一種l-叔亮氨酸的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種L?叔亮氨酸的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用，本發(fā)明提供的L?叔亮氨酸的藥物組合物中含有L?叔亮氨酸和一種從干燥的大青葉中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，L?叔亮氨酸與化合物(Ⅰ)組合物具有明顯的抗炎止咳作用，且優(yōu)于L?叔亮氨酸或化合物(Ⅰ)單獨(dú)的抗炎止咳作用，可以開發(fā)成抗炎止咳的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專利說明】
一種L-叔亮氨酸的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及L-叔亮氨酸的新用途，具體涉及L-叔亮氨酸的藥 物組合物及其在抗炎止咳中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 迄今為止，尚未見L-叔亮氨酸及其藥物組合物與抗炎止咳的相關(guān)性報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種L-叔亮氨酸的藥物組合物，該藥物組合物中含有L-叔 亮氨酸和一種天然產(chǎn)物，L-叔亮氨酸和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同抗炎止咳。
[0004] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0005] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0006]
[0007] 一種L-叔亮氨酸的藥物組合物，包括L-叔亮氨酸、如權(quán)利要求1所述的化合物（I) 和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0008] 進(jìn)一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0009] 進(jìn)一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0010]上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將干燥的大青葉粉碎，用70~ 80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正 丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇 萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收 集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正 相硅膠分離，依次用體積比為80:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組 分；（d)步驟(c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、15:1和2:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離， 用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃 縮得到純的化合物(I)。
[0011] 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用75%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0012] 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0013]進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進(jìn)行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0014] 上述化合物(I)在制備抗炎止咳的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 上述L-叔亮氨酸的藥物組合物在制備抗炎止咳的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0017]本發(fā)明提供的L-叔亮氨酸的藥物組合物中含有L-叔亮氨酸和一種從干燥的大青 葉中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，L-叔亮氨酸和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，具有抗炎止 咳作用；二者聯(lián)合作用時(shí)，抗炎止咳效果更好，可以開發(fā)成抗炎止咳的藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有 技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。
[0019] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0020]分離方法：（a)將干燥的大青葉（2kg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提取(20L X 3次），合 并提取液，濃縮至無醇味(4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯(4L X 3次)和水飽和的正 丁醇（4LX 3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟 (a)中正丁醇萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇 洗脫10個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙 醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1 (8個(gè)柱體積）、30:1 (8個(gè)柱體積）、15:1 (8個(gè)柱體積)和5:1(10個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組 分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1(8個(gè)柱體積）、15:1(10個(gè)柱體積)和2:1(5 個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵 合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (259mg，HPLC歸一化純度大于98% )。
[0021] 結(jié)構(gòu)確證:淡黃色粉末，HR-ESI-MS顯示[M+Na]+為m/z 397.1990,結(jié)合核磁特征可 得分子式為C22H3Q〇5,不飽和度為8。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)S H(ppm，CDCl3,500MHZ):H-la(1.27， m)，H-lb(1.43，m)，H-2a(1.82，m)，H-2b(1.99，m)，H-3(4.88，s)，H-6a(2.56，d，J=12.2Hz)， H-6b(2.71，d，J=12.2Hz)，H-9(2.26，m，2H)，H-12(1.83，s)，H-13(2.03，s)，H-14(0.95，s)， H-15(l · 12，s)，H-3'（5. ll，q，J = 6.6Hz)，H-4'（1.32，d，J = 6.6Hz)，H-5a'（6.32，d，J = 10.3Hz)，H-5b'（6.11，d，J = 10.3Hz)，3'-Ac0(l .98，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)Sc(ppm，CDCl3， 125MHz ):32.4(CH2,卜C)，27.6(CH2,2-C)，77.3(CH，3-C)，137.8(C，4-C)，137.3(C，5-C)， 22.3(CH2,6-C)，130.2(C，7-C)，201.1(C，8-C)，58.5(CH2,9-C)，36.7(C，10-C)，136.3(C，11- C)，22.3(CH3，12-C)，23.1(CH3，13-C)，18.4(CH3，14-C)，15.3(CH3，15-C)，167.3(C，r-C)， 137.6(C，2'-C)，65.4(CH，3'-C)，17.3(CH3,4'-C)，125.7(CH2,5'-C)，169.2(C，3'-Ac0)， 21.7(CH3,3'-Ac0)。紅外波譜中的1715CHT1與16800^1吸收帶表明結(jié)構(gòu)中存在羰基與雙鍵片 段。13C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有22個(gè)碳信號，包括六個(gè)甲基，五個(gè)亞甲基(一個(gè)烯烴碳）， 兩個(gè)連氧次甲基，以及九個(gè)季碳(三個(gè)羰基碳和五個(gè)烯烴碳）。以上功能結(jié)構(gòu)再結(jié)合不飽和 數(shù)表明該化合物為雙環(huán)結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜結(jié)合HSQC譜顯示五個(gè)甲基質(zhì)子信號δΗ 1.83(3H，s)、 2.03(3H，s)、0.95(3H，s)、H-15(1.12，s)、1.32(3H，d，J = 6.6Hz)，一個(gè)乙酰甲基質(zhì)子信號δΗ 1.98(3!1，8)，一個(gè)端烯烴質(zhì)子信號5116.32(1!1，(1，了=10.3泡）與6.11(1!1，(1，了=10.3泡），兩 個(gè)連氧次甲基質(zhì)子信號δΗ 4.88(lH，s)與5.11(1!14，1 = 6.6他）；以上~1?數(shù)據(jù)可以確認(rèn)該 化合物為闊苞菊酮衍生物。HMBC譜中H3-12與C-11、H3-13與C-11、H 3-14與C-10、H3-15與C-4 相關(guān)信號可以歸屬為闊苞菊酮上的片段，C-3位質(zhì)子信號移向低場說明C-3羥基被酯化，而 通過HMBC譜中H-3與C-Γ的相關(guān)信號得到進(jìn)一步確認(rèn)。通過HMBC譜中H-3'與3'-AcO、C-2lP C-4 '以及H2-5 '與C-2 '和C-Γ的相關(guān)信號可以確認(rèn)結(jié)構(gòu)中存在3 ' -乙?；?2 ' -烯-丁酰氧基 邊鏈結(jié)構(gòu)，而質(zhì)子信號知6.32(1=10.3抱）、6.11(1=10.3抱）以及1.32(1 = 6.6抱）可以歸 屬為H2-5'的烯基信號與H3-4'的甲基信號。該化合物的相對構(gòu)型進(jìn)一步通過X-單晶衍射確 認(rèn)，C-3位的絕對構(gòu)型通過酸解反應(yīng)與Mo sher法可以確認(rèn)為R構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜 和N0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進(jìn) 一步通過ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。該化合物化學(xué)式及碳原子編號如下：
[0022]
[0023] 買施例2:藥理作用
[0024] 1、材料與方法
[0025] 1.1藥物和試劑
[0026] L-叔亮氨酸購自中國藥品生物制品檢定所。化合物（I)自制，制備方法見實(shí)施例1。 冰醋酸，廣西南寧化學(xué)試劑廠生產(chǎn);二甲苯，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn);伊文思 蘭，上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠生產(chǎn)。阿司匹林片（l〇〇mg/片），拜爾制藥公司生產(chǎn);桂 龍咳喘寧膠囊，山西桂龍醫(yī)藥有限公司生產(chǎn);橘紅沖劑，南昌康正德制藥有限公司生產(chǎn)。
[0027] 1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0028] 昆明種小白鼠90只，體質(zhì)量（20 ± 2) g，雌雄各半;Wi star大鼠60只，體質(zhì)量（200 土 20) g，雌雄各半，均由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
[0029] 1.3器材
[0030] 1.80-2型離心機(jī)，上海手術(shù)器械廠生產(chǎn)；721型分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠 生產(chǎn);AEU-210型電子天平，日本島津生產(chǎn)。
[0031] 1.4抗炎實(shí)驗(yàn)
[0032] 1.4.1對二甲苯致小鼠耳廓腫脹度的影響
[0033] 取小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為：生理鹽水組，阿司匹林組（300mg/ kg)，L-叔亮氨酸組(80mg/kg)、化合物（I)組(80mg/kg)、L-叔亮氨酸與化合物（I)組合物組 【40mg/kgL-叔亮氨酸+40mg/kg化合物（I)】各組按相應(yīng)劑量給藥，生理鹽水組灌服等量生理 鹽水。各組均灌胃給藥，每天1次，連續(xù)5d。末次給藥lh后，各組小鼠右耳涂以二甲苯0.05ml/ 只，左耳不涂作自身空白對照。涂抹二甲苯30min后，將小鼠頸椎脫位處死，用內(nèi)徑6mm的打 孔器打下左、右雙耳相同部位的圓片，分別稱質(zhì)量，以右耳質(zhì)量與左耳質(zhì)量差為腫脹度，比 較各組的腫脹度。
[0034] 1.4.2對醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加的作用
[0035] 取小鼠50只，分組及給藥同1.4.1。各組給予藥物每天1次，連續(xù)3d。末次給藥lh后， 小鼠尾靜脈注射0.5%伊文思蘭的生理鹽水0.1ml/10g后，立即于小鼠腹腔注射0.6%醋酸 0.2ml/只，20min后，斷頭放血處死小鼠，用5ml生理鹽水沖洗腹腔3次，收集洗滌液，離心 (1000rpm)5min，在721型分光光度計(jì)590nm處測定吸收度(0D值）。
[0036] 1.5止咳實(shí)驗(yàn)
[0037] 1.5.1對S02致咳小鼠的影響
[0038] 取小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，即生理鹽水組、L-叔亮氨酸組(80mg/kg)、化 合物（I)組(80mg/kg)、L-叔亮氨酸與化合物（I)組合物組【40mg/kgL-叔亮氨酸+40mg/kg化 合物（I)】、桂龍咳喘寧組(5g/kg)。各組按相應(yīng)劑量給藥，生理鹽水組灌服等量生理鹽水，每 天1次，共7d。末次給藥后lh，將小鼠放入500ml的廣口瓶中，通入S026ml引咳，以小鼠出現(xiàn)明 顯的張口喘息為咳嗽指標(biāo)，觀察并記錄小鼠放入瓶中到咳嗽發(fā)生的潛伏期和3min內(nèi)咳嗽次 數(shù)。
[0039] 1.5.2對大鼠排痰量的影響
[0040] 取Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，即生理鹽水組、L-叔亮氨酸組(80mg/ kg)、化合物（I)組（80mg/kg)、L-叔亮氨酸與化合物（I)組合物組【40mg/kgL-叔亮氨酸+ 40mg/kg化合物（I)】、橘紅沖劑組(5g/kg)。各組按相應(yīng)劑量給藥，生理鹽水組灌服等量生理 鹽水，每天1次，共7d。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12h，末次給藥30min后，用戊巴比妥鈉30mg/kg麻 醉，仰臥位固定，剪開頸正中皮膚，分離氣管，在甲狀軟骨下緣正中兩軟骨環(huán)之中，用注射針 頭扎一小孔，然后插入直徑0.5ml的已知質(zhì)量(G1)的毛細(xì)管一根，長10cm。使毛細(xì)玻管剛好 接觸氣管部表面，以吸取氣管中的痰液，若一支玻管吸滿，馬上換一支玻管，收集大鼠60min 的排痰量，然后用電子稱稱量收集有痰液的玻管的重量(G2)，G2_G1即為大鼠60min的排痰 量，計(jì)算60min/100g的引流mg數(shù)作為祛痰指標(biāo)。
[0041] 1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0042] 應(yīng)用SPSS11.5軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P 〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0043] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0044] 2.1對二甲苯致小鼠耳廓腫脹及對醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管滲透性增加的作用的 影響
[0045] 與生理鹽水組比較，L-叔亮氨酸與化合物（I)組合物組和阿司匹林組的腫脹度和 0D值均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01)，L_叔亮氨酸組、化合物（I)組也可顯著降低 腫脹度和0D值(P〈0.05)，說明L-叔亮氨酸與化合物（I)組合物的消炎作用較明顯，且能顯著 降低0D值，較明顯抑制醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管滲透性增加。試驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0046] 表1抗炎試驗(yàn)結(jié)果(X土s，n = 10)
[0047]

[0048] 2.3對小鼠 S02致咳的止咳作用
[0049] 與生理鹽水組比較，L-叔亮氨酸與化合物（I)組合物組和桂龍咳喘寧組均能減少 小鼠 S02致咳的咳嗽次數(shù)，延長咳嗽潛伏期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01)，L_叔亮氨酸組、化 合物(I)組也能減少咳嗽次數(shù)，延長咳嗽潛伏期(P〈〇.05)。試驗(yàn)結(jié)果見表2。
[0050] 表2對小鼠 S〇2致咳的止咳作用(X土s，n=10)
[0051 ]_
[0052] 2.4對大鼠排痰量的影響
[0053] L-叔亮氨酸組、化合物（I)組和橘紅沖劑組60min/100g引流的mg數(shù)為3.21 ±0.57、 3.25±0.37和3.28±0.42均高于生理鹽水組（2.24±0.43)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(？〈0.05)， L-叔亮氨酸與化合物（I)組合物組為3.54±0.68，顯著高于生理鹽水組(P〈0.01)。
[0054]綜上所述，本發(fā)明提供的L-叔亮氨酸與化合物（I)組合物具有明顯的抗炎止咳作 用，且優(yōu)于L-叔亮氨酸或化合物（I)單獨(dú)的抗炎止咳作用。
[0055]上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，02. -種心叔亮氨酸的藥物組合物，其特征在于:包括レ叔亮氨酸、如權(quán)利要求1所述的 化合物(I)和藥學(xué)上可W接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的心叔亮氨酸的藥物組合物，其特征在于:藥學(xué)上可W接受的載 體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載 體或潤滑劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的心叔亮氨酸的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、 膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射 劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含W下操作步驟：（a)將干 燥的大青葉粉碎，用70~80 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、 乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取 物；（b)步驟(a)中正下醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70% 乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中 70 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲燒- 甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(C)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為 25:1、15:1和2:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基 硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱 體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用75%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲燒代 替乙酸乙醋進(jìn)行萃取，得到二氯甲燒萃取物。9. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備抗炎止咳的藥物中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求2~4任一所述的k叔亮氨酸的藥物組合物在制備抗炎止咳的藥物中的應(yīng) 用。
【文檔編號】C07C67/56GK105837449SQ201610240850
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月18日
【發(fā)明人】潘立, 李義高, 李小彪, 趙陽
【申請人】鎮(zhèn)江高海生物藥業(yè)有限公司