干海參線粒體的提取與純化技術(shù)的制作方法
【專利摘要】一種干海參線粒體的提取與純化技術(shù)，其制備方法是：以干海參為原料，采用優(yōu)化后的溴化十六烷基三甲基銨法提取其線粒體，通過A260/A280值、瓊脂糖凝膠電泳和PCR檢測，對所得線粒溶液進(jìn)行定量，定性分析和綜合比較，為干海參的分子生物學(xué)研究提供了一套迅速、經(jīng)濟(jì)和可靠的技術(shù)方案。
【專利說明】
干海參線粒體的提取與純化技術(shù)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及的是一種干海參線粒體的提取與純化技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]海參屬于棘皮動物門。海參不僅是海產(chǎn)之美味佳肴，而且是名貴的滋補(bǔ)中藥材。在《本草綱目》、《中國藥用動物志》等藥學(xué)著作上均有記載。臨床用于腎虛陽萎、便秘、貧血、胃潰瘍、糖尿病、腫瘤等疾病的防治。近年來，海參的開發(fā)研究日益受到重視。從組織細(xì)胞中成功地提取DNA，是進(jìn)行一切有關(guān)分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究的前提。雖然文獻(xiàn)中已所道了許多動植物DNA提取的方法。但是研究中我們?nèi)孕枰鶕?jù)材料的不同情況進(jìn)行DNA提取方法的改進(jìn)及篩選比較。最近，我們在對干海參進(jìn)行分子標(biāo)志的研究時發(fā)現(xiàn)，由于干海參已被加工處理過，且富含多肽、海參酸性粘多糖、海參甙、硫酸軟骨素、膠原蛋白等多種物質(zhì)。使得DNA埋在這種黏稠膠狀物通過反復(fù)試驗(yàn)，我們探索出一種迅速、簡便、經(jīng)濟(jì)的分離純化干海參線粒體的方法，應(yīng)用該法可有效去除干海參中的各種雜質(zhì)，得到高純度、高得率的總DNA?？蛇M(jìn)行PCR擴(kuò)增，為干海參的進(jìn)一步研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種干海參線粒體的提取與純化技術(shù)。
[0004]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:取實(shí)驗(yàn)材料為仿刺參和大西洋海參的干參制品，以少煮多泡的原則浸發(fā)開，立即使用或置于-80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆?；線粒體提取純化方法:(I)稱取0.3g海參體壁，沖洗干凈，用無菌紙吸干，切碎或置液氮研碎；(2)將樣品放于600μ1Γ的蛋白酶水解液中；(3)樣品迅速置于65°C水溶2h以上，若溶解不完全，則可過夜處理，直至樣品完全溶解；(4)冷卻至室溫后，加入等體積的氯仿一異戊醇輕柔顛倒；(5)室溫10000r/min，離心1min,收集上清液；(6)重復(fù)以上兩個步驟幾次，至有機(jī)相和水相之間無變性蛋白質(zhì)；(7)取上清液加入等體積的沉淀緩沖液，保溫于65°C，30min;(8)以氯仿一異戊醇抽提幾次，至有機(jī)相和水相之間無雜質(zhì)；(9)收集上清液，加等體積的異丙醇輕柔顛倒，13000r/min?？傻玫桨咨恋?；(10)沉淀用70%的乙醇清洗兩次，空氣干燥后，用ΙΟΟμΙΤΕ緩沖液溶解，4°C保存?zhèn)溆谩?br>【具體實(shí)施方式】
[0005]取實(shí)驗(yàn)材料為仿刺參和大西洋海參的干參制品，以少煮多泡的原則浸發(fā)開，立即使用或置于-80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?br> 線粒體提取純化方法:
(1)稱取0.3g海參體壁，沖洗干凈，用無菌紙吸干，切碎或置液氮研碎；
(2)將樣品放于600μ?Γ的蛋白酶水解液中；
(3)樣品迅速置于65°C水溶2h以上，若溶解不完全，則可過夜處理，直至樣品完全溶解；(4)冷卻至室溫后，加入等體積的氯仿一異戊醇輕柔顛倒；
(5)室溫10000r/min，離心1min,收集上清液；
(6)重復(fù)以上兩個步驟幾次，至有機(jī)相和水相之間無變性蛋白質(zhì)；
(7)取上清液加入等體積的沉淀緩沖液，保溫于65°C，30min;
(8)以氯仿一異戊醇抽提幾次，至有機(jī)相和水相之間無雜質(zhì)；
(9)收集上清液，加等體積的異丙醇輕柔顛倒，13000r/min?？傻玫桨咨恋?；
(10)沉淀用70%的乙醇清洗兩次，空氣干燥后，用ΙΟΟμΙΤΕ緩沖液溶解，4°C保存?zhèn)溆谩?br>【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種干海參線粒體的提取與純化技術(shù)，其制備方法如下:取實(shí)驗(yàn)材料為仿刺參和大西洋海參的干參制品，以少煮多泡的原則浸發(fā)開，立即使用或置于-80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆?；線粒體提取純化方法:(I)稱取0.3g海參體壁，沖洗干凈，用無菌紙吸干，切碎或置液氮研碎；(2)將樣品放于600μ1Γ的蛋白酶水解液中；(3)樣品迅速置于65°C水溶2h以上，若溶解不完全，則可過夜處理，直至樣品完全溶解；(4)冷卻至室溫后，加入等體積的氯仿一異戊醇輕柔顛倒；(5)室溫10000r/min，離心1min,收集上清液；(6)重復(fù)以上兩個步驟幾次，至有機(jī)相和水相之間無變性蛋白質(zhì)；(7)取上清液加入等體積的沉淀緩沖液，保溫于65°C，30min ;(8)以氯仿一異戊醇抽提幾次，至有機(jī)相和水相之間無雜質(zhì)；(9)收集上清液，加等體積的異丙醇輕柔顛倒，13000r/min ;可得到白色沉淀；(10)沉淀用70%的乙醇清洗兩次，空氣干燥后，用ΙΟΟμΙΤΕ緩沖液溶解，4°C保存?zhèn)溆谩?br>【文檔編號】C12N5/07GK105838660SQ201510014649
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年1月13日
【發(fā)明人】王躍進(jìn)
【申請人】鄭州國手生物科技有限公司