Peg介導(dǎo)蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供PEG介導(dǎo)蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化以及遺傳轉(zhuǎn)化子的篩選等步驟。本發(fā)明成功實現(xiàn)了PEG介導(dǎo)蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化，首次構(gòu)建了一套針對該病原菌的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得大量能夠多代穩(wěn)定遺傳的遺傳轉(zhuǎn)化子。該方法操作簡單、轉(zhuǎn)化周期短、可重復(fù)性強、轉(zhuǎn)化效率高、穩(wěn)定性好。本發(fā)明提供的方法是推動蘆筍莖枯病病害分子生物學(xué)研究的重要技術(shù)創(chuàng)新，為該病害致病機制及抗病研究提供了一種重要手段。
【專利說明】
PEG介導(dǎo)蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種PEG介導(dǎo)蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體的 遺傳轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘆輿(Asparagus officinalis L.)為天門冬科天門冬屬多年生草本植物，以嫩莖 供食，具有極高的營養(yǎng)和保健價值，富含天冬酰胺、皂苷、黃酮、硒和植物多糖等多種活性成 分，能抗腫瘤、抗氧化和降血脂，被譽為"蔬菜之王"、"世界十大名菜"之一（Jaiswal et al.，2014;Nishimura et al.，2013)。同時，蘆筍加工產(chǎn)業(yè)鏈長，可生產(chǎn)出蘆筍抗癌藥、蘆筍 茶、酒和飲料等高附加值產(chǎn)品，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用開發(fā)前景廣闊。目前，我國蘆筍種植 及加工發(fā)展迅速，已成為世界第一大生產(chǎn)和出口國，種植面積超過95000公頃，約占全球的 43%。病害是蘆筍生產(chǎn)的重要制約因子，主要包括蘆筍莖枯病、褐斑病和根腐病等，其中莖 枯病危害最為嚴(yán)重，極易造成毀滅性影響。該病害在全球蘆筍產(chǎn)區(qū)廣泛存在;美國、希臘和 澳大利亞等國均有報道，中國、日本和泰國等亞洲主產(chǎn)區(qū)因濕熱氣候和舶來品種生態(tài)適應(yīng) 性差導(dǎo)致病害發(fā)生十分嚴(yán)重;近年來，我國平均發(fā)病率居高不下，一般導(dǎo)致減產(chǎn)30%以上， 嚴(yán)重時甚至引起成片絕收（陳光宇，2013;陳光宇，2010;Lu et al.，2008)。目前，生產(chǎn)上缺 乏高抗莖枯病的蘆筍栽培品種，主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥或溫室設(shè)施避雨栽培技術(shù)防控，不僅 提高了生產(chǎn)成本，同時極易造成產(chǎn)品和環(huán)境的污染，加劇土壤質(zhì)量嚴(yán)重退化。因此，莖枯病 危害已成為制約我國蘆筍生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的突出問題。迄今為止，國內(nèi)外對其病原分子生 物學(xué)研究較少，尤其缺乏病菌分子遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系的相關(guān)報道。為此，深入開展蘆筍莖枯 病菌分子致病機理研究具有重要的現(xiàn)實意義。
[0003]天門冬擬莖點霉(Phmopsis asparagi)是引起蘆輿莖枯病的病原真菌。目前，有關(guān) 其致病接種方法、病害分級指標(biāo)和病情評價體系已相對成熟(Takahiro, 1997)。前期研究表 明，天門冬擬莖點霉為半活體營養(yǎng)寄生型(Hemibiotrophs)絲狀病原真菌，病菌無性分生孢 子呈α(5 · 0-12 · 5 X 1 · 8-3 · 8μπι)、β( 17 · 5-26 · 0 X 1 · 0-2 · Ομπι)和中間型（12 ·0-17 · 0 X 2 · 5-4 · 5 μπ〇，α型占絕對優(yōu)勢，通常內(nèi)含1-2個油球，主要危害嫩莖，也可侵染枝梗和擬葉，分生孢子 接種后5-7d可獲得明顯病斑，病斑初呈水漬條狀、后漸變成暗黑色梭條形，中部赤褐色凹 陷，其上散生大量小黑點，為分生孢子器，隨后病株枯死并迅速傳染相鄰植株，病菌以分生 孢子(器)或菌絲體越冬，適宜條件下進行初侵染和再侵染(Zhang et al.，2012;張岳平等， 2012;Udayanga et al.，2011;陳光宇，2010;陳光宇，2005)。此外，蘆筍莖枯病菌所屬的天 門冬擬莖點霉屬(Phomopsis)真菌，該屬是腔孢綱球殼孢科真菌中的一個大屬，含有100多 個不同的種，可寄生于70多種不同科的植物。該屬病原菌地域分布廣泛，引起植物的葉枯、 枝枯、爛莖、潰瘍及果腐等嚴(yán)重病害，造成重大經(jīng)濟損失。目前，一些主要作物的擬莖點霉屬 真菌病害在發(fā)生特點、致病癥狀及特性、生活周期循環(huán)、病害生化防控及病菌生物學(xué)特性方 面等取得了一定的研究進展。然而，有關(guān)該屬病原菌與寄主的生物學(xué)互作、致病相關(guān)基因鑒 定及致病機制探討等方面研究仍比較薄弱，今后應(yīng)加強分子生物學(xué)方面的研究，以明確其 致病機制，鑒定該屬的致病特異性，并構(gòu)建抗病分子育種技術(shù)體系等。為病害安全、高效防 控提供基因基礎(chǔ)(張岳平等，一些重要作物擬莖點霉屬病原生物學(xué)及致病機制研究概況，中 國農(nóng)學(xué)通報，2013,29(33) :327-332)。蘆筍莖枯病菌作為擬莖點霉屬中重要成員，具備該屬 病原真菌的重要生物學(xué)特性，包括通過分生孢子器產(chǎn)孢、分生孢子內(nèi)含1-2個油球、菌絲細(xì) 胞壁成分相對復(fù)雜（Zhang Yueping et al . , Stress physiology and virulence characterization of Phomopsis asparagi(Sacc.)Bubak isolated from asparagus in Jiangxi province,China,Agricultural science&technology,2012,13(7):1502-1508)〇
[0004] 至今國內(nèi)外鮮有對蘆筍莖枯病菌的致病機理的報道，這也限制了對蘆筍莖枯病菌 侵染和致病機制的深入認(rèn)識。蘆筍莖枯病菌的遺傳轉(zhuǎn)化是研究其生長發(fā)育與致病過程分子 機制的基本工具，目前國內(nèi)外未見遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在蘆筍莖枯病菌研究中得到應(yīng)用。ATMT技 術(shù)(根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法)雖然操作簡便，但轉(zhuǎn)化周期相對較長，工作量大，適用 于突變體庫的構(gòu)建，對于針對目的基因的敲除等反向遺傳學(xué)研究具有明顯的缺陷；電穿孔 轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率低，目前極少在真菌轉(zhuǎn)化中應(yīng)用;CaCl2/PEG是目前較為傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法， 其操作步驟簡便有效，可用于目的基因敲除和替換，已成為獲得轉(zhuǎn)化子的最普遍的轉(zhuǎn)化技 術(shù)。尤其是在蘆筍莖枯病菌全基因組已經(jīng)測序的基礎(chǔ)上，亟需有一個成熟、高效的可應(yīng)用于 通過目標(biāo)基因敲除開展功能基因組研究的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種高效、穩(wěn)定的PEG介導(dǎo)蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn) 化方法。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的PEG介導(dǎo)蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化 方法，包括蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化以及遺傳轉(zhuǎn)化子的篩選等 步驟。
[0007] 原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化方法如下：向離心管中加入0.5yg/yL質(zhì)粒DNA 10-20yL、0.6M KC1與50mM CaCl2混合緩沖液25-30yL、亞精胺2-3yL，然后加入濃度為107-108個/mL的蘆筍 莖枯病菌原生質(zhì)體懸液50-100yL，混勻后置于冰上靜置10-15min;然后加入新鮮配制的PTC 緩沖液50-100yL，混勻后置于冰上靜置20-25min;然后再加入PTC混合溶液250-350yL，混勻 后置于冰上靜置l〇-15min;然后加入0.6M KC1與50mM CaCl2混合緩沖液600-800yL終止轉(zhuǎn) 化反應(yīng)，所得轉(zhuǎn)化體系用于后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化子的篩選。
[0008] 優(yōu)選地，原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化方法如下：向離心管中加入〇.5yg/yL質(zhì)粒pBHt2- sGFP的DNA 20yL、0.6M KC1與50mM CaCl2混合緩沖液27.5yL、亞精胺2.5yL，然后加入濃度 為107-108個/mL的蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體懸液50yL，混勻后置于冰上靜置10min;然后加入 新鮮配制的PTC緩沖液50yL，混勻后置于冰上靜置20min;然后再加入PTC混合溶液250yL，混 勻后置于冰上靜置l〇min;然后加入0.6M KC1與50mM CaCl2混合緩沖液700yL終止轉(zhuǎn)化反 應(yīng)，所得轉(zhuǎn)化體系用于后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化子的篩選。
[0009] 其中，所述PTC緩沖液的配制如下：用水配制含有以下各組分的溶液：20-30% PEG3350、pH7.5 8-12mM Tris-HCl、40-60mM CaCl2,55°C水浴中各組分溶解后，用0·22μπι細(xì) 菌過濾器過濾除菌。優(yōu)選地，用水配制含有以下各組分的溶液：25 %PEG3350、pH7.5 1 OmM Tris-HCl、50mM CaCl2。
[0010] 本發(fā)明中使用的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBHt2_sGFP，見Mullins，E ·D·，Chen，X·，Romaine，P·， Raina,R.,Geiser,D.M.,Kang,S.,2001.Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum:an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer.Phytopathology 91，173-180。
[0011] 前述的方法，轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，向所得轉(zhuǎn)化體系中加入10_15mL改良的Bottom agar固體培養(yǎng)基，混勻后倒入培養(yǎng)皿中，25°C暗培養(yǎng)15-24h;再向培養(yǎng)皿中加入10-15mL改 良的Top agar固體培養(yǎng)基，25°C暗培養(yǎng)5-10d，挑出遺傳轉(zhuǎn)化子，將單菌落轉(zhuǎn)移至含有50- 100yg/mL潮霉素 B的TOA平板培養(yǎng)基中，3d后將生長的菌落再次接種至含有50-100yg/mL潮 霉素 B的PDA平板培養(yǎng)基上，連續(xù)培養(yǎng)3-5代得到純化的蘆筍莖枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化子。
[0012]優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，向所得轉(zhuǎn)化體系中加入lOmL改良的Bottom agar固體培 養(yǎng)基，混勻后倒入培養(yǎng)皿中，25 °C暗培養(yǎng)15-24h;再向培養(yǎng)皿中加入15mL改良的Top agar固 體培養(yǎng)基，25°C暗培養(yǎng)5-10d，挑出遺傳轉(zhuǎn)化子，將單菌落轉(zhuǎn)移至含有50yg/mL潮霉素 B的PDA 平板培養(yǎng)基中，3d后將生長的菌落再次接種至含有50yg/mL潮霉素 B的TOA平板培養(yǎng)基上，連 續(xù)培養(yǎng)3-5代(優(yōu)選5代)得到純化的蘆筍莖枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化子。
[0013] 篩選出性狀穩(wěn)定，即菌絲和分生孢子發(fā)出較強的綠色熒光，且生長發(fā)育沒有發(fā)生 變化，作為候選的經(jīng)PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化的蘆筍莖枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化子。將得到的遺傳 轉(zhuǎn)化子保存在含有潮霉素 B的PDA平板培養(yǎng)基上，置于4°C低溫保存，用于陽性鑒定。
[0014] 所述改良的Bottom agar固體培養(yǎng)基的配制如下：用水配制含有以下各組分的溶 液:0 · 6M蔗糖、5mM HEPES、lmM(NH4)2HP〇4、0 · 2mM生物素、ImM維生素 B1，pH5 · 3，瓊脂粉0 · 6 % ; 121°C高壓蒸汽滅菌30min，冷卻后加入潮霉素 B使其終濃度為50μg/ml。
[0015] 所述改良的Top agar固體培養(yǎng)基的配制如下：用水配制含有以下各組分的溶液： 0·6M蔗糖、5mMHEPES、lmM(NH4)2HP04、0·2mM生物素、lmM維生素 Bl，pH5·3，瓊脂粉l%;12ΓC 高壓蒸汽滅菌30min，冷卻后加入潮霉素 B使其終濃度為lOOμg/ml。
[0016] 可參照張岳平等，蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體的制備及再生.植物保護學(xué)報，2014,41 (2): 182-186中公開的方法制備純化的蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體。
[0017] 具體地，本發(fā)明蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體的制備方法如下：
[0018] (1)蘆筍莖枯病菌新鮮菌絲的獲得
[0019] al)將蘆輿莖枯病菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培養(yǎng) 基上，活化培養(yǎng)5d;
[0020] a2)將活化培養(yǎng)的蘆筍莖枯病菌打取菌餅接種于燕麥瓊脂糖(Oatmeal Agar，0A) 培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)14d，至分生孢子器中乳白色分生孢子溢出，用于制備分生孢子懸浮液；
[0021] a3)挑取適量分生孢子器中分泌出的乳白色分生孢子，溶于無菌水中，使分生孢子 濃度達1.0 X 1〇8個/mL;將制備好的分生孢子懸液接種于液體完全培養(yǎng)基中，25°C 150rpm搖 床培養(yǎng)72h，漏斗過濾，獲得新鮮菌絲體。
[0022] (2)蘆筍莖枯病菌新鮮菌絲的酶解與原生質(zhì)體的獲得
[0023] bl)酶解菌絲細(xì)胞壁:取1.0g新鮮菌絲體，加入10mL裂解酶、崩潰酶和蝸牛酶的混 合酶液，33 °C水浴酶解4.5h，使原生質(zhì)體數(shù)量達107-108個/mL;
[0024] b2)制備原生質(zhì)體懸液：過濾酶解溶液，濾去未被酶解的菌絲殘片，濾液于4°C 5000rpm離心5min;棄上清液，用l-2mL濃度1.0mol/L的山梨醇溶液洗2-3次，收集原生質(zhì)體 重懸于lmL濃度1. Omol/L預(yù)冷的山梨醇溶液中，即得原生質(zhì)體懸液。
[0025] 所述混合酶液的配制如下：向1.Omol/L MgS04溶液(作為滲透壓穩(wěn)定劑）中加入裂 解酶、崩潰酶和蝸牛酶，使其終濃度為裂解酶15g/L、崩潰酶10g/L、蝸牛酶15g/L;配好后用 直徑為0 · 45μπι的超微微孔濾膜過濾除菌。其中，1 · Omo 1 /L MgS〇4溶液是以1 Ommo 1 /L pH6 · 98 的PBS為溶劑配制。
[0026]前述的方法，還包括對蘆筍莖枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化子進行PCR檢測的步驟。根據(jù)轉(zhuǎn)入到 蘆筍莖枯病菌基因組中的外源質(zhì)粒中的潮霉素抗性基因序列設(shè)計引物驗證陽性遺傳轉(zhuǎn)化 子，以CTAB法快速提取轉(zhuǎn)化子DNA作為模板進行PCR擴增，再用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增 片段的大小。熒光顯微鏡觀察:取經(jīng)PCR檢測驗證過的陽性遺傳轉(zhuǎn)化子的菌絲和分生孢子分 別制成臨時玻片，用萊卡DM2000熒光顯微鏡觀察，篩選強表達綠色熒光的遺傳轉(zhuǎn)化子。 [0027]其中，PCR檢測使用的引物序列如下：
[0028] Hph/Fl:5，-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3，
[0029] Hph/Rl:5，-AAGCCTGAACTCACCGCGAC-3，
[0030] PCR反應(yīng)體系為：10X反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)5yL，2· 5U/yL dNTPslyL，50μΜ引物Hph/ Fl、Hph/Rl各2.5yL，DNA模板lyL，5U/yL TaqDNA聚合酶lyL，ddH20 37yL。
[0031] PCR 反應(yīng)程序為：95°C 預(yù)變性 3min;94°C 變性 3〇8、55°(：退火3〇8、72°(：復(fù)性11^11，35 個循環(huán);72°C延伸10min，16°C保溫30min。
[0032] 本發(fā)明進一步提供用于PEG介導(dǎo)的蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化的試劑，所述 試劑的組成如下：20-30%PEG3350、pH7.5 8-12mMTris-HCl、40-60mM CaCl2,以水配制。優(yōu) 選地，所述試劑的組成如下：25%PEG3350、pH7.5 10mMTris-HCl、50mMCaCl2，以水配制。
[0033] 利用本方法成功轉(zhuǎn)化了不同地域來源的蘆筍莖枯病菌菌株，而且經(jīng)多次重復(fù)實驗 具有相似的轉(zhuǎn)化效率，為基于已全基因組測序的蘆筍莖枯病菌的功能基因組學(xué)研究提供了 高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。針對于該領(lǐng)域目前的技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0034](一)本發(fā)明首次提供PEG介導(dǎo)蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，為今后病 害發(fā)生機制的后續(xù)深入研究和關(guān)鍵功能基因的鑒定提供了重要方法基礎(chǔ)，是推動該病害分 子生物學(xué)研究的重要技術(shù)革新，為該病害致病機制及抗病研究提供了重要的技術(shù)手段。 [0035](二)本發(fā)明提供的遺傳轉(zhuǎn)化操作簡便，條件溫和，轉(zhuǎn)化效率高（可達40-50個遺傳 轉(zhuǎn)化子/yg DNA)，遺傳穩(wěn)定(連續(xù)培養(yǎng)5代仍可穩(wěn)定遺傳）。
[0036](三)轉(zhuǎn)化周期短、重復(fù)性好:采用本發(fā)明描述的方法獲得蘆筍莖枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化 子的周期短，從制備好的分生孢子到轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定僅需約10d。采用不同地 域的蘆筍莖枯病菌菌株均可獲得穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化子。
【附圖說明】
[0037] 圖1為本發(fā)明實施例1中野生型蘆筍莖枯病菌菌株在0A培養(yǎng)基中對潮霉素 B的敏感 性檢測。其中：A圖潮霉素 B濃度為0yg/mL; B圖潮霉素 B濃度為10yg/mL; C圖潮霉素 B濃度為20 yg/mL; D圖潮霉素 B濃度為50yg/mL; E圖潮霉素 B濃度為100yg/mL; F圖潮霉素 B濃度為150yg/ mL〇
[0038] 圖2為本發(fā)明實施例2中蘆筍莖枯病菌在0A培養(yǎng)基上產(chǎn)生的分生孢子器及分生孢 子。其中：A圖中黑點為成熟的分生孢子器，黑點上乳白色液體為其分泌出的分生孢子液;B 圖為分生孢子器的縱切面結(jié)構(gòu)分析;C圖為α型分生孢子;D圖為α型分生孢子的掃描電鏡分 析。
[0039]圖3為本發(fā)明實施例2中新鮮的蘆筍莖枯病菌菌絲。
[0040] 圖4為本發(fā)明實施例3中蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)顯微鏡下效果圖。
[0041] 圖5為本發(fā)明實施例4中蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體經(jīng)PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化后在Top agar培養(yǎng)基上的生長情況。
[0042]圖6為本發(fā)明實施例5中蘆筍莖枯病菌經(jīng)PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化后部分遺傳轉(zhuǎn)化子菌 落形態(tài)(PDA培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)5d)。其中:W為未轉(zhuǎn)化的野生型菌株，其余均為遺傳轉(zhuǎn)化子;其 中，野生型菌株生長在不含潮霉素 B的TOA平板培養(yǎng)基上，遺傳轉(zhuǎn)化子生在含潮霉素 B50yg/ mL的PDA平板培養(yǎng)基上。
[0043] 圖7為本發(fā)明實施例6中隨機挑選蘆筍莖枯病菌轉(zhuǎn)化子潮霉素 B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (hph)的PCR擴增電泳圖譜。其中：泳道M: DL2000DNA Maker;泳道P:質(zhì)粒pBHt2-sGFP;泳道 H20:無菌水對照;泳道W:未轉(zhuǎn)化的野生型菌株;泳道1-6:蘆筍莖枯病菌的遺傳轉(zhuǎn)化子。
【具體實施方式】
[0044] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0045] 以下實施例中涉及菌株和載體的來源:蘆筍莖枯病菌野生型菌株采自江西省農(nóng)業(yè) 科學(xué)院蘆筍試驗場蘆筍病莖，采用單孢分離的方法，經(jīng)真菌通用引物ITS5(5'_ GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3'）和ITS4(5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進行PCR鑒定后保存，作 為實驗用野生型菌株。pBHt2-sGFP載體(含TrpC啟動子，潮霉素 B抗性）由中國科學(xué)院微生物 研究所向春梅老師惠贈。
[0046] 實施例1蘆筍莖枯病菌野生型菌株對潮霉素 B敏感性檢測
[0047] 1、配制含不同濃度潮霉素 B的0A培養(yǎng)基，設(shè)置成為6種不同濃度，分別為0yg/mL、10 yg/mL、20yg/mL、50yg/mL、100yg/mL和150yg/mL。
[0048] 2、均勻打取野生型蘆筍莖枯病菌菌株菌餅，分別接種于不同潮霉素 B濃度的0A培 養(yǎng)基中，生長7d后拍照，用于分析其對潮霉素 B的敏感性(圖1)。
[0049] 實施例2蘆筍莖枯病菌新鮮菌絲的獲得
[0050] 1、將蘆輿莖枯病菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，Η)Α)培養(yǎng) 基上，活化培養(yǎng)5d。
[00511 2、將活化培養(yǎng)的蘆筍莖枯病菌打取菌餅接種于燕麥瓊脂糖(Oatmeal Agar，0A)培 養(yǎng)基上，25°C恒溫培養(yǎng)14d，至分生孢子器中乳白色分生孢子溢出（圖2)，用于制備分生孢子 懸浮液。
[0052] 3、用牙簽提取適量分生孢子器中分泌出的乳白色分生孢子，溶于無菌純水中，調(diào) 節(jié)分生孢子濃度達1.0 X 1〇8個/mL;將制備好的分生孢子懸液接種于液體完全培養(yǎng)基中，25 °C 150rpm搖床培養(yǎng)72h，漏斗過濾，獲得新鮮菌絲體(圖3)。
[0053]實施例3蘆筍莖枯病菌新鮮菌絲的酶解與原生質(zhì)體的獲得
[0054] 1、酶解菌絲細(xì)胞壁:取1.0g新鮮菌絲體，加入10mL裂解酶、崩潰酶和蝸牛酶的混合 酶液，33°C水浴酶解4.5h，使原生質(zhì)體數(shù)量達2.8 X 107個/mL;所述混合酶液由下列重量配 比的物質(zhì)組成：裂解酶15g/L、崩潰酶1 Og/L、蝸牛酶15g/L、溶劑為1. Omo 1/L MgS〇4溶液 (10mmol/L pH6.98的PBS配制，體積比為MgS〇4: PBS = 3:1)，配好后用直徑為0.45μπι的超微 微孔濾膜過濾除菌。
[0055] 所述混合酶液的配制如下：向1 .Omol/L MgS04溶液中加入裂解酶、崩潰酶和蝸牛 酶，使其終濃度為裂解酶15g/L、崩潰酶10g/L、蝸牛酶15g/L;配好后用直徑為0.45μπι的超微 微孔濾膜過濾除菌。其中，1 .Omol/L MgS〇4溶液是以10mmol/L ρΗ6.98的PBS為溶劑配制。
[0056] 2、制備原生質(zhì)體懸液:過濾酶解溶液，濾去未被酶解的菌絲殘片，濾液于4°C、轉(zhuǎn)速 5000rpm離心分離5min;棄上清液，用l-2mL濃度1. Omol/L的山梨醇溶液洗滌2-3次，收集原 生質(zhì)體重懸于lmL濃度1.Omol/L預(yù)冷的山梨醇溶液中保存，得到原生質(zhì)體懸液(圖4)。
[0057]實施例4PEG介導(dǎo)的蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化
[0058] 1、取一支15mL的滅菌的離心管，分別加入20yL質(zhì)粒DNA(含質(zhì)粒10yg)、27.5yL 0.6M KC1與50mM CaCl2混合緩沖液、2.5yL亞精胺。
[0059] 2、加入50yL實施例3制備的蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體懸液，輕柔混勻后置于冰上靜 置10min;然后加入新鮮配制的50yL PTC緩沖液，輕柔混勻后置于冰上靜置20min;然后再次 加入250yL PTC緩沖液，輕柔混勻后置于冰上靜置10min。
[0060]其中，所述PTC緩沖液的配制如下：用水配制含有以下各組分的溶液：25 % PEG3350、pH7.5 10mM Tris-HCl、50mM CaCl2,55°C水浴中各組分溶解后，用0.22μπι細(xì)菌過 濾器過濾除菌。
[0061 ] 3、加入700yL 0.6Μ KC1與50mM CaCl2混合緩沖液用于終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
[0062] 4、向上述轉(zhuǎn)化體系中倒入10mL改良的Bottom agar固體培養(yǎng)基，混勾后倒入培養(yǎng) 皿中，25°C暗培養(yǎng)15-24h。
[0063] 5、向培養(yǎng)皿中倒入15mL改良的Top agar固體培養(yǎng)基，25 °C暗培養(yǎng)5-10d，挑出遺傳 轉(zhuǎn)化子(圖5)。
[0064] 其中，改良的Bottom agar固體培養(yǎng)基的配制如下：用水配制含有以下各組分的溶 液:0 · 6M蔗糖、5mM HEPES、lmM(NH4)2HP〇4、0 · 2mM生物素、ImM維生素 B1，pH5 · 3，瓊脂粉0 · 6 % ; 121°C高壓蒸汽滅菌30min，冷卻后加入潮霉素 B使其終濃度為50μg/ml。
[0065] 改良的Top agar固體培養(yǎng)基的配制如下：用水配制含有以下各組分的溶液:0.6M 蔗糖、5mM HEPES、lmM(NH4)2HP〇4、0.2mM生物素、ImM維生素 Bl，pH5.3,瓊脂粉1%;121°C高壓 蒸汽滅菌30min，冷卻后加入潮霉素 B使其終濃度為lOOμg/ml。
[0066] 實施例5遺傳轉(zhuǎn)化子的篩選與保存
[0067] 1、遺傳轉(zhuǎn)化子的篩選:將長出的蘆筍莖枯病菌單個菌落用牙簽挑取轉(zhuǎn)移至含有50 yg/mL潮霉素 B的PDA平板培養(yǎng)基中，3d后將生長的菌落再次接種至含有50yg/mL潮霉素 B的 PDA平板培養(yǎng)基上，連續(xù)培養(yǎng)5代得到純凈的蘆筍莖枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化子。
[0068] 2、遺傳轉(zhuǎn)化子的保存:分別將挑取獲得的各個不同的遺傳轉(zhuǎn)化子保存在含有50μ g/mL潮霉素 Β的PDA平板培養(yǎng)基上（圖6)，于4°C低溫保存，用于陽性鑒定。
[0069] 實施例6遺傳轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定和熒光觀測
[0070] 1、蘆筍莖枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化子的基因組DNA提取
[0071]①取100mg新鮮菌絲，加600yL 2XCTAB提取緩沖液及少許滅菌石英砂，在研缽中 將菌絲充分研磨；
[0072] ②將研磨后的溶液轉(zhuǎn)入1.5mL無菌Eppendorf管中，于65°C水浴保溫30min，加等體 積的氯仿和異戊醇混合液，氯仿和異戊醇的體積比為24 :1，充分搖勾，4 °C 1 OOOOrpm離心 5min；
[0073] ③移取上清液至另一新的Eppendorf管中，加入3mol/L的NaAc溶液和冰凍乙醇， NaAc溶液的體積是上清液體積的10%，其pH為6.0，冰凍乙醇的體積是上清液體積的2.5倍， 于-20 °C 沉淀 30min;
[0074] ④4°C12000rpm離心5min，棄上清液，用70%無水乙醇清洗沉淀2次，通風(fēng)干燥沉淀 20min，加 TE緩沖液充分溶解，即為遺傳轉(zhuǎn)化子基因組DNA溶液，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0075] 2、蘆筍莖枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化子的PCR擴增檢測
[0076]為確定所獲得的抗潮霉素 B的蘆筍莖枯病菌株是否為陽性遺傳轉(zhuǎn)化子，含有目標(biāo) 外源質(zhì)粒目標(biāo)基因片段，采用PCR擴增方法進行分子鑒定。根據(jù)外源質(zhì)粒序列中的潮霉素 B 抗性基因 Hph設(shè)計引物用于擴增，引物序列為：
[0077] Hph/F1:5，-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3，
[0078] Hph/Rl:5，-AAGCCTGAACTCACCGCGAC-3，
[0079]常規(guī)PCR反應(yīng):加入適量菌的DNA作為PCR模板，然后按表1依次加入PCR反應(yīng)試劑， 置于PCR儀中進行反應(yīng)。反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性3min;94°C變性30s、55°C退火30s、72°C復(fù) 性lmin，35個循環(huán);72 °C延伸1 Omin，16 °C保溫30min。根據(jù)Tm值對退火溫度加以調(diào)整。擴增后 樣品用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增產(chǎn)物大小為1020bp(圖7)。
[0080] 表1 PCR反應(yīng)體系
[0081]
[0082] 3、蘆筍莖枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化子的熒光觀測
[0083]挑取經(jīng)PCR鑒定的陽性遺傳轉(zhuǎn)化子，利用萊卡DM2000熒光顯微鏡觀察陽性遺傳轉(zhuǎn) 化子的菌絲體在488nm藍色激發(fā)光源的激發(fā)下能否產(chǎn)生綠色熒光，篩選能夠強表達綠色熒 光蛋白的遺傳轉(zhuǎn)化子接種至含有50yg/mL潮霉素 B的TOA平板培養(yǎng)基上，連續(xù)培養(yǎng)5代獲得穩(wěn) 定表達GFP且生長發(fā)育形態(tài)未發(fā)生變化的蘆筍莖枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率高達40-50個 遺傳轉(zhuǎn)化子/yg DNA。
[0084]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。 [0085] 參考文獻
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【主權(quán)項】
1. PEG介導(dǎo)蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括蘆筍莖枯病菌原 生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化以及遺傳轉(zhuǎn)化子的篩選步驟； 原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化方法如下：向離心管中加入〇.5yg/yL質(zhì)粒DNA 10-20yL、0.6M KC1 與50mM CaCl2混合緩沖液25-30yL、亞精胺2-3yL，然后加入濃度為107-108個/mL的蘆筍莖枯 病菌原生質(zhì)體懸液50-100yL，混勻后置于冰上靜置10-15min;然后加入新鮮配制的PTC緩沖 液50-100yL，混勻后置于冰上靜置20-25min;然后再加入PTC混合溶液250-350yL，混勻后置 于冰上靜置l〇-15min;然后加入0.6M KC1與50mM CaCl2混合緩沖液600-800yL終止轉(zhuǎn)化反 應(yīng)，所得轉(zhuǎn)化體系用于后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化子的篩選； 其中，所述PTC緩沖液的配制如下：用水配制含有以下各組分的溶液:20-30 % PEG3350、 pH7.5 8-12mM Tris-HCl、40-60mM CaCl2,55°C水浴中各組分溶解后，用0.22μπι細(xì)菌過濾器 過濾除菌。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化方法如下：向離心管 中加入〇.5yg/yL質(zhì)粒pBHt2-sGFP的DNA 20yL、0.6M KC1 與50mM CaCl2混合緩沖液27.5yL、 亞精胺2.5yL，然后加入濃度為107-10 8個/mL的蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體懸液50yL，混勻后置 于冰上靜置l〇min;然后加入新鮮配制的PTC緩沖液50yL，混勻后置于冰上靜置20min;然后 再加入PTC混合溶液250yL，混勻后置于冰上靜置lOmin;然后加入0.6M KC1與50mM CaCl2混 合緩沖液700yL終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，所得轉(zhuǎn)化體系用于后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化子的篩選； 其中，所述PTC緩沖液的配制如下：用水配制含有以下各組分的溶液：25%TOG3350、 pH7.5 10mM Tris-HCl、50mM CaCl2,55°C水浴中各組分溶解后，用0.22μπι細(xì)菌過濾器過濾 除囷。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，向所得轉(zhuǎn)化體系中加 入10-15mL改良的Bottom agar固體培養(yǎng)基，混勻后倒入培養(yǎng)皿中，25°C暗培養(yǎng)15-24h;再向 培養(yǎng)皿中加入10-15mL改良的Top agar固體培養(yǎng)基，25°C暗培養(yǎng)5-10d，挑出遺傳轉(zhuǎn)化子，將 單菌落轉(zhuǎn)移至含有50-100yg/mL潮霉素 B的PDA平板培養(yǎng)基中，3d后將生長的菌落再次接種 至含有50-100yg/mL潮霉素 B的PDA平板培養(yǎng)基上，連續(xù)培養(yǎng)3-5代得到純化的蘆筍莖枯病菌 遺傳轉(zhuǎn)化子。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述改良的Bottom agar固體培養(yǎng)基的配 制如下：用水配制含有以下各組分的溶液:〇. 6M蔗糖、5mM HEPES、ImM(NH4) 2HP〇4、0.2mM生物 素、ImM維生素 Bl，pH5.3,瓊脂粉0.6%;121°C高壓蒸汽滅菌30min，冷卻后加入潮霉素 B使其 終濃度為50μg/ml; 所述改良的Top agar固體培養(yǎng)基的配制如下：用水配制含有以下各組分的溶液:0.6M 蔗糖、5mM HEPES、lmM(NH4)2HP〇4、0.2mM生物素、ImM維生素 Bl，pH5.3,瓊脂粉1%;121°C高壓 蒸汽滅菌30min，冷卻后加入潮霉素 B使其終濃度為lOOμg/ml。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體的制備方 法如下： (1)蘆筍莖枯病菌新鮮菌絲的獲得 al)將蘆筍莖枯病菌接種于PDA培養(yǎng)基上，活化培養(yǎng)5d; a2)將活化培養(yǎng)的蘆筍莖枯病菌打取菌餅接種于0A培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)14d，至分生孢 子器中乳白色分生孢子溢出，用于制備分生孢子懸浮液； a3)挑取適量分生孢子器中分泌出的乳白色分生孢子，溶于無菌水中，使分生孢子濃度 達1.0 X 108個/mL;將制備好的分生孢子懸液接種于液體完全培養(yǎng)基中，25°C150rpm搖床培 養(yǎng)72h，漏斗過濾，獲得新鮮菌絲體； (2)蘆筍莖枯病菌新鮮菌絲的酶解與原生質(zhì)體的獲得 bl)酶解菌絲細(xì)胞壁:取1.0g新鮮菌絲體，加入10mL裂解酶、崩潰酶和蝸牛酶的混合酶 液，33 °C水浴酶解4.5h，使原生質(zhì)體數(shù)量達107-108個/mL; b2)制備原生質(zhì)體懸液:過濾酶解溶液，濾去未被酶解的菌絲殘片，濾液于4°C5000rpm 離心5min;棄上清液，用l-2mL濃度1. Omol/L的山梨醇溶液洗2-3次，收集原生質(zhì)體重懸于 lmL濃度1. Omol/L預(yù)冷的山梨醇溶液中，即得原生質(zhì)體懸液。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述混合酶液的配制如下：向1. Omol/L MgS04溶液中加入裂解酶、崩潰酶和蝸牛酶，使其終濃度為裂解酶15g/L、崩潰酶10g/L、蝸牛 酶15g/L;配好后用直徑為0.45μπι的超微微孔濾膜過濾除菌； 其中，1.0mol/L MgS〇4溶液是以10mmol/L ρΗ6.98的PBS為溶劑配制。7. 根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項所述的方法，其特征在于，還包括對蘆筍莖枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化 子進行PCR檢測的步驟;其中，PCR檢測使用的引物序列如下： Hph/Fl:5 '-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3 ' Hph/Rl:5 '-AAGCCTGAACTCACCGCGAC-3 '。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系為:含Mg2+的10 X反應(yīng)緩沖液5 yL，2.5U/yL dNTPs 1μL，50μΜ引物Hph/Fl、Hph/Rl各2.5yL，DNA模板lyL，5U/yL Taq DNA聚 合酶lyL，ddH20 37yL。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)程序為:95 °C預(yù)變性3min; 94 °C變 性 3〇8、55°(：退火3〇8、72°(：復(fù)性1111丨11，35個循環(huán)；72°(：延伸1〇111丨11，16°(：保溫3〇11^11。10. 用于PEG介導(dǎo)的蘆筍莖枯病菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化的試劑，其特征在于，所述試劑的 組成如下：20-30%PEG3350、pH7.5 8-12mM Tris-HCl、40-60mM CaCl2,以水配制；優(yōu)選地， 所述試劑的組成如下：25%PEG3350、pH7.5 10mMTris-HCl、50mMCaCl2，以水配制。
【文檔編號】C12N1/15GK105838629SQ201610322289
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】張岳平, 陳光宇, 瞿華香, 趙萍, 周勁松, 尹玉玲
【申請人】江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所