用于制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法，其包括(1)第一步，將多能干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體，(2)第二步，將步驟(1)中形成的團(tuán)聚體在各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而獲得含有視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的團(tuán)聚體，和(3)第三步，將步驟(2)中形成的團(tuán)聚體在各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而獲得含有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的團(tuán)聚體。
【專利說明】
用于制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法等。
【背景技術(shù)】
[0002]已知關(guān)于使用多能干細(xì)胞制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的報道(非專利文獻(xiàn)I)。顯示通過以下方式獲得視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法:在含有抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中形成多能干細(xì)胞的均勻團(tuán)聚體，將它們在基底膜制劑存在下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，然后在含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并且在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)并且不含作用于Sonic hedgehog信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)(非專利文獻(xiàn)2和專利文獻(xiàn)I)。
[0003][文獻(xiàn)列表]
[0004]專利文獻(xiàn)
[0005]專利文獻(xiàn)1:W0 2013/077425
[0006]非專利文獻(xiàn)
[0007]非專利文獻(xiàn)l:CellStem Cell ,5,396-408(2009)
[0008]非專利文獻(xiàn)2:CellStem Cell ,10(6) ,771-785(2012)
[0009]發(fā)明概述
[0010]發(fā)明解決的問題
[0011]希望開發(fā)出用于由多能干細(xì)胞制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法。
[0012]解決問題的方法
[0013]本發(fā)明提供由多能干細(xì)胞制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片的方法等。
[0014]S卩，本發(fā)明提供:
[0015][ I ]用于制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法，其包括
[0016](I)第一步，將多能干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體，
[0017](2)第二步，將步驟(I)中形成的團(tuán)聚體在各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而獲得含有視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的團(tuán)聚體，和
[0018](3)第三步，將步驟(2)中獲得的團(tuán)聚體在各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而獲得含有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的團(tuán)聚體(在下文中有時稱為本發(fā)明的制備方法I);
[0019][2]用于制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片(sheet)的方法，其包括
[0020](I)第一步，將多能干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體，
[0021](2)第二步，將步驟(I)中形成的團(tuán)聚體在各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而獲得含有視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的團(tuán)聚體，
[0022](3)第三步，將步驟(2)中獲得的團(tuán)聚體在各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而獲得含有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的團(tuán)聚體，和
[0023](4)第四步，將步驟(3)中獲得的團(tuán)聚體分散并且將得到的細(xì)胞進(jìn)行粘附培養(yǎng)(在下文中有時稱為本發(fā)明的制備方法2)；
[0024][3]前述[2]所述的制備方法，其中在所述步驟(4)中，所述粘附培養(yǎng)在血清代替物(serum replacement)存在下進(jìn)行；
[0025][4]前述[2]或[3]所述的制備方法，其中在所述步驟(4)中，所述粘附培養(yǎng)在ROCK抑制物質(zhì)存在下進(jìn)行；
[0026][5]前述[2]至[4]中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中在所述步驟(4)中，所述粘附培養(yǎng)在還包含一種或多種選自由以下各項(xiàng)組成的組的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行:作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)、抑制FGF信號途徑的物質(zhì)、作用于激活素(Activin)信號途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)；
[0027][6]前述[2]至[5]中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中在所述步驟(4)中，所述粘附培養(yǎng)在具有用培養(yǎng)基質(zhì)(cuIture substrate)處理的表面的培養(yǎng)容器材料上進(jìn)行；
[0028][7]前述[6]所述的制備方法，其中所述培養(yǎng)基質(zhì)是合成的培養(yǎng)基質(zhì)；
[0029][8]前述[6]所述的制備方法，其中所述培養(yǎng)基質(zhì)是層粘連蛋白；
[0030][9]前述[I]至[8]中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中所述多能干細(xì)胞是靈長類動物多能干細(xì)胞；
[0031][10]前述[I]至[9]中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中所述多能干細(xì)胞是人多能干細(xì)胞；
[0032][11]前述[I]至[10]中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟(I)和步驟(2)在血清代替物存在下進(jìn)行；
[0033][12]前述[I]至[11]中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述懸浮培養(yǎng)在不存在基底膜制劑的情況下進(jìn)行；
[0034][13]前述[I]至[12]中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)是一種或多種選自由以下各項(xiàng)組成的組的蛋白質(zhì):BMP2、BMP4、BMP7和⑶F7;
[0035][14]前述[I]至[13]中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(2)中的所述各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基還包含抑制FGF信號途徑的物質(zhì)；
[0036][15]用于評價毒性或藥效的試劑，其包含通過前述[I]至[14]中任一項(xiàng)所述的方法制備的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片；
[0037][16]評價測試物質(zhì)的毒性或藥效的方法，其包括將通過前述[I]至[14]中任一項(xiàng)所述的方法制備的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片與測試物質(zhì)接觸，并且檢查所述物質(zhì)對所述細(xì)胞或細(xì)胞片的影響；
[0038][17]用于由視網(wǎng)膜組織病癥所致的疾病的治療劑，其包含通過前述[I]至[14]中任一項(xiàng)所述的方法制備的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片；
[0039][18]治療由視網(wǎng)膜組織病癥所致的疾病的方法，其包括將有效量的通過前述[I]至[14]中任一項(xiàng)所述的方法制備的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片移植到需要移植的受試者；以及
[0040][19]通過前述[I]至[14]中任一項(xiàng)所述的方法制備的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片，其用于治療由視網(wǎng)膜組織病癥所致的疾病;等。
[0041 ]發(fā)明效果
[0042]根據(jù)本發(fā)明的制備方法，可以非常高效地制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片。在本發(fā)明的制備方法中，因?yàn)橐暰W(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片可以通過在不向培養(yǎng)基中加入基底膜制劑的情況下(即，在不存在基底膜制劑的情況下)懸浮培養(yǎng)團(tuán)聚體來獲得，獲得的細(xì)胞或細(xì)胞片被源自異源物種的成分污染的風(fēng)險降低。根據(jù)本發(fā)明的制備方法，可以有效地提供視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片以用于化學(xué)物質(zhì)等的毒性或效力評價、移植治療等。
[0043]附圖簡述
[0044]圖1顯示源自人胚胎干細(xì)胞的、在懸浮培養(yǎng)的第3天補(bǔ)充以BMP4的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的團(tuán)聚體在懸浮培養(yǎng)的第18天的明場圖像(A)，和源自人胚胎干細(xì)胞的、在懸浮培養(yǎng)的第3天補(bǔ)充以BMP4的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的并且自懸浮培養(yǎng)的第18天起在不含BMP4而含有CHIR99021的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的團(tuán)聚體在懸浮培養(yǎng)的第20天的明場圖像(B)。
[0045]圖2顯示自懸浮培養(yǎng)開始第3天-第18天在含有BMP4的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的來源于人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體的(A)自懸浮培養(yǎng)的第18天至第21天在不含BMP4而含有CHIR99021的培養(yǎng)基中并且之后在不含BMP4和CHIR99021的培養(yǎng)基中的懸浮培養(yǎng)的第27天的明場圖像，(B)自懸浮培養(yǎng)的第18天至第27天在不含BMP4而含有CHIR99021的培養(yǎng)基中的懸浮培養(yǎng)的第27天的明場圖像，和(C)自懸浮培養(yǎng)的第18天至第21天在不含BMP4而含有CHIR99021的培養(yǎng)基中，自懸浮培養(yǎng)的第21天至第27天在不含BMP4而含有CHIR99021和SU-5402的培養(yǎng)基中的懸浮培養(yǎng)的第27天的明場圖像。
[0046]圖3顯示在含有CHIR99021的培養(yǎng)基中的粘附培養(yǎng)的細(xì)胞的都在自懸浮培養(yǎng)開始的第27天的(A)明場圖像，(B)視網(wǎng)膜色素上皮標(biāo)志物Mitf的熒光免疫染色圖像，和(C)緊密連接標(biāo)志物ZO-1的熒光免疫染色圖像，其中所述細(xì)胞通過自懸浮培養(yǎng)的第3天至第18天在含有BMP4的培養(yǎng)基中，自懸浮培養(yǎng)的第18天至第21天在不含BMP4而含有CHIR99021的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)來源于人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體，并且在培養(yǎng)的第21天使所述團(tuán)聚體瓦解來獲得。
[0047]圖4顯示在含有Y27632的培養(yǎng)基中的粘附培養(yǎng)的細(xì)胞的都在自懸浮培養(yǎng)開始的第40天的(A)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片的圖像和(B)放大的光場圖像，其中所述細(xì)胞通過從懸浮培養(yǎng)的第3天至第18天在含有BMP4的培養(yǎng)基中，從懸浮培養(yǎng)的第18天至第21天在不含BMP4而含有CHIR99021的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)來源于人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體，在懸浮培養(yǎng)的第21天分散，并且將得到的細(xì)胞接種在表面用Synthemax?處理的Boyden小室(Boyden chamber)中來獲得。
[0048]圖5顯示在自懸浮培養(yǎng)開始的第40天的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片的放大的光場圖像。將來源于人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體從懸浮培養(yǎng)的第3天至第18天在含有BMP4的培養(yǎng)基中，從懸浮培養(yǎng)的第18天至第21天在不含BMP4而含有CHIR99021的培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第21天分散，將得到的細(xì)胞接種在表面用Synthemax?處理的Boyden小室中并對其進(jìn)行粘附培養(yǎng)。繼續(xù)粘附培養(yǎng)直到自懸浮培養(yǎng)開始的第40天，在自開始懸浮培養(yǎng)的第24天或自開始粘附培養(yǎng)的第3天(A)不加入成分，或加入(Β)3μΜ CHIR99021，(C)1yM SU-5402，(D)3μΜ CHIR99021 和ΙΟμΜ SU-5402，(E) InM人ΒΜΡ4蛋白，或(F)50ng/ml人激活素。
[0049]圖6顯示接種在表面用(A)Matrige I?或(B) Synthemax?處理的Boyden小室中的粘附培養(yǎng)的細(xì)胞在自開始懸浮培養(yǎng)的第26天的視網(wǎng)膜色素上皮片的圖像，其中所述細(xì)胞通過自懸浮培養(yǎng)的第3天至第18天在含有BMP4的培養(yǎng)基中，自懸浮培養(yǎng)的第18天至第21天在不含BMP4而含有CHIR99021的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)來源于人胚胎干細(xì)胞的團(tuán)聚體，并且在懸浮培養(yǎng)的第21天分散來獲得。
[0050]實(shí)施方案描述
[0051]以下詳細(xì)說明實(shí)施本發(fā)明的方式。
[0052]本發(fā)明中的“懸浮培養(yǎng)”表示在阻止細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊粘附到細(xì)胞培養(yǎng)容器材料等的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0053]用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)容器不受特別限制只要其能夠進(jìn)行“懸浮培養(yǎng)”即可，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)卮_定細(xì)胞培養(yǎng)容器。此種培養(yǎng)容器的實(shí)例包括燒瓶，組織培養(yǎng)燒瓶，盤，培養(yǎng)皿，組織培養(yǎng)盤，多皿(multidish)，微板，微孔板，微孔(micropore)，多板(multiplate)，多孔板，室載玻片(chamber slide)，碗(schale)，試管，淺盤，培養(yǎng)袋，和轉(zhuǎn)瓶。由于這些培養(yǎng)容器用于懸浮培養(yǎng)，其優(yōu)選是不粘附細(xì)胞的。作為不粘附細(xì)胞的容器，可以使用的是表面未進(jìn)行人工處理以提高細(xì)胞粘附性(例如，利用胞外基質(zhì)的涂覆處理等)的容器等。
[0054]通常用于本發(fā)明的培養(yǎng)基可以制備自作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的用于培養(yǎng)動物細(xì)胞的培養(yǎng)基。基礎(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)例包括可以用于培養(yǎng)動物細(xì)胞的那些培養(yǎng)基，如BME培養(yǎng)基，BG Jb培養(yǎng)基，CMRL1066培養(yǎng)基，Glasgow MEM培養(yǎng)基，Improved MEM Zinc Opt1n培養(yǎng)基，頂DM培養(yǎng)基，Medium 199培養(yǎng)基，Eagle MEM培養(yǎng)基，αΜΕΜ培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，F(xiàn)-12培養(yǎng)基，Ham’s培養(yǎng)基，RPMI1640培養(yǎng)基,Fischer，s培養(yǎng)基，及其混合培養(yǎng)基。
[0055]本發(fā)明中的“無血清培養(yǎng)基”表示不含未調(diào)節(jié)的或未純化的血清的培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，含有純化的血液來源的組分和動物組織來源的組分(例如，生長因子)的培養(yǎng)基被認(rèn)為是無血清培養(yǎng)基，除非其中含有未調(diào)節(jié)的或未純化的血清。
[0056]無血清培養(yǎng)基可以含有血清代替物。血清代替物的實(shí)例包括適當(dāng)?shù)睾欣缫韵挛镔|(zhì)的那些:清蛋白，運(yùn)鐵蛋白，脂肪酸，膠原蛋白前體，痕量元素，2-巰基乙醇或3’硫醇甘油，其等效物等。此種血清代替物可以通過例如W098/30679中所述的方法制備。此外，血清代替物可以是市售的產(chǎn)品。此種市售血清代替物的實(shí)例包括K η ο c k ο u tT M SerumReplacement (由 Invitrogen 生產(chǎn):下文中有時被稱為KSR) ,Chemically defined lipidconcentrate(化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物，由Gibco生產(chǎn))，和Glutamax?(由Gibco生產(chǎn))。
[0057]用于懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基可以含有脂肪酸或脂質(zhì)，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，維生素，生長因子，細(xì)胞因子，抗氧化劑，2-巰基乙醇，丙酮酸，緩沖劑，無機(jī)鹽等。
[0058]為避免復(fù)雜的制備，補(bǔ)充有適當(dāng)量(例如，約1-約20%)的市售的KSR的無血清培養(yǎng)基可以用作無血清培養(yǎng)基(例如，通過向F-12培養(yǎng)基和IMDM培養(yǎng)基的1:1混合物添加10%KSR和450μΜ 1-—硫代甘油獲得的培養(yǎng)基)。
[0059]本發(fā)明中的“含血清培養(yǎng)基”表示含有未調(diào)節(jié)的或未純化的血清的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基可以含有脂肪酸或脂質(zhì)，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，維生素，生長因子，細(xì)胞因子，抗氧化劑，2-巰基乙醇，1-一硫代甘油，丙酮酸，緩沖劑，無機(jī)鹽等。
[0060]本發(fā)明中的“基底膜制劑”是指這樣的制劑，其含有基底膜構(gòu)成成分，所述基底膜構(gòu)成成分具有這樣的功能，即在能夠形成基底膜的目標(biāo)細(xì)胞被置于其上并培養(yǎng)時，控制與上皮細(xì)胞類似的細(xì)胞形態(tài)，分化，生長，運(yùn)動，功能表達(dá)等。此處，“基底膜構(gòu)成成分”是指以薄膜形式存在于動物組織中的上皮細(xì)胞層和間質(zhì)細(xì)胞層之間等的胞外基質(zhì)分子?；啄ぶ苿┛梢酝ㄟ^例如以下方式制備:利用能夠溶解細(xì)胞脂質(zhì)的溶液(堿溶液等)去除能夠形成基底膜的細(xì)胞(所述細(xì)胞經(jīng)由基底膜粘附到支持物上)ο優(yōu)選的基底膜制劑的實(shí)例包括作為基底膜產(chǎn)品可商購的產(chǎn)品((例如，Matrigel?(由Beckton Dickinson生產(chǎn):下文中有時被稱為Matrigel))，和已知為基底膜成分的胞外基質(zhì)分子(例如，層粘連蛋白(Iaminin)，IV型膠原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan)，巢蛋白(entactin)等)。
[0061]Matrigel?是提取自Engelbreth Holm Swarn(EHS)小鼠肉瘤的基底膜產(chǎn)品。Matrigel?的主要成分是IV型膠原蛋白，層粘連蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。除了這些以外，還含有TGF-β，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，組織纖溶酶原激活物和由EHS腫瘤天然產(chǎn)生的生長因子。Matrigel?的“生長因子減少的產(chǎn)品”具有比普通的Matrigel?更低的生長因子濃度，并且其標(biāo)準(zhǔn)的EGF濃度為〈0.5ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)的NGF濃度為〈0.2ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)的PDGF濃度為<5pg/ml，標(biāo)準(zhǔn)的IGF-1濃度為5ng/ml，并且標(biāo)準(zhǔn)的TGF-β濃度為1.7ng/ml。
[0062]本發(fā)明中的“含有物質(zhì)X的培養(yǎng)基”表示補(bǔ)充有外源物質(zhì)X的培養(yǎng)基或含有外源物質(zhì)X的培養(yǎng)基，并且“不含物質(zhì)X的培養(yǎng)基”表示沒有補(bǔ)充外源物質(zhì)X的培養(yǎng)基或不含外源物質(zhì)X的培養(yǎng)基。此處，“外源物質(zhì)X”表示對要在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞或組織來說是外源的物質(zhì)X，并且由細(xì)胞或組織產(chǎn)生的內(nèi)源物質(zhì)X不包括在其中。
[0063]例如，“含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基”是補(bǔ)充有外源性的作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基或含有外源性的作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基?！安缓饔糜赟onic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基”是沒有補(bǔ)充外源性的作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基或不含外源性的作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基。
[0064]本發(fā)明中的“靈長類動物”表示屬于靈長類動物的哺乳動物。靈長類動物的實(shí)例包括原猴亞目(Strepsirrhini)如狐猴，懶猴和Tsubai，以及類人猿亞目(Haplorhini)如猴，類人猿和人。
[0065]在本發(fā)明中，“干細(xì)胞”是指在細(xì)胞分裂后仍能夠保持相同的分化能力的細(xì)胞，所述細(xì)胞可以在其組織受損時有助于組織的再生。此處，干細(xì)胞可以是胚胎干細(xì)胞(下文中有時被稱為ES細(xì)胞)或組織干細(xì)胞(也稱為組織的干細(xì)胞，組織特異性干細(xì)胞或體干細(xì)胞)，或人工多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞:誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)。如由上述干細(xì)胞來源的組織細(xì)胞可以再生組織的事實(shí)所理解的，已知干細(xì)胞可以分化為與活體內(nèi)的細(xì)胞接近的正常細(xì)胞。
[0066]干細(xì)胞可以獲得自指定的機(jī)構(gòu)，或者也可以購買市售的產(chǎn)品。例如，人胚胎干細(xì)胞，KhES-1，KhES_2和KhES-3，可獲得自 Kyoto University的Institute for FrontierMedical ScienceS(3EB5細(xì)胞可獲得自RIKEN，而D3細(xì)胞系可獲得自ATCC，所述每種都是小鼠胚胎干細(xì)胞。
[0067]干細(xì)胞可以通過本身已知的方法進(jìn)行培養(yǎng)來維持。例如，人干細(xì)胞可以通過在補(bǔ)充有Knockout? Serum Replacement(Invitrogen)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來維持。小鼠干細(xì)胞可以通過添加胎牛血清(FCS)和Leukemia Inhibitory Factor(LIF)并且在沒有飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)來維持。
[0068]在本發(fā)明中，“多能干細(xì)胞”是指這樣的干細(xì)胞，其能夠在體外培養(yǎng)并且有能力分化為構(gòu)成活體(除了胎盤以外)的任何細(xì)胞(三胚層(外胚層，中胚層，內(nèi)胚層)_來源的組織)(多能性)，并且胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)包括在多能干細(xì)胞中?！岸嗄芨杉?xì)胞”獲得自受精卵，克隆胚胎，再生性干細(xì)胞，和組織中的干細(xì)胞。在將若干種基因引入體細(xì)胞后具有與胚胎干細(xì)胞的分化多能性類似的人工分化多能性的細(xì)胞(也稱為人工多能干細(xì)胞)也包括在多能干細(xì)胞中。多能干細(xì)胞可以通過本身已知的方法制備。制備方法的實(shí)例包括Ce 11,2007,131(5)ρρ.861-872和Cell ,2006，126(4)ρρ.663-676中所述的方法。
[0069]在本發(fā)明中，“胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)”是指具有自身復(fù)制能力和多能性(multipotencyK特別地，“多能性”)的細(xì)胞，其是來源于早期胚胎的多能干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞首先于1981年被創(chuàng)建，并且自1989年起也已被應(yīng)用于敲除小鼠的產(chǎn)生。在1998年，創(chuàng)建了人胚胎干細(xì)胞，其也被用于再生醫(yī)學(xué)。
[0070]在本發(fā)明中，“人工多能干細(xì)胞”是指通過表達(dá)若干種基因如0ct3/4，Sox2，Klf4和Myc直接重編程分化的細(xì)胞如成纖維細(xì)胞等而被誘導(dǎo)成具有多能性的細(xì)胞，其由Yamanaka等在2006年在小鼠細(xì)胞中創(chuàng)建(Cell.2006，126(4)，pp.663-676)。在2007年，在人成纖維細(xì)胞中也建立了誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，并且其具有與胚胎干細(xì)胞類似的多能性(Cell，2007，131
(5)pp.861-872；Science,2007,318(5858)pp.1917-1920；Nat.B1technol.,2008,26(1)pp.101-106)。
[0071 ]遺傳修飾的多能干細(xì)胞可以例如使用同源重組技術(shù)來制備。染色體上要被修飾的基因的實(shí)例包括細(xì)胞標(biāo)記基因，組織相容性抗原基因，與由神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的紊亂所致的疾病相關(guān)的基因等。染色體上的革巴基因可以通過Manipulating the Mouse Embryo , ALaboratory Manual,Second Edit1n,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)；B1 Manual series 8,gene targeting,Product1n of mutant mouse using ESce I Is, Y0D0SHA C0.,LTD.(1995)等中所述的方法修飾。
[0072]具體地，例如，分離要被修飾的靶基因(例如，細(xì)胞標(biāo)記基因，組織相容性抗原基因，疾病相關(guān)基因等)的基因組基因，并且使用分離的基因組基因制備用于靶基因的同源重組的靶載體。將制備的靶載體引入到干細(xì)胞中，并且選擇顯示靶基因和靶載體之間的同源重組的細(xì)胞，由此可以制備在染色體上具有修飾的基因的干細(xì)胞。
[0073]作為用于分離靶基因的基因組基因的方法，可以提及Molecular MolecularCloning,A Laboratory Manual, Second Edit1n, Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989),Current Protocols in Molecular B1logy,John Wiley&Sons(1987-1997)等中所述的已知方法。此外，靶基因的基因組基因可以使用基因組DNA文庫篩選系統(tǒng)(由Genome Systems生產(chǎn))，Universal Genomeffalker Kits(由CL0NTECH生產(chǎn))等來分離。
[0074]根據(jù)GeneTargeting ,A Practical Approach , IRL Press at OxfordUniversity Press(1993)；B1 Manual series 8, gene targeting,Product1n ofmutant mouse using ES cells,Y0D0SHA C0.,LTD.(1995)等中所述的方法，可以制備用于靶基因的同源重組的靶載體，并且可以有效選擇同源重組體。靶載體可以是任何替換類型和插入類型的，并且選擇方法可以是陽性選擇，啟動子選擇，陰性選擇，PolyA選擇等。
[0075]作為從選擇的細(xì)胞系選擇目標(biāo)同源重組體的方法，可以提及用于基因組DNA的DNA雜交法，PCR法等。
[0076]本發(fā)明中的“團(tuán)聚體”是指分散在培養(yǎng)基中但是聚集從而形成團(tuán)聚體的細(xì)胞團(tuán)塊。本發(fā)明中的“團(tuán)聚體”包括由懸浮培養(yǎng)開始時分散的細(xì)胞形成的團(tuán)聚體和在懸浮培養(yǎng)開始時已經(jīng)形成的團(tuán)聚體。
[0077]當(dāng)細(xì)胞聚集而形成細(xì)胞團(tuán)聚體并且對團(tuán)聚體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時，“形成團(tuán)聚體”表示“快速地聚集一定數(shù)目的分散的細(xì)胞”從而形成均質(zhì)的細(xì)胞團(tuán)聚體。
[0078]在本發(fā)明中，優(yōu)選的是快速地聚集多能干細(xì)胞以允許形成多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體。通過以此方式形成多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體，在來自形成的團(tuán)聚體的、被誘導(dǎo)分化的細(xì)胞中可以形成具有良好再生性的上皮樣結(jié)構(gòu)。
[0079]形成團(tuán)聚體的實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)例包括涉及使用具有小孔的板(96孔板)、微孔等將細(xì)胞保持在小空間中的方法，涉及通過使用小離心管進(jìn)行短時間離心來聚集細(xì)胞的方法。
[0080]多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體是否已經(jīng)形成以及在形成團(tuán)聚體的細(xì)胞中是否已經(jīng)形成上皮樣結(jié)構(gòu)可以基于團(tuán)聚體的大小和細(xì)胞數(shù)，宏觀形態(tài)學(xué)，通過組織染色分析的微觀形態(tài)學(xué)及其均勻性，分化和未分化標(biāo)記物的表達(dá)及其均勻性，分化標(biāo)記物表達(dá)的控制及其同步性，團(tuán)聚體之間的分化效率的再現(xiàn)性等來確定。
[0081]在本發(fā)明中，“組織”是指細(xì)胞群結(jié)構(gòu)，其具有這樣的構(gòu)造，其中在形狀和性質(zhì)上不同的超過一種類型的細(xì)胞在空間上以特定模式被配置。
[0082]在本發(fā)明中，“視網(wǎng)膜組織”表示這樣的視網(wǎng)膜組織，其中構(gòu)成活體視網(wǎng)膜中的各個視網(wǎng)膜層的至少兩種類型以上的細(xì)胞如光感受器，水平細(xì)胞，雙極細(xì)胞，無長突細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，其先祖細(xì)胞或其視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞，在空間上被布置在多個層中。關(guān)于每種細(xì)胞，哪種細(xì)胞構(gòu)成哪個視網(wǎng)膜層可以通過已知方法確認(rèn)，例如，通過是否存在細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)或細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)水平等來確認(rèn)。
[0083]本發(fā)明中的“視網(wǎng)膜層”表示構(gòu)成視網(wǎng)膜的每個層。其具體實(shí)例包括視網(wǎng)膜色素上皮層，光感受器層，外界膜，外核層，外網(wǎng)織層，內(nèi)核層，內(nèi)網(wǎng)織層，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，神經(jīng)纖維層和內(nèi)界膜。
[0084]本發(fā)明中的“視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞”表示構(gòu)成視網(wǎng)膜層并且為視網(wǎng)膜層所專有的神經(jīng)細(xì)胞。視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞的實(shí)例包括雙極細(xì)胞，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，無長突細(xì)胞，水平細(xì)胞，光感受器，色素上皮細(xì)胞，視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞。
[0085]本發(fā)明中的“視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞”表示生物視網(wǎng)膜中的神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的外側(cè)上存在的上皮細(xì)胞。細(xì)胞是否是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于，例如，細(xì)胞標(biāo)志物(RPE65(色素上皮細(xì)胞)、Mitf (色素上皮細(xì)胞)等)的表達(dá)、黑色素粒的存在、多邊形的特征細(xì)胞形式等確認(rèn)。
[0086]本發(fā)明中的“視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞”是指能夠分化成任何成熟的視網(wǎng)膜細(xì)胞(光感受器，水平細(xì)胞，雙極細(xì)胞，無長突細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)的先祖細(xì)胞。
[0087]光感受器先祖細(xì)胞，水平先祖細(xì)胞，雙極先祖細(xì)胞，無長突先祖細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)先祖細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮先祖細(xì)胞分別是確定分化成光感受器，水平細(xì)胞，雙極細(xì)胞，無長突細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的先祖細(xì)胞。
[0088]視網(wǎng)膜細(xì)胞標(biāo)記物的實(shí)例包括表達(dá)于視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞中的Rax和PAX6，表達(dá)于下丘腦神經(jīng)元的先祖細(xì)胞而不表達(dá)于視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的Nkx2.1，表達(dá)于下丘腦神經(jīng)上皮而不表達(dá)于視網(wǎng)膜中的Soxl，表達(dá)于光感受器的先祖細(xì)胞中的Crx等。視網(wǎng)膜層特異的神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物的實(shí)例包括表達(dá)于雙極細(xì)胞中的ChxlO和L7，表達(dá)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的Tu j I和Brn3，表達(dá)于無長突細(xì)胞中的鈣視網(wǎng)膜蛋白，表達(dá)于水平細(xì)胞中的鈣結(jié)合蛋白，表達(dá)于光感受器中的視紫紅質(zhì)(Rhodopsin)和恢復(fù)蛋白，表達(dá)于色素上皮細(xì)胞中的RPE65和Mitf，表達(dá)于視桿細(xì)胞中的Nrl，表達(dá)于視錐細(xì)胞中的Rxr- γ等。
[0089]本發(fā)明的制備方法I是用于制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法，其包括以下步驟
(1)、(2)和(3):
[0090](I)第一步，將多能干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體，
[0091](2)第二步，將步驟(I)中形成的團(tuán)聚體在各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而獲得含有視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的團(tuán)聚體，和
[0092](3)第三步，將步驟(2)中獲得的團(tuán)聚體在各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而獲得含有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的團(tuán)聚體。
[0093]說明用于在無血清培養(yǎng)基中對多能干細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體的步驟(I)。
[0094]用于步驟(I)的無血清培養(yǎng)基不受特別限制只要其如上所述即可。例如，可以使用未補(bǔ)充任何作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基。為避免復(fù)雜的配制過程，優(yōu)選使用補(bǔ)充有適當(dāng)量的血清代替物如市售的KSR的無血清培養(yǎng)基(例如，通過向MDM和F-12的1:1混合物添加10%1?1?，45(^1 1_—硫代甘油和Ix化學(xué)成分明確的脂質(zhì)濃縮物(Chemically Defined Lipid Concentrate)獲得的培養(yǎng)基)。在例如人ES細(xì)胞的情況中，向無血清培養(yǎng)基添加的KSR的量通常為約I %至約20 %，優(yōu)選地約2 %至約20%。
[0095]步驟(I)中的培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度、CO2濃度可以被適當(dāng)?shù)卮_定。培養(yǎng)溫度例如是，約300C至約400C，優(yōu)選地約37°C。CO2濃度例如是，約I %至約10 %，優(yōu)選地約5 %。
[0096]步驟(I)中多能干細(xì)胞的濃度可以根據(jù)需要確定以更均勻且有效地形成多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體。例如，當(dāng)使用96孔微孔板對人ES細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時，將被制備成每孔約I X13至約5 X 15個細(xì)胞，優(yōu)選地約3 X 13至約5 X 14個細(xì)胞，更優(yōu)選地約5 X 13至約3 X 14個細(xì)胞，最優(yōu)選地約1.2X 14個細(xì)胞的液體添加到孔中，并且將板靜置以形成團(tuán)聚體。
[0097]形成團(tuán)聚體所需的懸浮培養(yǎng)的時間可以根據(jù)所使用的多能干細(xì)胞合適地確定，以允許細(xì)胞的均勻聚集。為了形成均勻的團(tuán)聚體，理想地，所述時間要盡可能短。例如，在人ES細(xì)胞的情況中，團(tuán)聚體優(yōu)選地在約24hr內(nèi)，更優(yōu)選地在約12hr內(nèi)形成。團(tuán)聚體形成所需的時間可以通過控制用于聚集細(xì)胞的工具、濃度條件等適當(dāng)?shù)卣{(diào)整。
[0098]是否已經(jīng)形成多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體可以基于團(tuán)聚體的大小和細(xì)胞數(shù)，宏觀形態(tài)學(xué)，通過組織染色分析的微觀形態(tài)學(xué)及其均勻性，分化和未分化標(biāo)記物的表達(dá)及其均勻性，分化標(biāo)記物表達(dá)的控制及其同步性，團(tuán)聚體之間的分化效率的再現(xiàn)性等來確定。
[0099]說明步驟(2)，步驟(2)包括在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(I)中形成的團(tuán)聚體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于Sonichedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，由此獲得含視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的團(tuán)聚體。
[0100]作為用于步驟(2)的培養(yǎng)基，使用例如未補(bǔ)充作用于Sonichedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而補(bǔ)充有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基，并且添加基底膜制劑是不必要的。
[0101]用作此種培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基不受特別限制只要其如上所述即可。為避免復(fù)雜的配制過程，優(yōu)選使用補(bǔ)充有適當(dāng)量的血清代替物如市售的KSR的無血清培養(yǎng)基(例如，通過向頂DM和F-12的1:1混合物添加10 %KSR，450μΜ I_一硫代甘油和Ix化學(xué)成分明確的脂質(zhì)濃縮物獲得的培養(yǎng)基)。在例如人ES細(xì)胞的情況中，向無血清培養(yǎng)基添加的KSR的量通常為約I %至約20 %，優(yōu)選地約2 %至約20 %。
[0102]作為用于步驟(2)的無血清培養(yǎng)基，步驟(I)中使用的無血清培養(yǎng)基可以被原樣使用，只要其不含有作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)即可，或者可以被替換以新鮮的無血清培養(yǎng)基。當(dāng)將步驟(I)中使用的無血清培養(yǎng)基直接用于步驟(2)時，僅需要向培養(yǎng)基中添加作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)。
[0?03]作用于Sonic hedgehog(下文中有時被稱為Shh)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)是能夠增強(qiáng)由Shh介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)。作用于Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的實(shí)例包括屬于Hedgehog家族的蛋白質(zhì)(例如，Shh)，Shh受體，Shh受體激動劑，Purmorphamine，SAG等。
[0104] “不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)”的培養(yǎng)基還包括基本上不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基，如含有的作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的濃度不會對向視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞和視網(wǎng)膜組織的選擇性分化產(chǎn)生不利影響的培養(yǎng)基。
[0?05] “沒有補(bǔ)充作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)”的培養(yǎng)基還包括基本上沒有補(bǔ)充作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基，如補(bǔ)充的作用于Sonichedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的濃度不會對向視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞和視網(wǎng)膜組織的選擇性分化產(chǎn)生不利影響的培養(yǎng)基。
[0106]作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)是能夠增強(qiáng)由BMP介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)。作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的實(shí)例包括BMP蛋白如BMP2，BMP4或BMP7，⑶F蛋白如GDF7，抗-BMP受體抗體，BMP部分肽等。BMP2蛋白，BMP4蛋白和BMP7蛋白可獲得自，例如，R&D Systems,而GDF7蛋白可獲得自，例如，Wako Pure Chemical Industries ,Ltd。
[0107]作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的濃度僅需要是能夠誘導(dǎo)形成多能干細(xì)胞團(tuán)聚體的細(xì)胞向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化的濃度。在BMP4的情況中，例如，其以約0.0InM至約ΙμΜ，優(yōu)選地約
0.1nM至約10nM，更優(yōu)選地約1.5ηΜ的濃度被添加到培養(yǎng)基中。
[0108]作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)僅需要在步驟(I)中的懸浮培養(yǎng)開始起的約24小時后被添加，并且可以在自懸浮培養(yǎng)開始起的若干天內(nèi)(例如，在15天內(nèi))被添加到培養(yǎng)基。優(yōu)選地，作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)在自懸浮培養(yǎng)開始起的第I天至第15天，更優(yōu)選地第I天至第9天，最優(yōu)選地第3天被添加到培養(yǎng)基中。
[0109]在作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)被添加到培養(yǎng)基中并且形成多能干細(xì)胞團(tuán)聚體的細(xì)胞向視網(wǎng)膜細(xì)胞的誘導(dǎo)分化開始后，不需要向培養(yǎng)基添加作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，并且培養(yǎng)基可以被替換成無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自不含作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，由此降低培養(yǎng)基的成本。可以例如通過檢測Rax基因在細(xì)胞中的表達(dá)來確定已經(jīng)開始向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化誘導(dǎo)的細(xì)胞。還可能的是，通過在存在向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化誘導(dǎo)所需的濃度的作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的情況下，對步驟(I)中使用在Rax基因座已經(jīng)敲入有熒光報告蛋白基因如GFP的多能干細(xì)胞形成的團(tuán)聚體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并且檢測由表達(dá)的熒光報告蛋白發(fā)出的熒光來確認(rèn)開始向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化誘導(dǎo)的時間。步驟(2)的實(shí)施方案之一是這樣的步驟，其包括在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中對步驟(I)中形成的團(tuán)聚體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)直至表達(dá)Rax基因的細(xì)胞出現(xiàn)，所述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基各自含有為向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化誘導(dǎo)所需的濃度的作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，從而獲得包含視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的團(tuán)聚體。
[0110]步驟(2)中的培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度、CO2濃度可以被適當(dāng)?shù)卮_定。培養(yǎng)溫度例如是，約300C至約400C，優(yōu)選地約37°C。CO2濃度例如是，約I %至約10 %，優(yōu)選地約5 %。
[0111]已經(jīng)獲得含有視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的團(tuán)聚體可以通過例如在團(tuán)聚體中檢測表達(dá)視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞標(biāo)志物Rax或PAX6的細(xì)胞的存在來確認(rèn)。
[0112]說明步驟(3)，步驟(3)包括將步驟(2)中獲得的團(tuán)聚體在各自不含作用于Sonichedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而獲得含有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的團(tuán)聚體。
[0113]步驟(3)中使用的培養(yǎng)基是，例如，沒有補(bǔ)充作用于Sonichedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)中的任一種而補(bǔ)充以作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基。
[0114]“不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)”的培養(yǎng)基還包括基本上不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基，例如，含有的作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的濃度不會對向視網(wǎng)膜組織的選擇性分化產(chǎn)生不利影響的培養(yǎng)基。
[0115]“沒有補(bǔ)充作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)中的任一種”的培養(yǎng)基還包括基本上沒有補(bǔ)充作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基，例如，補(bǔ)充的作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的濃度不會對向視網(wǎng)膜組織的選擇性分化產(chǎn)生不利影響的培養(yǎng)基。
[0116]用作此種培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基的實(shí)例包括上文提及的培養(yǎng)基。優(yōu)選的是這樣的無血清培養(yǎng)基，其是補(bǔ)充以神經(jīng)營養(yǎng)因子如N2補(bǔ)充劑(Invitrogen)、B27補(bǔ)充劑(Invitrogen)的混合物而沒有補(bǔ)充KSR的基礎(chǔ)培養(yǎng)基如DMEM-F12培養(yǎng)基。
[0117]作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)是可以增強(qiáng)由Wnt介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)。作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的實(shí)例包括屬于1的家族的蛋白(例如，￥的1、￥的3&、￥的7&)，￥的受體激動劑，GSK30抑制劑(例如，6-溴靛玉紅-3，-月虧(6-Bromoindi rub in-3，-o xi me) (B1)，CHIR99021，Kenpaullone)等。
[0118]作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的濃度可以是任意的，只要可以誘導(dǎo)形成多能干細(xì)胞團(tuán)聚體的細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞即可。例如，在CHIR99021的情形中，將其以約0.ΙμΜ至約I ΟΟμΜ，優(yōu)選約ΙμΜ至約30μΜ，更優(yōu)選約3μΜ的濃度加入。
[0119]當(dāng)使用人ES細(xì)胞時，例如，不早于自步驟(I)中的懸浮培養(yǎng)開始的第12天，優(yōu)選在第18天，加入作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)。
[0120]在步驟(3)中，更優(yōu)選在各自不含作用于Sonichedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，而含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)和抑制FGF信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)團(tuán)聚體。
[0121]抑^iJFGF信號途徑的物質(zhì)是能夠抑制由FGF介導(dǎo)的信號的物質(zhì)。抑^iJFGF信號途徑的物質(zhì)的實(shí)例包括FGF受體，F(xiàn)GF受體抑制劑(例如，SU-5402、AZD4547、BGJ398)，MAP激酶級聯(lián)抑制物質(zhì)(例如，MEK抑制劑、MAPK抑制劑、ERK抑制劑)，P13激酶抑制劑，Akt抑制劑等。
[0122]用于步驟(3)的抑制FGF信號途徑的物質(zhì)的濃度可以是任意的，只要能夠誘導(dǎo)形成多能干細(xì)胞團(tuán)聚體的細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞即可。例如，在SU-5402的情形中，將其以約0.1μΜ至約I ΟΟμΜ，優(yōu)選約ΙμΜ至約30μΜ，更優(yōu)選約I ΟμΜ的濃度加入。
[0123]因?yàn)檫@樣產(chǎn)生的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞存在于團(tuán)聚體的表面，它們可以通過顯微觀察等確認(rèn)。還可能通過將含有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的團(tuán)聚體進(jìn)行分散處理(例如，胰蛋白酶/EDTA處理)，并且通過使用FACS選擇得到的細(xì)胞獲得高度純的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。還可能以物理方式通過使用鑷子等從團(tuán)聚體上取下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞并培養(yǎng)所述細(xì)胞。由此分散或取下的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可以在粘附條件下培養(yǎng)。還可能通過使用微量移液器等進(jìn)行移液操作來使含有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的團(tuán)聚體瓦解，并且在粘附條件下進(jìn)一步培養(yǎng)得到的細(xì)胞。在粘附培養(yǎng)的情形中，優(yōu)選使用細(xì)胞粘附培養(yǎng)容器，例如，用細(xì)胞外基質(zhì)等(例如，聚-D-賴氨酸、層粘連蛋白、纖維連接蛋白(fibronectin))涂敷處理后的培養(yǎng)容器。粘附培養(yǎng)的培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度、CO2濃度和O2濃度可以酌情確定。在該情況下，可以在血清、已知的生長因子和促進(jìn)生長的添加劑和化學(xué)物質(zhì)存在下培養(yǎng)細(xì)胞。已知的生長因子的實(shí)例包括EGF、FGF等。促進(jìn)生長的添加劑的實(shí)例包括N2補(bǔ)充劑(Invitrogen)、B27補(bǔ)充劑(Invitrogen)等。
[0124]本發(fā)明的制備方法2是一種用于制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片的方法，其包括以下步驟(1)、(2)、(3)和(4):
[0125](I)第一步，將多能干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體，
[0126](2)第二步，將步驟(I)中形成的團(tuán)聚體在各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而獲得含有視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的團(tuán)聚體，[Ο127] (3)第三步，將步驟(2)中獲得的團(tuán)聚體在各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而獲得含有視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的團(tuán)聚體，和
[0128](4)第四步，分散步驟(3)中獲得的團(tuán)聚體并且將得到的細(xì)胞進(jìn)行粘附培養(yǎng)。
[0129]可以與本發(fā)明的制備方法I的步驟(I)、步驟(2)和步驟(3)類似地進(jìn)行本發(fā)明的制備方法2的步驟(I)、步驟(2)和步驟(3)。
[0130]說明步驟(4)，步驟(4)用于分散步驟(3)中獲得的團(tuán)聚體并且將得到的細(xì)胞進(jìn)行粘附培養(yǎng)。
[0131]在步驟(3)開始后的60天內(nèi)，優(yōu)選30天內(nèi)，更優(yōu)選為3天進(jìn)行步驟(4)。
[0132]將在步驟(4)中分散的源自團(tuán)聚體的細(xì)胞接種在粘附培養(yǎng)容器中至能夠有效形成均勻的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片的濃度。例如，當(dāng)使用65mmBoyden小室將源自團(tuán)聚體的細(xì)胞進(jìn)行粘附培養(yǎng)時，將被制備成含有約I X 13至約I X 17個細(xì)胞，優(yōu)選為約3 X 13至約5 X 16個細(xì)胞，更優(yōu)選為約5 X 13至約I X 16個細(xì)胞，更優(yōu)選為約2 X 15個細(xì)胞/孔的溶液加入孔中，并且靜置平板以讓源自團(tuán)聚體的細(xì)胞粘附并培養(yǎng)。
[0133]用于步驟(4)中的粘附培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基的實(shí)例包括上述培養(yǎng)基。為了避免復(fù)雜的配置過程，例如，優(yōu)選使用補(bǔ)充以適量的血清代替物如可商購的KSR的無血清培養(yǎng)基(例如，其中加入有DMEM/F-12和Neurobasal的1:1混合物以及l(fā)/2x N2補(bǔ)充劑、l/2x B27補(bǔ)充劑和ΙΟΟμΜ 2-巰基乙醇的培養(yǎng)基)。在例如源自人ES細(xì)胞的細(xì)胞的情形中，加入到無血清培養(yǎng)基的KSR的濃度通常是約I %至約20 %，優(yōu)選約2 %至約20 %。
[0134]在步驟(4)中，優(yōu)選在含有ROCK抑制物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
[0135]ROCK抑制物質(zhì)是能夠抑制經(jīng)由Rho激酶介導(dǎo)的信號的物質(zhì)。ROCK抑制物質(zhì)的實(shí)例包括Υ-27632和法舒地爾(Fasudi I)。
[0136]用于步驟(4)的ROCK抑制物質(zhì)的濃度可以是任意的，只要可以有效形成均勻的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片即可。例如，在Υ-27632的情形中，將其以約Ο.ΟΙμΜ至約ΙΟΟμΜ，優(yōu)選約IμΜ至約30μΜ，更優(yōu)選約20μΜ的濃度加入。
[0137]在步驟(4)中，更優(yōu)選的是在進(jìn)一步含有一種或多種選自由以下各項(xiàng)組成的組的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞:作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)、抑制FGF信號途徑的物質(zhì)、作用于激活素信號途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)。
[0138]作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的實(shí)例包括屬于Wnt家族的蛋白(例如，Wntl、Wnt3a、Wnt7a)，Wnt受體激動劑，GSK3^l]]制劑(例如，6-溴靛玉紅-3’ -H虧(6-Bromoindirubin_3’ -oxime)(B1)、CHIR99021、Kenpaullone)等。
[0139]用于步驟(4)的作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的濃度可以是任意的，只要可以有效形成均勻的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片即可。例如，在CHIR99021的情形中，將其以約0.ΙμΜ至約I ΟΟμΜ，優(yōu)選約ΙμΜ至約30μΜ，更優(yōu)選約3μΜ的濃度加入。
[0140]例如，在從步驟(4)開始的18天內(nèi)，優(yōu)選在第6天加入作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)。
[0141]抑制FGF信號途徑的物質(zhì)的實(shí)例包括FGF受體，F(xiàn)GF受體抑制劑(例如，SU-5402、八204547、861398)，1^?激酶級聯(lián)抑制物質(zhì)(例如，腿1(抑制劑、1^?1(抑制劑』孤抑制劑)，？13激酶抑制劑和Akt抑制劑。
[0142]用于步驟(4)的抑制FGF信號途徑的物質(zhì)的濃度可以是任意的，只要可以有效形成均勻的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片即可。例如，在SU-5402的情形中，將其以約0.1口1至約10(^，優(yōu)選約ΙμΜ至約30μΜ，更優(yōu)選約I ΟμΜ的濃度加入。
[0143]例如，在從步驟(4)開始的18天內(nèi)，優(yōu)選在第6天加入抑制FGF信號途徑的物質(zhì)。
[0144]作用于激活素信號途徑的物質(zhì)是能夠增強(qiáng)由激活素介導(dǎo)的信號的物質(zhì)。作用于激活素信號途徑的物質(zhì)的實(shí)例包括屬于激活素家族的蛋白(例如，激活素Α、激活素B、激活素C、激活素AB等)，激活素受體和激活素受體激動劑。
[0145]用于步驟(4)的作用于激活素信號途徑的物質(zhì)的濃度可以是任意的，只要能夠有效形成均勻的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片即可。例如，在重組人/小鼠/大鼠激活素A(R&DSystems，Inc.#338_AC)的情形中，將其以約lng/ml至約 10yg/ml，優(yōu)選約 10ng/ml至約 lyg/ml，更優(yōu)選約100ng/ml的濃度加入。
[0146]例如，在從步驟(4)開始的18天內(nèi)，優(yōu)選在第6天加入作用于激活素信號途徑的物質(zhì)。
[0147]作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的實(shí)例包括BMP蛋白如BMP2、BMP4或BMP7和⑶F蛋白如GDF7等、抗-BMP受體抗體、BMP部分肽等。
[0148]用于步驟(4)中的作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的濃度可以是任意的，只要能夠有效形成均勻的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片即可。例如，在BMP4的情形中，將其以約0.0lnM至約ΙμΜ，優(yōu)選約0.1nM至約10nM，更優(yōu)選約1.5nM的濃度加入。
[0149]例如，在從步驟(4)開始的18天內(nèi)，優(yōu)選在第6天加入作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)。
[0150]在步驟(4)中，例如，將細(xì)胞培養(yǎng)在進(jìn)一步含有一種選自由以下各項(xiàng)組成的組的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中:作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)，抑制FGF信號途徑的物質(zhì)，作用于激活素信號途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，或在進(jìn)一步含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)和抑制FGF信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中。
[0151]在步驟(4)中，優(yōu)選在用培養(yǎng)基質(zhì)表面處理的培養(yǎng)容器材料上進(jìn)行粘附培養(yǎng)。
[0152]作為用于在步驟(4)中處理培養(yǎng)容器材料的培養(yǎng)基質(zhì)，可以提及允許粘附培養(yǎng)源自團(tuán)聚體的細(xì)胞，并形成視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)。為了避免復(fù)雜的制備并防止源自異源物種的成分的污染，優(yōu)選使用合成的培養(yǎng)基質(zhì)、源自人的基底膜成分、重組人基底膜蛋白等。這樣的培養(yǎng)基質(zhì)的具體實(shí)例包括合成的培養(yǎng)基質(zhì)如Synthemax?(Corningincorporated)等，源自人的基底膜成分如Cellstart?(Invitrogen)，人細(xì)胞外基質(zhì)(BD)等，重組人層粘連蛋白如人重組層粘連蛋白Ill(B1lamina)、人重組層粘連蛋白511(B1lamina)、人重組層粘連蛋白521 (B1lamina)、人重組層粘連蛋白411 (B1lamina)、人重組層粘連蛋白421 (B1lamina )、人重組層粘連蛋白332 (B1lamina)和人重組層粘連蛋白211(B1lamina)等。如本文使用的，層粘連蛋白111是由α?鏈、β?鏈和γ?鏈組成的層粘連蛋白，層粘連蛋白511是由α5鏈、β?鏈和γ I鏈組成的層粘連蛋白，層粘連蛋白521是由α5鏈、β2鏈和Y I鏈組成的層粘連蛋白，層粘連蛋白411是由α4鏈、β?鏈和γ I鏈組成的層粘連蛋白，層粘連蛋白421是由α4鏈、β2鏈和γ I鏈組成的層粘連蛋白，層粘連蛋白332是由α3鏈、β3鏈和Y 2鏈組成的層粘連蛋白，并且層粘連蛋白211是是由α2鏈、β?鏈和Tl鏈組成的層粘連蛋白。此外，由層粘連蛋白的α鏈、β鏈和γ鏈中每個的C端區(qū)域構(gòu)成的稱為ES片段的部分，也已知顯示對由細(xì)胞表達(dá)的整聯(lián)蛋白的結(jié)合活性(J.B1l.Chem.,284,7820-7831 (2009))。因此，預(yù)期其可類似于上述粘連蛋白使用。
[0153]通過本發(fā)明的制備方法I或2產(chǎn)生的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片具有與體內(nèi)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞極為類似的特性。因此，其還可用于篩選用于由視網(wǎng)膜細(xì)胞的病癥所致的疾病的治療藥物，或用于細(xì)胞治療的移植材料，用于研究疾病的材料或用于其他病因?qū)е碌募?xì)胞損傷的治療藥物的藥物發(fā)現(xiàn)材料。此外，其可用于研究毒性如光毒性，化學(xué)物質(zhì)等的毒性和藥效評價中的毒性測試等。
[0154]由視網(wǎng)膜細(xì)胞的病癥所致的疾病的實(shí)例包括有機(jī)萊中毒(organicmercurypoisoning)、氯喹視網(wǎng)膜病(chloroquine retinopathy)、色素性視網(wǎng)膜炎(retinitispigmentosa)、年齡相關(guān)黃斑變性(age-related macular degenerat1n)、青光眼(glaucoma)、糖尿病性視網(wǎng)膜病(diabetic retinopathy)、新生兒視網(wǎng)膜病(neonatalretinopathy)等。
[0155]本發(fā)明的制備方法I或2制備的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片可以用作用于移植的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，所述細(xì)胞用于在細(xì)胞損傷狀態(tài)補(bǔ)充損傷的細(xì)胞或病變組織本身(例如，用于移植手術(shù))等。
實(shí)施例
[0156]以下參考實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，所述實(shí)施例不被認(rèn)為是限制性的。
[0157]實(shí)施例1:使用人ES細(xì)胞制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞
[0158]根據(jù)uUeno, M.等人 PNAS 2006 ,103(25)，9554-9559” 和 uWatanabe, K.等人 NatB1tech 2007，25，681-686”中所述的方法培養(yǎng)人ES細(xì)胞(源自KhES-Ι)。作為培養(yǎng)基，使用通過將20%KSR(Knockout? Serum Replacement ； Invitrogen) ,0.1mM 2-疏基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，Ix非必需氨基酸，5ng/ml bFGF加入至DMEM/F12培養(yǎng)基(Sigma)中獲得的培養(yǎng)基。使用TrypLE Expressdnvitrogen)將培養(yǎng)的ES細(xì)胞分散為單個細(xì)胞，并且將單個分散的ES細(xì)胞以非細(xì)胞粘附96孔培養(yǎng)板(sumilon球形板，SUMITOMO BAKELI TE C0.，Ltd.)的每個孔1.2乂104個細(xì)胞懸浮在10(^1的無血清培養(yǎng)基中以允許快速形成團(tuán)聚體，并且在37°(:，5%CO2進(jìn)行培養(yǎng)。作為用于此的無血清培養(yǎng)基，使用通過將10%KSR，450yM 1-—硫代甘油，Ix化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物，20μΜ Υ27632加入至F-12培養(yǎng)基和頂DM培養(yǎng)基的1:1混合物中而獲得的無血清培養(yǎng)基。在自開始懸浮培養(yǎng)的第3天，以終濃度1.5ηΜ加入ΒΜΡ4，并且繼續(xù)懸浮培養(yǎng)。每3天將孔中一半量的培養(yǎng)基與沒有補(bǔ)充作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的上述培養(yǎng)基交換。在自開始懸浮培養(yǎng)的第18天，將團(tuán)聚體轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基(其是含有3μΜCHIR99021并添加有Ix Ν2補(bǔ)充劑的DMEM/F-12培養(yǎng)基)，并且培養(yǎng)直到自開始懸浮培養(yǎng)的第21天，并且進(jìn)行顯微觀察。
[0159]在自開始懸浮培養(yǎng)的第18天，確認(rèn)神經(jīng)上皮的形成(圖1Α)。在自開始懸浮培養(yǎng)的第21天，確認(rèn)細(xì)胞分化為具有薄的上皮的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(圖1Β)。
[0160]實(shí)施例2:使用人ES細(xì)胞制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞
[0161]根據(jù)“Ueno，M.等人PNAS 2006，103 (25 )，9554-9559” 和 “Watanabe，K.等人NatB1tech 2007，25，681-686”中所述的方法培養(yǎng)人ES細(xì)胞(源自KhES-1)。作為培養(yǎng)基，使用通過將20%KSR(Knockout? Serum Replacement ； Invitrogen) ,0.1mM 2-疏基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，Ix非必需氨基酸，5ng/ml bFGF加入至DMEM/F12培養(yǎng)基(Sigma)獲得的培養(yǎng)基。使用TrypLE Expressdnvitrogen)將培養(yǎng)的ES細(xì)胞分散為單個細(xì)胞，并且將單個分散的ES細(xì)胞以非細(xì)胞粘附96孔培養(yǎng)板(sumilon球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，Ltd.)的每個孔1.2父104個細(xì)胞懸浮在10(^1的無血清培養(yǎng)基中以允許快速形成團(tuán)聚體，并且在37°(:，5%0)2進(jìn)行培養(yǎng)。作為用于此的無血清培養(yǎng)基，使用通過將10%KSR，450yM 1-—硫代甘油，Ix化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物，20μΜ Υ27632添加至F-12培養(yǎng)基和頂DM培養(yǎng)基的1:1混合物獲得的無血清培養(yǎng)基。在自開始懸浮培養(yǎng)的第3天，以終濃度1.5ηΜ添加ΒΜΡ4，并且繼續(xù)懸浮培養(yǎng)。每3天將孔中一半量的培養(yǎng)基與沒有補(bǔ)充作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的上述培養(yǎng)基交換。在自開始懸浮培養(yǎng)的第18天，將團(tuán)聚體轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基(其是含有3μΜ CHIR99021并添加有Ix Ν2補(bǔ)充劑的DMEM/F-12培養(yǎng)基)，并且繼續(xù)懸浮培養(yǎng)直到自開始懸浮培養(yǎng)的第21天。作為對照，甚至在不存在CHIR99021的情況下類似地培養(yǎng)團(tuán)聚體。一部分在含有CHIR99021的前述培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的團(tuán)聚體在相同培養(yǎng)基條件下經(jīng)歷懸浮培養(yǎng)直到自開始懸浮培養(yǎng)的第27天，并且另一部分從開始懸浮培養(yǎng)的第21天至第27天在37°C，5%⑶2在無血清培養(yǎng)基(其是含有3μΜ CHIR99021(作用于Wnt信號途徑的物質(zhì))和ΙΟμΜ SU_5402(抑制FGF信號途徑的物質(zhì))并添加有Ix N2補(bǔ)充劑的DMEM/F-12培養(yǎng)基)中經(jīng)歷懸浮培養(yǎng)。
[0162]在從培養(yǎng)的第21天起不存在作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的情況下培養(yǎng)團(tuán)聚體，具有薄的上皮的視網(wǎng)膜色素上皮變回具有厚的上皮的神經(jīng)上皮(圖2A)，而在作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的存在下繼續(xù)培養(yǎng)的團(tuán)聚體中，暗色的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞出現(xiàn)在幾乎所有團(tuán)聚體的表面上(圖2B)。在作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)和抑制FGF信號途徑的物質(zhì)的存在下培養(yǎng)的團(tuán)聚體顯示分化誘導(dǎo)效率的增加，并且形成具有在幾乎所有團(tuán)聚體的表面上的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的團(tuán)聚體(圖2C)。
[0163]實(shí)施例3:使用人ES細(xì)胞制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞
[0164]根據(jù)uUeno, M.等人 PNAS 2006 ,103(25)，9554-9559” 和 uWatanabe, K.等人 NatB1tech 2007，25，681-686”中所述的方法培養(yǎng)人ES細(xì)胞(源自KhES-Ι)。作為培養(yǎng)基，使用通過將20%KSR(Knockout? Serum Replacement ； Invitrogen) ,0.1mM 2-疏基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，Ix非必需氨基酸，5ng/ml bFGF加入至DMEM/F12培養(yǎng)基(Sigma)中獲得的培養(yǎng)基。使用TrypLE Expressdnvitrogen)將培養(yǎng)的ES細(xì)胞分散為單個細(xì)胞，并且將單個分散的ES細(xì)胞以非細(xì)胞粘附96孔培養(yǎng)板(sumilon球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，Ltd.)的每個孔
1.2乂104個細(xì)胞懸浮在10(^1的無血清培養(yǎng)基中以允許快速形成團(tuán)聚體，并且在37°(:，5%CO2進(jìn)行培養(yǎng)。作為用于此的無血清培養(yǎng)基，使用通過將10%KSR，450yM 1-—硫代甘油，Ix化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物，20μΜ Υ27632加入至F-12培養(yǎng)基和頂DM培養(yǎng)基的1:1混合物獲得的無血清培養(yǎng)基。在自開始懸浮培養(yǎng)的第3天，以終濃度1.5ηΜ加入ΒΜΡ4，并繼續(xù)懸浮培養(yǎng)。每3天將孔中一半量的培養(yǎng)基與沒有補(bǔ)充作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的上述培養(yǎng)基交換。在自開始懸浮培養(yǎng)的第18天，將團(tuán)聚體轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基(其是含有3μΜCHIR99021并添加有Ix Ν2補(bǔ)充劑的DMEM/F-12培養(yǎng)基)，并且繼續(xù)懸浮培養(yǎng)直到自開始懸浮培養(yǎng)的第21天。在自開始懸浮培養(yǎng)的第21天，通過用微量移液器吸入并噴出溶液來使團(tuán)聚體瓦解，并且將得到的細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基(其是含有3μΜ CHIR99021(作用于Wnt信號途徑的物質(zhì))并添加有Ix Ν2補(bǔ)充劑的DMEM/F-12培養(yǎng)基)中，在37°C，5%C02進(jìn)行粘附培養(yǎng)。
[0165]到自開始懸浮培養(yǎng)的第27天，觀察到具有特征性多邊細(xì)胞形式的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(圖3A)。通過細(xì)胞染色方法確認(rèn)蛋白的表達(dá)。結(jié)果是，細(xì)胞對轉(zhuǎn)錄因子Mitf (其是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞標(biāo)志物)呈陽性(圖3B)并且對ZO-1(其是緊密連接標(biāo)志物)呈陽性(圖3C)，由此確認(rèn)獲得的細(xì)胞是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。
[0166]實(shí)施例4:使用人ES細(xì)胞制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片
[0167]根據(jù)“Ueno，M.等人PNAS 2006，103 (25 )，9554-9559” 和 “Watanabe，K.等人NatB1tech 2007，25，681-686”中所述的方法培養(yǎng)人ES細(xì)胞(源自KhES-1)。作為培養(yǎng)基，使用通過將20%KSR(Knockout? Serum Replacement ； Invitrogen) ,0.1mM 2-疏基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，Ix非必需氨基酸，5ng/ml bFGF加入至DMEM/F12培養(yǎng)基(Sigma)獲得的培養(yǎng)基。使用TrypLE Expressdnvitrogen)將培養(yǎng)的ES細(xì)胞分散為單個細(xì)胞，并且將單個分散的ES細(xì)胞以非細(xì)胞粘附96孔培養(yǎng)板(sumilon球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，Ltd.)的每個孔1.2X 14個細(xì)胞懸浮在100μ1的無血清培養(yǎng)基中，以允許快速形成團(tuán)聚體，并且在37°C，5 %CO2進(jìn)行培養(yǎng)。作為用于此的無血清培養(yǎng)基，使用通過將10%KSR，450yM 1-—硫代甘油，Ix化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物，20μΜ Υ27632加入至F-12培養(yǎng)基和頂DM培養(yǎng)基的1:1混合物獲得的無血清培養(yǎng)基。在自開始懸浮培養(yǎng)的第3天，以終濃度1.5ηΜ加入ΒΜΡ4，并繼續(xù)懸浮培養(yǎng)。每3天將孔中一半量的培養(yǎng)基與沒有補(bǔ)充作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的上述培養(yǎng)基交換。在自開始懸浮培養(yǎng)的第18天，將團(tuán)聚體轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基(其是含有3μΜ CHIR99021并添加有Ix Ν2補(bǔ)充劑的DMEM/F-12培養(yǎng)基)并培養(yǎng)直到自開始懸浮培養(yǎng)的第21天。在自開始懸浮培養(yǎng)的第21天，將團(tuán)聚體在細(xì)胞分散溶液Accutase (ICT)中分散，并且使用40μπι細(xì)胞濾器除去碎片。將得到的細(xì)胞懸浮在無血清培養(yǎng)基(200μ1)(其是添加有10%KSR，1/2N2補(bǔ)充劑，1/2B27補(bǔ)充劑，20μΜ Υ27632的DMEM/F-12培養(yǎng)基和Neurobasal培養(yǎng)基的1:1混合物)，并且以2x105個細(xì)胞/孔接種在用Synthemax?涂覆處理后的65mm Boy den小室(Transwe 11，Corning Incorporated)中，還將具有相同組成的培養(yǎng)基(Iml)加入到下部的孔中，并且在37°C，5%C02進(jìn)行粘附培養(yǎng)。每3天交換培養(yǎng)基，并且在自開始懸浮培養(yǎng)的第40天在顯微鏡下觀察上皮形成水平。
[0168]到自開始懸浮培養(yǎng)的第40天，形成具有色素積累的具有特征多邊細(xì)胞形式(圖4B)的均勻的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片(圖4A)。
[0169]實(shí)施例5:使用人ES細(xì)胞制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片
[0170]根據(jù)“Ueno，M.等人PNAS 2006，103 (25 )，9554-9559” 和 “Watanabe，K.等人NatB1tech 2007，25，681-686”中所述的方法培養(yǎng)人ES細(xì)胞(源自KhES-1)。作為培養(yǎng)基，使用通過將20%KSR(Knockout? Serum Replacement ； Invitrogen) ,0.1mM 2-疏基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，Ix非必需氨基酸，5ng/ml bFGF加入至DMEM/F12培養(yǎng)基(Sigma)獲得的培養(yǎng)基。使用TrypLE Express (Invitrogen)將培養(yǎng)的ES細(xì)胞分散為單個細(xì)胞，并且將上述培養(yǎng)的ES細(xì)胞以非細(xì)胞粘附96孔培養(yǎng)板(sumilon球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，Ltd.)的每個孔1.2X 14個細(xì)胞懸浮在100μ1的無血清培養(yǎng)基中以允許快速形成團(tuán)聚體并且在37°C，5%⑶2進(jìn)行培養(yǎng)。作為用于此的無血清培養(yǎng)基，使用通過將10%KSR，450yM 1-—硫代甘油，Ix化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物，20μΜ Υ27632加入至F-12培養(yǎng)基和頂DM培養(yǎng)基的1:1混合物獲得的無血清培養(yǎng)基。在自開始懸浮培養(yǎng)的第3天，以濃度1.5ηΜ加入ΒΜΡ4，并繼續(xù)懸浮培養(yǎng)。每3天將孔中一半量的培養(yǎng)基與沒有補(bǔ)充作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的上述培養(yǎng)基交換。在自開始懸浮培養(yǎng)的第18天，將團(tuán)聚體轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基(其是含有3μΜ CHIR99021并添加有Ix N2補(bǔ)充劑的DMEM/F-12培養(yǎng)基)并且培養(yǎng)直到自開始懸浮培養(yǎng)的第21天。在自開始懸浮培養(yǎng)的第21天，將團(tuán)聚體在細(xì)胞分散溶液Accutase (ICT)中分散，并使用40μπι細(xì)胞濾器去除碎片。將得到的細(xì)胞懸浮在無血清培養(yǎng)基(200μ1)(其是添加有10%KSR，1/2N2補(bǔ)充劑，I/2B27補(bǔ)充劑，20μΜ Υ27632的DMEM/F-12培養(yǎng)基和Neurobasal培養(yǎng)基的1:1混合物)中并且以2x 15個細(xì)胞/孔接種在用Synthemax?涂覆處理后的65mm Boyden小室(Transwe 11 ,CorningIncorporated)中，還將具有相同組成的培養(yǎng)基(Iml)加入到下部的孔，并且在37°C，5%C02進(jìn)行粘附培養(yǎng)。在自開始懸浮培養(yǎng)的第24天，S卩，在自開始粘附培養(yǎng)的第3天，加入3μΜCHIR99021，加入ΙΟμΜ SU-5402，同時加入3μΜ CHIR99021 和ΙΟμΜ SU-5402，加入InM重組人ΒΜΡ4蛋白，或加入50ng/ml重組人激活素，并繼續(xù)粘附培養(yǎng)。在不加入前述物質(zhì)的條件下進(jìn)行類似的培養(yǎng)。每3天交換培養(yǎng)基，并且在自開始懸浮培養(yǎng)的第40天在顯微鏡下觀察上皮形成的水平。
[0171]與沒有添加的對照(圖5A)相比，當(dāng)在自開始懸浮培養(yǎng)的第24天加入3μΜCHIR99021時(圖5Β)，細(xì)胞分化為較深色的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。觀察到，通過同時加入3μΜCHIR99021和ΙΟμΜ SU_5402(圖，色素上皮比通過單獨(dú)加入3μΜ CHIR99021 (圖5Β)著色更深。與不添加的對照(圖5Α)相比，當(dāng)加入InM重組人ΒΜΡ4蛋白(圖5Ε)，或加入50ng/ml重組人激活素(圖5F)時，獲得更均勻的上皮。
[0172]實(shí)施例6:使用人ES細(xì)胞制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片
[0173]將GrowthFactor Reduced Matrigel?(稀釋30倍)，或SynthemaxTM(CorningIncorporated)(稀釋40倍)以各 ΙΟΟμΙ 加入至65mm Boy den小室(Transwel I, CorningIncorporated)的孔。將上述添加有Matrige I的小室在4 °C孵育24hr，并且將上述添加有Synthemax?的小室在室溫孵育2hr，由此進(jìn)行培養(yǎng)容器材料的涂覆處理。在自開始懸浮培養(yǎng)的第21天，通過實(shí)施例4中所述方法，由團(tuán)聚體制備單細(xì)胞懸液，將懸浮的細(xì)胞以2xl05個細(xì)胞/孔接種到無血清培養(yǎng)基(200μ1)(其是添加有10%KSR，1/2N2補(bǔ)充劑，1/2B27補(bǔ)充劑，20μM Υ27632的DMEM/F-12培養(yǎng)基和Neurobasal培養(yǎng)基的1:1混合物)中，還將具有相同組成的培養(yǎng)基(Iml)加入到下部的孔中，并且在37°C，5%⑶2進(jìn)行粘附培養(yǎng)。在自接種到Boyden小室的第5天觀察細(xì)胞的粘附和上皮形成。
[0174]在涂覆有Synthemax?的培養(yǎng)容器材料(圖6B)中，培養(yǎng)的來源于團(tuán)聚體的細(xì)胞以與在涂覆有Matrigel(其是基底膜制劑)的培養(yǎng)容器材料(圖6A)中相同的方式粘附，并且觀察到其中細(xì)胞彼此緊密粘附的視網(wǎng)膜色素上皮樣形式。
[0175]實(shí)施例7:使用誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的制備實(shí)施例
[0176]根據(jù)uUeno, M.等人 PNAS 2006 ,103(25)，9554-9559” 和 uWatanabe, K.等人 NatB1tech 2007，25，68 1-686”中所述的方法培養(yǎng)人iPS細(xì)胞系20 IB7 (可從RIKENB1Resource center或iPS Academia Japan Inc.獲得)。作為培養(yǎng)基，使用通過將20%KSR(Knockout? Serum Replacement ； Invitrogen) ,0.1mM 2-疏基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，Ix非必需氨基酸，5ng/ml bFGF加入至DMEM/F12培養(yǎng)基(Sigma)獲得的培養(yǎng)基。使用TrypLEExpress(Invitrogen)將培養(yǎng)的iPS細(xì)胞分散為單細(xì)胞，以非細(xì)胞粘附96孔培養(yǎng)板(sumilon球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，Ltd.)的每個孔1.2 X 14個細(xì)胞懸浮在ΙΟΟμΙ的無血清培養(yǎng)基中，以允許快速形成團(tuán)聚體并在37 °C,5% CO2進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。作為用于此的無血清培養(yǎng)基，使用通過將10%KSR，450yM 1-—硫代甘油，Ix化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物，20μΜY27632加入至F-12培養(yǎng)基和MDM培養(yǎng)基的1:1混合物獲得的無血清培養(yǎng)基。在自開始懸浮培養(yǎng)的第3天，以1.5nM的終濃度加入BMP4，并繼續(xù)懸浮培養(yǎng)。每3天將孔中一半量的培養(yǎng)基與沒有補(bǔ)充任何作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的上述培養(yǎng)基交換。在自開始懸浮培養(yǎng)的第18天，將團(tuán)聚體轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基(其是含有3μΜ CHIR99021并添加有Ix Ν2補(bǔ)充劑的DMEM/F-12培養(yǎng)基)并培養(yǎng)直到自開始懸浮培養(yǎng)的第21天。在自開始懸浮培養(yǎng)的第21天，通過用微量移液器注入和噴出溶液來使團(tuán)聚體瓦解，并將得到的細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基(其是含有3μΜ CHIR99021(作用于Wnt信號途徑的物質(zhì))并添加有Ix Ν2補(bǔ)充劑的DMEM/F-12培養(yǎng)基)中在37°C，5%C02進(jìn)行粘附培養(yǎng)。在自開始懸浮培養(yǎng)的第27天，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形式并且通過細(xì)胞染色方法確認(rèn)視網(wǎng)膜色素上皮標(biāo)志基因(Mitf，ZO-1)的表達(dá)。
[0177]以此方式，由人iPS細(xì)胞制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。
[0178]實(shí)施例8:使用誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片的制備實(shí)施例
[0179]根據(jù)“Ueno，M.等人PNAS 2006，103 (25 )，9554-9559” 和 “Watanabe，K.等人NatB1tech 2007，25，68 1-686”中所述的方法培養(yǎng)人iPS細(xì)胞系20 IB7 (可從RIKENB1Resource center或iPS Academia Japan Inc.獲得)。作為培養(yǎng)基，使用通過將20%KSR(Knockout? Serum Replacement ； Invitrogen) ,0.1mM 2-疏基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，Ix非必需氨基酸，5ng/ml bFGF加入至DMEM/F12培養(yǎng)基(Sigma)獲得的培養(yǎng)基。使用TrypLEExpress(Invitrogen)將培養(yǎng)的iPS細(xì)胞分散為單細(xì)胞，以非細(xì)胞粘附96孔培養(yǎng)板(sumilon球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，Ltd.)的每個孔1.2 X 14個細(xì)胞懸浮在ΙΟΟμΙ的無血清培養(yǎng)基中，以允許快速形成團(tuán)聚體，并且在37°C，5%C02進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。作為用于此的無血清培養(yǎng)基，使用通過將10%KSR，450yM 1-—硫代甘油，Ix化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物，20μΜΥ27632加入至F-12培養(yǎng)基和MDM培養(yǎng)基的1:1混合物獲得的無血清培養(yǎng)基。在自開始懸浮培養(yǎng)的第3天，以1.5ηΜ的終濃度加入ΒΜΡ4并繼續(xù)懸浮培養(yǎng)。每3天將孔中一半量的培養(yǎng)基與沒有補(bǔ)充作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的上述培養(yǎng)基交換。在自開始懸浮培養(yǎng)的第18天，將團(tuán)聚體轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基(其是含有3μΜ CHIR99021并添加有Ix Ν2補(bǔ)充劑的DMEM/F-12培養(yǎng)基)，并培養(yǎng)直到自開始懸浮培養(yǎng)的第21天。在自開始懸浮培養(yǎng)的第21天，將團(tuán)聚體在細(xì)胞分散溶液Accutase(ICT)中分散，并使用40μπι細(xì)胞濾器去除碎片。將得到的細(xì)胞懸浮在無血清培養(yǎng)基(200μ1)(其是添加有10%KSR，1/2N2補(bǔ)充劑，1/2Β27補(bǔ)充劑，20μΜ Υ27632的DMEM/F-12培養(yǎng)基和Neurobasal培養(yǎng)基的1:1混合物)中，并以2xl05個細(xì)胞/孔接種在用Synthemax?涂覆處理后的65mmBoyden小室(Transwell ,Corning Incorporated)中，還將具有相同組成的培養(yǎng)基(Iml)加入到下部的孔中，并且在37°C，5%C02進(jìn)行粘附培養(yǎng)?？梢栽谧蚤_始懸浮培養(yǎng)的第24天，即，在從開始粘附培養(yǎng)的第3天，添加3μΜ CHIR99021、ΙΟμΜ SU-5402、InM重組人ΒΜΡ4蛋白和50ng/ml重組人激活素中的任一種，或這些的組合。每3天交換培養(yǎng)基，并且在自開始懸浮培養(yǎng)的第40天在顯微鏡下觀察上皮形成水平。
[0180]以此方式，由人iPS細(xì)胞制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片。
[0181]本申請是基于在日本提交的專利申請?zhí)?013-232795(提交日期:2013年11月11日)，其內(nèi)容完整地結(jié)合于此。
[0182]工業(yè)實(shí)用性
[0183]根據(jù)本發(fā)明的制備方法，可以以高效率制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用于制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法，其包括 (1)第一步，將多能干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體， (2)第二步，將步驟(I)中形成的團(tuán)聚體在各自不含作用于Sonichedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而獲得含有視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的團(tuán)聚體，和 (3)第三步，將步驟(2)中獲得的團(tuán)聚體在各自不含作用于Sonichedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而獲得含有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的團(tuán)聚體。2.用于制備視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片的方法，其包括 (1)第一步，將多能干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的團(tuán)聚體， (2)第二步，將步驟(I)中形成的團(tuán)聚體在各自不含作用于Sonichedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而獲得含有視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的團(tuán)聚體， (3)第三步，將步驟(2)中獲得的團(tuán)聚體在各自不含作用于Sonichedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而獲得含有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的團(tuán)聚體，和 (4)第四步，將步驟(3)中獲得的團(tuán)聚體分散并且對得到的細(xì)胞進(jìn)行粘附培養(yǎng)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其中在所述步驟(4)中，所述粘附培養(yǎng)在血清代替物存在下進(jìn)行。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其中在所述步驟(4)中，所述粘附培養(yǎng)在ROCK抑制物質(zhì)存在下進(jìn)行。5.根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中在所述步驟(4)中，所述粘附培養(yǎng)在還包含一種或多種選自由以下各項(xiàng)組成的組的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行:作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)、抑制FGF信號途徑的物質(zhì)、作用于激活素信號途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)。6.根據(jù)權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中在所述步驟(4)中，所述粘附培養(yǎng)在具有用培養(yǎng)基質(zhì)處理的表面的培養(yǎng)容器材料上進(jìn)行。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其中所述培養(yǎng)基質(zhì)是合成的培養(yǎng)基質(zhì)。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其中所述培養(yǎng)基質(zhì)是層粘連蛋白。9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中所述多能干細(xì)胞是靈長類動物多能干細(xì)胞。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中所述多能干細(xì)胞是人多能干細(xì)胞。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟(I)和步驟(2)在血清代替物存在下進(jìn)行。12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述懸浮培養(yǎng)在不存在基底膜制劑的情況下進(jìn)行。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)是一種或多種選自由以下各項(xiàng)組成的組的蛋白質(zhì):BMP2、BMP4、BMP7和⑶F7。14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(2)中的所述各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)和作用于BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)而含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基還包含抑制FGF信號途徑的物質(zhì)。15.用于評價毒性或藥效的試劑，其包含通過根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法制備的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片。16.評價測試物質(zhì)的毒性或藥效的方法，其包括將通過根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法制備的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片與測試物質(zhì)接觸，并且檢查所述物質(zhì)對所述細(xì)胞或細(xì)胞片的影響。17.用于由視網(wǎng)膜組織的病癥所致的疾病的治療劑，其包含通過根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法制備的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片。18.治療由視網(wǎng)膜組織的病癥所致的疾病的方法，其包括將有效量的通過根據(jù)權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)所述的方法制備的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片移植到需要所述移植的受試者。19.通過根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法制備的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片，其用于治療由視網(wǎng)膜組織的病癥所致的疾病。
【文檔編號】C12Q1/02GK105829527SQ201480068651
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年10月2日
【發(fā)明人】中野德重, 笹井芳樹, 大曾根親文
【申請人】住友化學(xué)株式會社, 國立研究開發(fā)法人理化學(xué)研究所