物對(duì)由上述引物所組成，例如：該引物對(duì)具有編碼SEQ ID No:l的正向 引物及編碼為SEQ ID No:2的反向引物，或是編碼SEQ ID No:3的正向引物及編碼為SEQ ID No:4的反向引物。
[0011] 通過上述引物或引物對(duì)，本發(fā)明另一實(shí)施例揭露一種檢測(cè)及/或定量乙型肝炎病 毒的方法，其將一待測(cè)樣本的核酸分子與該引物或該引物對(duì)進(jìn)行聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)，分析該 反應(yīng)結(jié)果，判斷該待測(cè)樣本中是否含有乙型肝炎病毒及其含量。
[0012] 較佳地，該步驟b中更包含提供一定量分子，舉例來說，該定量分子為一熒光物質(zhì) 或是一具電活性的DNA嵌合劑。
[0013] 而依據(jù)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域且具通常知識(shí)者的一般知識(shí)，分析聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)的 方式眾多，例如以膠體電泳進(jìn)行DNA片段的分析、以光學(xué)儀器分析焚光分子的信號(hào)強(qiáng)度、以 電化學(xué)偵測(cè)分析DNA嵌合劑的信號(hào)等。
[0014] 本發(fā)明的實(shí)施例提供一種用于檢測(cè)或/及定量乙型肝炎的探針，其序列編碼為 SEQ ID No:5 或 SEQ ID No:6。
[0015] 本發(fā)明的又一實(shí)施例揭露在體外檢測(cè)乙型肝炎病毒的方法，其包含下列步驟：
[0016] 步驟a :取一待測(cè)樣本的核酸分子；
[0017] 步驟b :提供上述探針；
[0018] 步驟c :將該待測(cè)樣本的核酸分子與該探針進(jìn)行雜合反應(yīng)；
[0019] 步驟d :分別測(cè)量該探針與該待測(cè)樣本進(jìn)行雜合反應(yīng)前后的結(jié)合能力，據(jù)以分析 該待測(cè)樣本中是否含有乙型肝炎病毒，其中，當(dāng)該探針與該待測(cè)樣本進(jìn)行雜合反應(yīng)后的結(jié) 合能力大于其進(jìn)行雜合反應(yīng)前的結(jié)合能力時(shí)，表示該待測(cè)樣本含有乙型肝炎病毒。
[0020] 較佳地，該待測(cè)樣本為血液、血清、血漿或體液。
[0021] 較佳地，該在體外檢測(cè)乙型肝炎病毒的方法更包含一步驟e，設(shè)在該步驟d之后， 提供一含有不同濃度乙型肝炎病毒的標(biāo)準(zhǔn)樣本，分別與該探針進(jìn)行雜合反應(yīng)，并測(cè)量各該 標(biāo)準(zhǔn)樣本與該探針的結(jié)合能力，將乙型肝炎病毒濃度與其相對(duì)應(yīng)的結(jié)合能力制備成為一標(biāo) 準(zhǔn)曲線，而將該待測(cè)樣本的結(jié)合能力與該標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，得到該待測(cè)樣本中乙型肝炎病 毒DNA的濃度。
[0022] 較佳地，步驟d中結(jié)合能力的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)為熒光強(qiáng)度、顏色變化、電阻變化或光學(xué)信 號(hào)，其中又以電阻變化的操作最為簡(jiǎn)便。
[0023] 本發(fā)明的有益效果為：
[0024] 本發(fā)明提供一種在體外檢測(cè)或/及定量乙型肝炎病毒的方法及其所使用的引物、 探針，其與乙型肝炎病毒具有高結(jié)合力，能夠準(zhǔn)確地判別樣本中是否含有乙型肝炎病毒。據(jù) 此，本發(fā)明所述引物及/或探針能快速且準(zhǔn)確地在體外檢測(cè)樣本中是否含有乙型肝炎病 毒，并且通過分析檢測(cè)結(jié)果得以獲知該樣本中乙型肝炎病毒的含量。
【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明所述第一引物對(duì)、第二引物對(duì)及JX-1-1引物對(duì)于不同檢體進(jìn)行聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的分析結(jié)果。
[0026] 圖2為檢測(cè)第一檢測(cè)試片與檢體反應(yīng)前后電阻值的結(jié)果。
[0027] 圖3為檢測(cè)第二檢測(cè)試片與檢體反應(yīng)前后電阻值的結(jié)果。
[0028] 圖4為檢測(cè)第三檢測(cè)試片與檢體反應(yīng)前后電阻值的結(jié)果。
[0029] 圖5為檢測(cè)第一檢測(cè)試片與含有乙型肝炎病毒濃度為lng/ y L的檢體反應(yīng)前后電 阻值的結(jié)果。
[0030] 圖6為檢測(cè)第一檢測(cè)試片與含有乙型肝炎病毒濃度為100pg/ y L的檢體反應(yīng)前后 電阻值的結(jié)果。
[0031] 圖7為檢測(cè)第一檢測(cè)試片與含有乙型肝炎病毒濃度為lOpg/yL的檢體反應(yīng)前后 電阻值的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 除非另有定義，在本發(fā)明的說明書及申請(qǐng)專利范圍所使用的技術(shù)及科學(xué)名詞的意 義，其與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域且具通常知識(shí)者的一般理解相同。若有矛盾的情形，以本發(fā)明 內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0033] 本發(fā)明所揭用于檢測(cè)及/或定量乙型肝炎病毒引物能結(jié)合乙型肝炎病毒DNA的片 段，其序列編碼為 SEQ ID No:l、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3 或 SEQ ID No:4。
[0034] 本發(fā)明所揭用于檢測(cè)及/或定量乙型肝炎病毒引物對(duì)能結(jié)合并放大乙型肝炎病 毒的DNA片段，其中，該引物對(duì)的正向引物的序列編碼為SEQ ID No: 1或SEQ ID No: 3,并 且，其反向引物的序列編碼為SEQ ID No:2或SEQ ID No:4。
[0035] 本發(fā)明所揭用于檢測(cè)或/及定量乙型肝炎的探針，其序列編碼為SEQ ID N〇:5及 SEQ ID No:6,具有與乙型肝炎病毒的DNA片段結(jié)合的功能。
[0036] 本發(fā)明所揭引物及引物對(duì)，通過比對(duì)不同型乙型肝炎病毒的全基因組序列設(shè)計(jì)而 得。
[0037] 本發(fā)明所揭探針，以序列編碼為SEQ ID No: 1及SEQ ID No:2所組成的引物對(duì)或 序列編碼為SEQ ID No:3及SEQ ID N〇:4所組成的引物對(duì)，通過聚合酶連鎖反應(yīng)自乙型肝 炎病毒DNA擴(kuò)增出序列編碼SEQ ID No:5或SEQ ID No:6的DNA片段。
[0038] 而本發(fā)明所揭引物、引物對(duì)或探針也得以人工合成方式所獲得。所謂"人工合成 方式" 一詞指通過人工方式將氨基酸依序連接而成為一多肽，包含化學(xué)合成法以及多肽合 成儀。一般來說，化學(xué)合成法可分為固相多肽合成法及液相多肽合成法，其中，液相多肽合 成法必須在完成每一氨基酸的連接后，進(jìn)行萃取操作；固相多肽合成法先將所欲多肽的N 端氨基酸共價(jià)鍵結(jié)至聚合物顆粒上，其后再通過專一性鍵結(jié)的方式將后續(xù)氨基酸依序連接 上，最后合成該多肽。相較于液相多肽合成法，固相多肽合成法不需要純化中間產(chǎn)物，具有 較佳產(chǎn)率，且可大幅縮短反應(yīng)時(shí)間，在長(zhǎng)鏈多肽的合成上也較具優(yōu)勢(shì)，因此，為目前較為廣 為人所使用的多肽合成方法。
[0039] 如同本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域且具通常知識(shí)者所周知，由于本發(fā)明所設(shè)計(jì)的專一性引 物或引物對(duì)能與乙型肝炎病毒的核酸分子互補(bǔ)結(jié)合，因此，通過分析聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的結(jié) 果，可檢測(cè)出待測(cè)樣本中是否含有乙型肝炎病毒及其含量。
[0040] 以下，為能更進(jìn)一步說明本發(fā)明的多功效，將分別舉實(shí)施例作詳細(xì)說明，這些實(shí)施 例為用以解說的示例，其中所使用的任何詞匯并不限制本發(fā)明說明書及權(quán)利要求書的范圍 及意義。
[0041 ] 實(shí)施例一：設(shè)計(jì)引物對(duì)
[0042] 根據(jù)國(guó)家生物資料中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI)的資料庫(kù)，得知各類型乙型肝炎病毒全基因組序列。經(jīng)由比對(duì)分析后，設(shè)計(jì)出一第一 引物對(duì)，包含編碼為SEQ ID No. 1及SEQ ID No. 2的序列，以及一第二引物對(duì)，包含編碼為 SEQ ID No. 3 及 SEQ ID No. 4 的序列。
[0043] 實(shí)施例二：制備探針
[0044] 分別以實(shí)施例一中所設(shè)計(jì)的該第一引物對(duì)及該第二引物對(duì)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)， 35循環(huán)，自乙型肝炎病毒核酸分子中獲特異性的DNA片段，并且，將各該片段以核酸定序 套組Terminator v3.lCycle Sequencing Kit)及自動(dòng)化核酸遺傳分析系統(tǒng) (automated ABI PRISM⑩.3100，Biosystems，CA, USA)進(jìn)行驗(yàn)證，得知各該片段的序列分 別為SEQ ID No. 5及SEQ ID No. 6,而將分別作為第一探針及第二探針，供后續(xù)實(shí)施例使用。
[0045] 實(shí)施例三：純化乙型肝炎病毒
[0046] 取乙型肝炎血液樣本，以離心機(jī)進(jìn)行離心處理，收集各血液樣本的白細(xì)胞層 (buffy coat) 1毫升，加入4毫升紅細(xì)胞裂解液（RBC Lysis Buffer)，均勾混合，置于室溫 下10分鐘，再以轉(zhuǎn)速3000rmp進(jìn)行離心5分鐘，去除其上清液后，加入1毫升的紅細(xì)胞裂解 液，并且將沉淀物（pellet)打散，再次進(jìn)行離心2分鐘。去除上清液后，再將白細(xì)胞顆粒重 新懸浮于3毫升的紅細(xì)胞裂解液中。在37°C下置放30分鐘，加入6 y L的RNA酶A(10mg/ mL) (Amresco, OH, USA)，并在37°C下以150rmp的轉(zhuǎn)速進(jìn)行震蕩30分鐘。加入約1毫升的蛋 白質(zhì)沉淀溶液（protein precipitation solution，RBC Bioscience)，進(jìn)行震蕩，再在室溫 下以3000rmp進(jìn)行離心5分鐘，獲得一上清液。將約3毫升的異丙酮加入該上清液中，均勻 混合，使DNA析出。以3000rmp進(jìn)行離心5分鐘后，完全去除上清液，取出DNA，再將1毫升、 濃度70%的乙醇與該DNA均勻混合，以3000rmp進(jìn)行離心5分鐘，去除其上清液，待乙醇揮 發(fā)，加入DNA水合液進(jìn)行回溶，完成乙型肝炎血液樣本的純化。
[0047] 以全自動(dòng)檢測(cè)儀器（C_OBAS_' Ampliprep real-time PCR system， RocheMolecular Systems, Branchburg, NJ)測(cè)量該血液樣本中乙型肝炎病毒DNA的濃度。
[0048] 實(shí)施例四：檢測(cè)不同濃度的乙型肝炎病毒
[0049] 取編號(hào)1-4的檢體，并且，經(jīng)臺(tái)北病理中心的檢測(cè)數(shù)據(jù)可知，編號(hào)1至4的 檢體中含有的乙型肝炎病毒濃度依序?yàn)?. 53X105copies/mL、2. 71X104copies/mL、 1. 21X107copies/mL、2. 61X106copies/mL。將各該檢體分別以該第一引物對(duì)、該第二引物對(duì) 及JX-1-1引物對(duì)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，結(jié)果如圖1所示。其中，JX-1-1引物對(duì)為文獻(xiàn)中已 經(jīng)發(fā)表使用于檢測(cè)乙型肝炎的引物對(duì)，具有序列編碼為SEQ ID No. 7的正向引物及序列編 碼為SEQ ID No. 8的反向引物。而此所進(jìn)行的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域且具 通常知識(shí)者所周知，故實(shí)驗(yàn)流程在此不加以贅述。
[0050] 由圖1的檢測(cè)結(jié)果顯示，本發(fā)明所揭第一引物對(duì)及該第二引物對(duì)分別能夠有效地 區(qū)分出不同濃度乙型肝炎病毒的含量。
[0051] 實(shí)施例五：制備檢測(cè)試片
[0052] 在本實(shí)施例中取該第一探針、該第二探針及Hxl-1探針分別制備成為第一檢測(cè)試 片、第二檢測(cè)試片及第三檢測(cè)試片，其中，Hxl-1探針為先前文獻(xiàn)中所公開用以偵測(cè)乙型肝 炎病毒的探針，其序列編碼為SEQ ID No. 9。
[0053] 制備檢測(cè)試片的流程如下：將各該探針分別以磷酸鹽緩沖液稀釋100倍，置放于 試管震蕩器震蕩均勻，再取40 yL滴于檢測(cè)晶片表面，在常溫下靜置1小時(shí)，使各該探針鍵 結(jié)于各該檢測(cè)晶片上。再將以磷酸鹽緩沖液清洗各該晶片，用以去除未接附于晶片上的探 針，干燥各該晶片后，完成制備各該檢測(cè)試片。
[0054] 實(shí)施例六：測(cè)試乙型肝炎病毒與探針的結(jié)合能力
[0055] 取一具有乙型肝炎病毒的檢體，加入磷酸鹽緩沖液稀釋100倍，放置于95°C燒杯 隔水加熱10分鐘，并迅速放置于4°C冷藏90秒，降溫至50°C后在試管震蕩均勻。取該第一 檢測(cè)試片、該第二檢測(cè)試片及該第三檢測(cè)試片，先分別測(cè)其電阻值，再將該檢體溶液40 y L 分別加入該第一檢測(cè)試片、該第二檢測(cè)試片及該第三檢測(cè)試片的表面，在50°C下靜置30分 鐘，再以磷酸鹽緩沖液清洗后，進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果如圖2至圖4所示。
[0056] 當(dāng)所測(cè)得知電阻值越大，表示與檢體中乙型肝炎病毒結(jié)合的探針數(shù)量較多，顯示 探針的結(jié)合能力較強(qiáng)，相反地，當(dāng)所測(cè)得知電阻值較小時(shí)，表示與檢體中乙型肝炎病毒結(jié)合 的探針數(shù)量較少，探針的結(jié)合能力較差。并且，結(jié)合能力強(qiáng)的探針能偵測(cè)到較多病毒含量， 據(jù)以增加其檢測(cè)的準(zhǔn)確度，減少誤判診斷的情形發(fā)生。
[0057] 依據(jù)上述說明，由圖2至圖4的結(jié)果可知，該第一檢測(cè)試片及該第二檢測(cè)試片確實(shí) 能夠用以檢測(cè)乙型肝炎病毒，并且，該第一檢測(cè)試片及該第二檢測(cè)試片被測(cè)得的電阻值明 顯高于第三檢測(cè)試片。由此結(jié)果可知，本發(fā)明所揭第一探針及第二探針分別較Hxl-1探針 具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，因而能檢測(cè)到較多的病毒含量，使包含該第一探針或該第二探針的 試片能具有良好的檢測(cè)準(zhǔn)確率。
[0058] 實(shí)施例七：檢測(cè)探針的靈敏度
[0059] 取編號(hào)3的乙型肝炎檢體，將其gDNA濃度制備為lng/yL、100pg/yL及10pg/ y L，分別以該第一檢測(cè)試片進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5至圖7所示。由此結(jié)果可知，即使在乙型 肝炎檢體中的病毒濃度為l〇pg/ y L時(shí)，該第一檢測(cè)試片仍可以達(dá)到檢測(cè)的目的。
[0060] 更進(jìn)一步地以羅氏COBAS AmpliPrep全自動(dòng)核酸萃取系統(tǒng)分析該第一檢測(cè)試片能 檢測(cè)的病毒量，發(fā)現(xiàn)該第一檢測(cè)試片能檢測(cè)到的病毒數(shù)量至少為2. 85X107copies/mL。將之 比對(duì)編號(hào)3的乙型肝炎檢體在病理中心實(shí)際測(cè)得的病毒數(shù)量（1. 21X107C〇pieS/mL)，能更明 確地顯示本發(fā)明所揭探針在樣本中乙型肝炎病毒濃度為100pg/ y L時(shí)，仍具有檢測(cè)效果。
[0061] 由上述結(jié)果可知，本發(fā)明所揭探針具有高靈敏度，因此，即使在樣本含有少量的乙 型肝炎病毒時(shí)，本發(fā)明所揭探針仍具有良好的檢出率，并且能夠與較多的乙型肝炎病毒結(jié) 合。
[0062] 以上僅是通過各該實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，熟知該技術(shù)領(lǐng)域者在不脫離本發(fā)明精 神下，而對(duì)于說明書中的實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改或是變化，均應(yīng)為本發(fā)明權(quán)利要求所 涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)及/或定量乙型肝炎病毒的引物，其特征在于，用以結(jié)合樣本中乙型 肝炎病毒的DNA，該引物選自由下列引物所組成的群：SEQ ID N〇:l所示序列、SEQ ID N〇:2 所示序列、SEQ ID No :3所示序列及SEQ ID No :4所示序列。2. -種用于檢測(cè)及/或定量乙型肝炎病毒的引物對(duì)，其特征在于，用以結(jié)合樣本中乙 型肝炎病毒的DNA，該引物對(duì)的正向引物選自由下列正向引物所組成的群：SEQ ID No: 1所 示正向引物及SEQ ID N〇:3所示正向引物；以及其反向引物選自由下列反向引物所組成的 群：SEQ ID No:2所示反向引物及SEQ ID No:4所示反向引物。3. -種檢測(cè)及/或定量乙型肝炎病毒的方法，其特征在于，包含下列步驟： (a) 取一待測(cè)樣本的核酸分子； (b) 提供如權(quán)利要求1所述引物或如權(quán)利要求2所述引物對(duì)，與該待測(cè)樣本中的乙型肝 炎病毒DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)； (c) 分析該擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果，據(jù)以得知該待測(cè)樣本中是否具有乙型肝炎病毒及其含量。4. 如權(quán)利要求3所述檢測(cè)及/或定量乙型肝炎病毒的方法，其特征在于，所述步驟b中 更包含提供一定量分子，而選自由熒光物質(zhì)及具電活性的物質(zhì)所組成的群。5. -種用于檢測(cè)或/及定量乙型肝炎的探針，其特征在于，序列選自由下列序列所組 成的群：SEQ ID No:5 及 SEQ ID No:6。6. -種在體外檢測(cè)乙型肝炎病毒的方法，其特征在于，包含有下列步驟： (a) 取一待測(cè)樣本的核酸分子； (b) 提供如權(quán)利要求5所述探針； (c) 將該待測(cè)樣本的核酸分子與該探針進(jìn)行雜合反應(yīng)； (d) 分別測(cè)量該探針與該待測(cè)樣本進(jìn)行雜合反應(yīng)前后的結(jié)合能力，據(jù)以分析該待測(cè)樣 本中是否含有乙型肝炎病毒，其中，當(dāng)該探針與該待測(cè)樣本進(jìn)行雜合反應(yīng)后的結(jié)合能力大 于其進(jìn)行雜合反應(yīng)前的結(jié)合能力時(shí)，表示該待測(cè)樣本含有乙型肝炎病毒。7. 如權(quán)利要求6所述在體外檢測(cè)乙型肝炎的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣本選自由 血液、血清、血漿及體液所組成的群。8. 如權(quán)利要求6所述在體外檢測(cè)乙型肝炎的方法，其特征在于，更包含一步驟e，設(shè)在 所述步驟d之后，提供一含有不同濃度乙型肝炎病毒的標(biāo)準(zhǔn)樣本，分別與該探針進(jìn)行雜合 反應(yīng)，并測(cè)量各該標(biāo)準(zhǔn)樣本與該探針的結(jié)合能力，將乙型肝炎病毒濃度與其相對(duì)應(yīng)的結(jié)合 能力制備成為一標(biāo)準(zhǔn)曲線，而將該待測(cè)樣本的結(jié)合能力與該標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，得到該待測(cè) 樣本中乙型肝炎病毒DNA的濃度。9. 如權(quán)利要求6所述在體外檢測(cè)乙型肝炎的方法，其特征在于，步驟d中結(jié)合能力的測(cè) 量標(biāo)準(zhǔn)由選自由熒光強(qiáng)度、顏色變化、電阻變化及光學(xué)信號(hào)所組成的群。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK105821156SQ201510003745
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2015年1月6日
【發(fā)明人】吳俊穎, 林肇堂, 賴紫綸
【申請(qǐng)人】臺(tái)中榮民總醫(yī)院, 輔仁大學(xué)學(xué)校財(cái)團(tuán)法人輔仁大學(xué)