病原卵菌新型幾丁質(zhì)合酶pschs2及其編碼基因與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種病原卵菌新型幾丁質(zhì)合酶蛋白PSCHS2及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)為如下a)或b)：a)由序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)由序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與大豆疫霉卵孢子產(chǎn)生相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的蛋白在大豆疫霉(Phytophthora sojae)自身生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起作用，主要包括菌絲生長(zhǎng)速率降低，卵孢子形成數(shù)量減少等；進(jìn)一步通過(guò)RFP熒光標(biāo)記PSCHS2，表明該蛋白主要分布在大豆疫霉卵孢子中。以上結(jié)論均為探究大豆疫霉分子致病機(jī)制以及大豆疫霉菌所導(dǎo)致的多種植物病害的防治與研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】
病原卵菌新型幾丁質(zhì)合酶PSCHS2及其編碼基因與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種病原卵菌新型幾丁質(zhì)合酶及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及來(lái)自大 豆疫霉的幾丁質(zhì)合酶PSCHS2其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆疫霉(Phytophthora sojae)屬于卵菌門(mén)腐霉科疫霉屬，是一種重要的植物病 原卵菌。大豆疫霉侵染引起的大豆疫霉根腐病在大豆的整個(gè)生育期均可發(fā)生并造成危害， 其在感病品種上可造成損失25%_50%以上，個(gè)別高感品種損失可達(dá)到100%。目前，大豆疫 霉根腐病在亞洲、非洲、歐洲、南北美洲和大洋洲的二十多個(gè)國(guó)家的大豆主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生， 每年由其直接造成的損失就高達(dá)15億美元。由于大豆疫霉根腐病對(duì)大豆能造成毀滅性災(zāi) 害，使其嚴(yán)重減產(chǎn)，大豆疫霉的相關(guān)研究工作也引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。
[0003] 大豆疫霉的有性生殖為同宗配合，雄器側(cè)生，藏卵器球形，直徑29-58μπι，壁較薄， 受精后發(fā)育成卵孢子;卵孢子球形，壁厚，大豆疫霉的卵孢子可以在植株病殘?bào)w和土壤中存 活多年，當(dāng)外界條件適宜時(shí)，卵孢子可直接萌發(fā)產(chǎn)生芽管，當(dāng)接觸到固體表面時(shí)芽管膨大產(chǎn) 生附著胞，然后馬上從附著胞上產(chǎn)生菌絲。休眠的卵孢子也可產(chǎn)生孢子囊，孢子囊可以隨 風(fēng)、雨水以及灌溉用水進(jìn)行遠(yuǎn)距離的傳播。綜上所述，卵孢子的產(chǎn)生和存活是大豆疫霉菌侵 染植物所必需的過(guò)程，病害的嚴(yán)重度與大豆疫霉卵孢子的產(chǎn)生數(shù)量和存活時(shí)間呈正相關(guān)。 如果能阻斷大豆疫霉卵孢子的形成，就可以控制大豆疫霉根腐病等病害的發(fā)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種幾丁質(zhì)合酶。
[0005] 本發(fā)明所提供的幾丁質(zhì)合酶，名稱為PSCHS2,來(lái)源于大豆疫霉均(Phytophthora sojae)PS6,是如下a)或b):
[0006] a)由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0007] b)由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與大豆疫霉卵孢子產(chǎn)生相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0008] 其中，SEQ ID No.4由901個(gè)氨基酸殘基組成。
[0009] 上述b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上 述b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將SEQ ID No.3所示的cDNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基 酸殘疾的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基的錯(cuò)義突變。
[0010]編碼所述PSCHS2蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0011] 所述核酸分子可以是DNA，如CDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0012] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸分子具體為編碼所述PSCHS2蛋白的基因（命 名為PSCHS2);所述PSCHS2基因是如下1)至3)中任一所述的cDNA分子：
[0013] 1)SEQ ID Νο·3所示的cDNA分子；
[0014] 2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的cDNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的cDNA分子；
[0015] 3)與1)或2)限定的CDNA分子具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的CDNA分子。
[0016] 上述嚴(yán)格條件可為用6 X SSC，0.5 % SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0017] 其中，SEQ ID No.3由2706個(gè)核苷酸組成，編碼SEQ ID No.4所示的蛋白質(zhì)。
[0018] 含有上述所述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019] 所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。
[0020] 在本發(fā)明中，所述重組表達(dá)載體具體為在pTOR載體的酶切位點(diǎn)Xbal和EcoRI中間 正向插入SEQ ID No.3所示cDNA片段后得到的重組質(zhì)粒。
[0021] 在本發(fā)明中，所述重組菌具體為向目的辣椒疫霉中導(dǎo)入了SEQ ID No. 3所示cDNA 片段后得到的重組大豆疫霉。其中，SEQ ID No.3所示cDNA片段是以重組載體的形式導(dǎo)入 的；所述重組載體具體為在PT0R載體酶切位點(diǎn)Xbal和EcoRI中間正向插入SEQ ID No.3所示 cDNA片段后得到的重組質(zhì)粒。所述目的大豆疫霉具體為大豆疫霉菌株P(guān)S6。
[0022] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種制備幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的方法。
[0023] 本發(fā)明所提供的制備幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的方法，包括將幾丁質(zhì)合酶PSCHS2編碼基 因在生物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)得到幾丁質(zhì)合酶的步驟;所述生物細(xì)胞可為微生物細(xì)胞、植物細(xì) 胞或非人動(dòng)物細(xì)胞。
[0024] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種制備表達(dá)幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的重組微生物的方 法。
[0025] 本發(fā)明所提供的制備表達(dá)幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的重組微生物的方法，包括將幾丁質(zhì) 合酶PSCHS2編碼基因?qū)胨拗魑⑸锛?xì)胞，得到表達(dá)幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的重組微生物的步 驟。
[0026] 其中，所述的重組微生物具體可為酵母，細(xì)菌，藻和真菌。
[0027] 幾丁質(zhì)合酶PSCHS2在作為幾丁質(zhì)合酶中的應(yīng)用，以及編碼幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的核 酸分子或含有編碼幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的核酸分子的生物材料在制備幾丁質(zhì)合酶中的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0028] 幾丁質(zhì)合酶PSCHS2在調(diào)控大豆疫霉卵孢子產(chǎn)生中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。其中，所述調(diào)控大豆疫霉卵孢子產(chǎn)生包括如下步驟:調(diào)控幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的表達(dá)，或 調(diào)控幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的編碼基因的轉(zhuǎn)錄。所述調(diào)控幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的表達(dá)具體可為提 高幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的表達(dá)水平以提高大豆疫霉卵孢子產(chǎn)量，或降低大豆幾丁質(zhì)合酶 PSCHS2的表達(dá)水平以降低大豆疫霉卵孢子產(chǎn)量。
[0029] 以下以幾丁質(zhì)合酶PSCHS2或其編碼基因?yàn)榘悬c(diǎn)的鑒定大豆疫霉殺菌劑的方法也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0030 ] a)鑒定所述待測(cè)物質(zhì)能否抑制幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的表達(dá)，如所述待測(cè)物質(zhì)能抑制 幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的表達(dá)，則所述待測(cè)物質(zhì)為候選的所述植物大豆疫霉殺菌劑;如所述待 測(cè)物質(zhì)不能抑制幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的表達(dá)，則所述待測(cè)物質(zhì)為非候選的所述植物大豆疫霉 殺菌劑；
[0031] b)鑒定所述待測(cè)物質(zhì)能否降低幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的表達(dá)，如所述待測(cè)物質(zhì)能降低 幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的表達(dá)，則所述待測(cè)物質(zhì)為候選的所述植物大豆疫霉殺菌劑;如所述待 測(cè)物質(zhì)不能抑制幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的表達(dá)，則所述待測(cè)物質(zhì)為非候選的所述植物大豆疫霉 殺菌劑；
[0032] c)鑒定所述待測(cè)物質(zhì)能否抑制幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的編碼基因的轉(zhuǎn)錄，如所述待測(cè) 物質(zhì)能抑制幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的編碼基因的轉(zhuǎn)錄，則所述待測(cè)物質(zhì)為候選的所述植物大豆 疫霉殺菌劑;如所述待測(cè)物質(zhì)不能抑制幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的編碼基因的轉(zhuǎn)錄，則所述待測(cè) 物質(zhì)為非候選的所述植物大豆疫霉殺菌劑；
[0033] d)鑒定所述待測(cè)物質(zhì)能否降低幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的編碼基因的轉(zhuǎn)錄，如所述待測(cè) 物質(zhì)能降低幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的編碼基因的轉(zhuǎn)錄，則所述待測(cè)物質(zhì)為候選的所述植物大豆 疫霉殺菌劑;如所述待測(cè)物質(zhì)不能降低幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的編碼基因的轉(zhuǎn)錄，則所述待測(cè) 物質(zhì)為非候選的所述植物大豆疫霉殺菌劑；
[0034] e)鑒定所述待測(cè)物質(zhì)能否使幾丁質(zhì)合酶PSCHS2失活，如所述待測(cè)物質(zhì)能使幾丁質(zhì) 合酶PSCHS2失活，則所述待測(cè)物質(zhì)為候選的所述植物大豆疫霉殺菌劑;如所述待測(cè)物質(zhì)不 能使幾丁質(zhì)合酶PSCHS2失活，則所述待測(cè)物質(zhì)為非候選的所述植物大豆疫霉殺菌劑。
[0035] 具有如下1)_5)中至少一種功能的物質(zhì)在制備植物大豆疫霉殺菌劑中的應(yīng)用也屬 于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0036] 1)抑制幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的表達(dá)；
[0037] 2)抑制幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的編碼基因的轉(zhuǎn)錄；
[0038] 3)降低幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的表達(dá)；
[0039] 4)降低幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的編碼基因的轉(zhuǎn)錄；
[0040] 5)使幾丁質(zhì)合酶PSCHS2失活。
[0041] 擴(kuò)增編碼幾丁質(zhì)合酶PSCHS2的核酸分子全長(zhǎng)或其任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。
[0042]實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的蛋白在大豆疫霉(Phytophthora sojae)自身生長(zhǎng)發(fā)育 過(guò)程中起作用，進(jìn)一步獲得的沉默轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)發(fā)育較野生型有明顯變化，主要包括菌絲 生長(zhǎng)速率降低，卵孢子形成數(shù)量減少等;進(jìn)一步通過(guò)RFP熒光標(biāo)記PSCHS2，表明該蛋白主要 分布在大豆疫霉卵孢子中。以上結(jié)論均為探究大豆疫霉分子致病機(jī)制以及大豆疫霉菌所導(dǎo) 致的多種植物病害的防治與研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0043] 圖1為大豆疫霉PSCHS2基因 DNA和cDNA的PCR鑒定結(jié)果，其中從左到右依次為以菌 絲階段的總DNA、以菌絲階段cDNA為模板的PCR產(chǎn)物和DNA分子量參照物。
[0044]圖2為PSCHS2基因在大豆疫霉不同發(fā)育階段(橫坐標(biāo)從左向右依次為:菌絲(MY)、 孢子囊(SP)、游動(dòng)孢子(Z0)、休止孢(CY))的表達(dá)模式分析圖。
[0045] 圖3為pTOR載體示意圖。
[0046] 圖4為野生型大豆疫霉（Phytophthora so jae)菌株P(guān)S6(WT)，空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子 CK，PSCHS2基因的沉默轉(zhuǎn)化子ST2-l、ST2-2和ST2-3中PSCHS2的相對(duì)表達(dá)量。
[0047] 圖5為野生型大豆疫霉（Phytophthora so jae)菌株P(guān)S6(WT)，空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子 CK，PSCHS2基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子0Τ2-1、0Τ2-2和0T2-3中PSCHS2的相對(duì)表達(dá)量。
[0048] 圖6為野生型大豆疫霉（Phytophthora sojae)菌株P(guān)S6(WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子 CK、PSCHS2基因的沉默轉(zhuǎn)化子ST2-1以及PSCHS2基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子0T2-1的菌落照片。
[0049] 圖7為野生型大豆疫霉(Phytophthora sojae)菌株P(guān)S6(WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子 CK、PSCHS2基因的沉默轉(zhuǎn)化子ST2-1以及PSCHS2基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子0T2-1的卵孢子照片。
[0050] 圖8為PSCHS2蛋白的亞細(xì)胞定位載體PGFPN-PSCHS2示意圖。
[00511圖9為PSCHS2蛋白的亞細(xì)胞定位照片。
【具體實(shí)施方式】
[0052]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方 法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可 從商業(yè)途徑得到。
[0053]大豆疫霉菌株P(guān)S6:存放于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院種子病理與殺菌劑藥理實(shí) 驗(yàn)室，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0054] 裂解酶、纖維素酶、甘露醇均購(gòu)買(mǎi)自Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)分別為：L1412、 C8546、M1902。
[0055]培養(yǎng)基配方：
[0056] PDA固體培養(yǎng)基:PDA固體培養(yǎng)基:稱取馬鈴薯200g，削皮切塊后置于1L蒸餾水中加 熱30分鐘，用四層紗布過(guò)濾收集濾液后再次定容至1L，加入14g瓊脂粉和18g葡萄糖煮沸， 121°C濕熱滅菌20分鐘，即得。
[0057] V8固體培養(yǎng)基：100ml V8蔬菜汁，1500轉(zhuǎn)/分(5000g)下離心10min，取上清液與去 離子水1:9比例稀釋（100ml的上清液加入900ml去離子水），加入lg碳酸鈣，15g瓊脂，高壓蒸 汽滅菌（121 °C )20min。
[0058] NPB液體及NPBA固體培養(yǎng)基：125g青豌豆，1L去離子水，高壓蒸汽滅菌（121 °C ) 20min后，4層紗布過(guò)濾，取濾液，并添加如下各物質(zhì):K2HP〇4 1.0g，KN03 3.0g，MgS〇4 0.5g， CaCl2 0. lg，CaC〇3 2.0g，D-山梨醇5.0g，D-甘露醇5.0g，葡萄糖5.0g，酵母粉2.0g，維生素 2.0ml，微量元素 2.0ml，瓊脂粉(配制固體培養(yǎng)基時(shí)）15g，并用去離子水定容至1L。高壓蒸汽 滅菌（121°C)20min。
[0059] PM液體培養(yǎng)基：125g青豌豆，1L去離子水，高壓蒸汽滅菌（121°C )20min后，4層紗布 過(guò)濾，取濾液，加入91. lg甘露醇，lg CaCh，2g碳酸媽，并用去離子水定容至1L。高壓蒸汽滅 菌（121°C ) 20min。若制備PM固體培養(yǎng)基，1L PM液體培養(yǎng)基中添加10.5g Agar高壓蒸汽滅菌 即可。MMg培養(yǎng)液:0.4M D-甘露醇，15mM MgCl2,4mM 2-(N-嗎啡啉）乙磺酸(MES)，pH 5.7;高 壓蒸汽滅菌（121°C)20min。
[0060] pTOR載體:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王源超實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，記載于"邵菁亢，辣椒疫霉游動(dòng)孢子 群體效應(yīng)的研究。2014年，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，碩士學(xué)位論文"一文，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲 得。
[0061 ] pGFPN載體：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)張修國(guó)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，記載于"Phytophthora capsici homologue of the cell cycle regulator SDAlis required for sporangial morphology ,mycel ial growth and plant inf ection，>Molecular Plant Pathology, 2015,公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0062]實(shí)施例1、幾丁質(zhì)合酶PSCHS2基因的克隆
[0063] 設(shè)計(jì)克隆大豆疫霉幾丁質(zhì)合酶PSCHS2基因的引物，PSCHS2-F(SEQ ID No.l): ATGTAACAGGACGGAGGC;PSCHS2-R(SEQ ID Νο·2) :TTAGCGCACTTCTTCCATGTT。以大豆疫霉基因 組cDNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如圖1所示，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收后分別與Tl-simple Vector (全飾金，北京)連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1，通過(guò)藍(lán)白斑篩選、質(zhì)粒DNA的酶切鑒定篩選 出陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，該P(yáng)CR產(chǎn)物的核苷酸序列是SEQ ID No.3,編碼SEQ ID No.4的蛋白質(zhì)大豆疫霉幾丁質(zhì)合酶PSCHS2。其中，SEQ ID No.4由901 個(gè)氨基酸殘基組成，SEQ ID No.3由2706個(gè)脫氧核苷酸組成。
[0064] 實(shí)施例2、PSCHS2基因在大豆疫霉不同發(fā)育階段的表達(dá)模式分析
[0065] 以不同發(fā)育階段(菌絲(MY)、孢子囊(SP)、游動(dòng)孢子(Z0)、休止孢(CY))的大豆疫霉 菌株P(guān)S6的ccDNA為模板，對(duì)PSCHS2進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。以大豆疫霉RPS基因、RPL13a基因 和β-tublin基因?yàn)閮?nèi)參。
[0066] 由Realtime PCR反應(yīng)米用Takara公司的SYE$R3(Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)試劑盒，反應(yīng)體系如下所示：
[0067]
[0068] 反應(yīng)條件如下所示：
[0069]
[0070] 熒光定量PCR引物如下表所示：
[0071]
[0072] 使用ABI PRJSM?7500進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品做三次重復(fù)，采用2-AACt的方法計(jì)算PSCHS2基因的相對(duì)表達(dá)量。
[0073] 結(jié)果如圖2所示，目的基因 PSCHS2的表達(dá)量在大豆疫霉菌絲階段相對(duì)較高，因此將 這個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段作為研究重點(diǎn)。
[0074] 實(shí)施例3、大豆疫霉PSCHS2基因的沉默轉(zhuǎn)化子和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子的獲得
[0075] -、大豆疫霉PSCHS2基因的沉默表達(dá)載體和過(guò)表達(dá)載體的獲得
[0076] 以大豆疫霉菌株P(guān)S6的cDNA為模板，采用引物PSCHS2-XbaI-F(SEQ ID No. 13) TCTAGAGGGCGTTCGACGAGGAGAT(下劃線部分為Xbal的識(shí)別酶切位點(diǎn)，用于沉默載體構(gòu)建)和 PSCHS2-EcoRI-R(SEQ ID No . 14)GAATTCCCACCCACGATAGCAAGATA AATAC(下劃線部分為 EcoRI的識(shí)別酶切位點(diǎn)，用于沉默載體構(gòu)建)進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及引物PSCHS2-EcoRI-F(SEQ ID No. 15)GAATTCGGGCGTTCGACGAGGAGAT(下劃線部分為EcoRI的識(shí)別酶切位點(diǎn)，用于過(guò)表達(dá)載 體構(gòu)建)和PSCHS2-XbaI-R(SEQ ID No· 16)TCTAGACCACCCACGATAGCAAGATAAATAC(下劃線部 分為Xbal的識(shí)別酶切位點(diǎn)，用于過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收后分別與 11-8；[11^|16￥601：01'(全飾金，北京)連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌1'1，通過(guò)藍(lán)白斑篩選、質(zhì)粒00嫩的 酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并擴(kuò)繁質(zhì)粒用于酶切。酶切體系 如下(酶購(gòu)買(mǎi)自NEB):
[0079] 在37°C水浴中酶切5-15min。
[0080]同時(shí)擴(kuò)繁pTOR質(zhì)粒（圖3)用于酶切，酶切體系及條件同上。
[00811 將酶切后的PSCHS2基因連接至酶切后的pTOR質(zhì)粒中，連接體系如下(T4 ligase購(gòu) 買(mǎi)自NEB):pT0R lyl;PSCHS2 5μ1;5Χ ligation buffer 2yl;T41igase 0·5μ1;超純水 1·5μ 1;總體積10μ1。置于25°C條件下連接30min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ΤΙ，通過(guò)抗性標(biāo)記篩選、質(zhì)粒cDNA 的酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。
[0082] 利用載體引物進(jìn)行pT0R-F(SEQ ID No.l7)TCACTCTCACGTGCCCAAGTCC和pTOR-R (SEQ ID No. 18)TTGTATTAAATGCATAGACACA進(jìn)行測(cè)序，在pTOR載體的酶切位點(diǎn)EcoRI和Xbal 處正向插入如SEQ ID如.3所示的？30^2基因的重組質(zhì)粒即為大豆疫霉?30^2基因的過(guò)表 達(dá)載體。
[0083] 利用載體引物進(jìn)行pT0R-F(SEQ ID No.l7)TCACTCTCACGTGCCCAAGTCC和pT0R-R (SEQ ID No. 18)TTGTATTAAATGCATAGACACA進(jìn)行測(cè)序，在pTOR載體的酶切位點(diǎn)EcoRI和Xbal 處反向插入如SEQ ID No.3所示的序列的重組質(zhì)粒即為大豆疫霉PSCHS2基因的沉默表達(dá)載 體。
[0084] 二、大豆疫霉PSCHS2基因的沉默轉(zhuǎn)化子和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子的獲得
[0085]采用CaCl2-PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法制備大豆疫霉PSCHS2基因的沉默轉(zhuǎn)化子 和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子(記載于"邵菁亢，辣椒疫霉游動(dòng)孢子群體效應(yīng)的研究。2014年，中國(guó)農(nóng)業(yè)大 學(xué)，碩士學(xué)位論文"一文）。具體為將步驟一中制備的沉默表達(dá)載體和過(guò)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化 大豆疫霉PS6,同時(shí)以pTOR空載體轉(zhuǎn)化大豆疫霉PS6作為對(duì)照，將生長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子經(jīng)G418抗 性V8固體培養(yǎng)基平板25°C培養(yǎng)篩選，從菌落邊緣打取菌絲塊接種在鋪有玻璃紙的V8平板 上，25 °C黑暗培養(yǎng)6天后刮取菌絲，提取轉(zhuǎn)化子樣品的RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA之后， 進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。以大豆疫霉以大豆疫霉RPS基因、RPL13a基因和β-tublin基因?yàn)閮?nèi) 參，以野生型大豆疫霉菌株P(guān)S6及轉(zhuǎn)化pTOR標(biāo)記質(zhì)粒的大豆疫霉菌株P(guān)S6為對(duì)照。具體操作 參見(jiàn)實(shí)施例2。
[0086] 使用ABIPR丨SMS.7500進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品做三次重復(fù)，采用2-AACt 的方法計(jì)算PSCHS2基因的相對(duì)表達(dá)量。
[0087]大豆疫霉PSCHS2基因的沉默轉(zhuǎn)化子的鑒定結(jié)果顯示，作為對(duì)照的野生型大豆疫霉 菌株P(guān)S6及轉(zhuǎn)化pTOR標(biāo)記質(zhì)粒的大豆疫霉菌株均擴(kuò)增出目的條帶，而大豆疫霉PSCHS2基因 的沉默轉(zhuǎn)化子幾乎擴(kuò)增不到目的條帶。從大豆疫霉PSCHS2基因的沉默轉(zhuǎn)化子隨機(jī)挑選三個(gè) 分別標(biāo)記為ST2-l、ST2-2和ST2-3。大豆疫霉PSCHS2基因的沉默轉(zhuǎn)化子的具體鑒定結(jié)果如圖 4所示，PSCHS2的沉默效率介于70 % -80 %之間。
[0088] 大豆疫霉PSCHS2基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子的鑒定結(jié)果顯示，作為對(duì)照的野生型大豆疫 霉菌株P(guān)S6及轉(zhuǎn)化pTOR標(biāo)記質(zhì)粒的大豆疫霉菌株均擴(kuò)增出目的條帶，而大豆疫霉PSCHS2基 因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增所得的目的條帶更加清晰，信號(hào)更強(qiáng)。從大豆疫霉PSCHS2基因的過(guò) 表達(dá)轉(zhuǎn)化子隨機(jī)挑選三個(gè)分別標(biāo)記為0Τ2-1、0Τ2-2和0T2-3。大豆疫霉PSCHS2基因的過(guò)表達(dá) 轉(zhuǎn)化子的具體鑒定結(jié)果如圖5所示，PSCHS2的過(guò)表達(dá)效率約為野生型的10-56倍。
[0089] 實(shí)施例4、大豆疫霉PSCHS2基因的沉默轉(zhuǎn)化子和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子的生物學(xué)形狀分析
[0090] 一、菌絲生長(zhǎng)速率檢測(cè)
[0091] 將野生型大豆疫霉(Phytophthora sojae)菌株P(guān)S6(WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK、實(shí) 施例3得到的沉默轉(zhuǎn)化子3了2-1，3了2-2,3了2-3以及?3〇^2基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子〇12-1，0丁2- 2,0T2-3接種于加有15mlV8固體培養(yǎng)基的9cm培養(yǎng)皿中央上，25°C黑暗條件下培養(yǎng)6天，用十 字交叉法測(cè)量各菌株的菌落直徑，每個(gè)菌株3次重復(fù)。由此得到菌絲生長(zhǎng)速率。
[0092] 結(jié)果顯示，PSCHS2基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子0Τ2-1，0Τ2-2,0Τ2-3及空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子 CK的菌絲生長(zhǎng)速率與野生型大豆疫霉(Phytophthora sojae)菌株P(guān)S6(WT)相比并無(wú)顯著性 差異;而實(shí)施例3得到的沉默轉(zhuǎn)化子ST2-1，ST2-2，ST2-3的菌絲生長(zhǎng)速率與野生型大豆疫霉 (Phytophthora sojae)菌株P(guān)S6(WT)相比顯著下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明所述幾丁質(zhì)合酶PSCHS2 參與調(diào)控了大豆疫霉的菌絲生長(zhǎng)，這也與實(shí)施例2中提到的PSCHS2基因在菌絲生長(zhǎng)階段表 達(dá)量最高相符（圖6)。
[0093]二、孢子囊數(shù)量和形態(tài)檢測(cè)
[0094] 制備10%V8固體和液體培養(yǎng)基，將野生型大豆疫霉(Phytophthora sojae)菌株 PS6 (WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK、實(shí)施例3得到的沉默轉(zhuǎn)化子ST2-1，ST2-2，ST2-3以及PSCHS2 基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子0T2-1，0T2-2，0T2-3接種于V8培養(yǎng)基上，25 °C條件下黑暗培養(yǎng)6天，每 株菌株用5mm打孔器打取菌餅10個(gè)，移入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入20ml V8汁液體培養(yǎng)基，25°C黑 暗培養(yǎng)3天后，用20ml去離子水沖洗，每隔30min沖洗1次，共沖洗5次，之后加10ml去離子水 定容，置于25 °C黑暗條件下8-10h后，通過(guò)顯微鏡觀察菌餅上孢子囊產(chǎn)生的數(shù)量，3次重復(fù)。
[0095] 結(jié)果顯示，與野生型大豆疫霉(Phytophthora sojae)菌株P(guān)S6(WT)和空載體對(duì)照 轉(zhuǎn)化子CK相比，實(shí)施例3得到的PSCHS2基因的沉默轉(zhuǎn)化子ST2-1，ST2-2，ST2-3及過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化 子0Τ2-1，0Τ2-2,0Τ2-3的孢子囊數(shù)量和形態(tài)在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)均沒(méi)有差異，且所有菌株均有一 定數(shù)量的孢子囊已經(jīng)釋放了游動(dòng)孢子。這說(shuō)明PSCHS2基因的表達(dá)量降低沒(méi)有影響大豆疫霉 孢子囊的正常發(fā)育和數(shù)量。
[0096] 三、卵孢子數(shù)量檢測(cè)
[0097] 制備10%V8固體培養(yǎng)基，將野生型大豆疫霉(Phytophthora sojae)菌株P(guān)S6(WT)、 空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK、實(shí)施例3得到的沉默轉(zhuǎn)化子ST2-1，ST2-2，ST2-3以及PSCHS2基因的過(guò) 表達(dá)轉(zhuǎn)化子0T2-1，0T2-2，0T2-3接種于V8培養(yǎng)基上，25°C條件下黑暗培養(yǎng)14天，通過(guò)顯微鏡 觀察卵孢子產(chǎn)生的數(shù)量，3次重復(fù)。
[0098] 結(jié)果顯示，PSCHS2基因過(guò)表達(dá)后與野生型大豆疫霉（Phytophthora sojae)菌株 PS6(WT)和空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK相比，卵孢子數(shù)量顯著增加;實(shí)施例3得到的PSCHS2基因的 沉默轉(zhuǎn)化子ST2-l，ST2-2，ST2-3卵孢子數(shù)量與野生型大豆疫霉(Phytophthora sojae)菌株 PS6(WT)相比顯著減少（圖7)。說(shuō)明PSCHS2蛋白參與調(diào)控大豆疫霉卵孢子的產(chǎn)生。
[0099] 實(shí)施例5、PSCHS2蛋白的亞細(xì)胞定位
[0100] 一、大豆疫霉PSCHS2蛋白的亞細(xì)胞定位表達(dá)載體的獲得
[0101] 以大豆疫霉菌株P(guān)S6的CDNA為模板，采用引物PsCHS2-ClaI-F ATCGATATGGAACAGGACGGAGGC(SEQ ID No . 19)(下劃線部分為C1 aI的識(shí)別酶切位點(diǎn)）和 PsCHS2-ClaI-R ATCGATGCGCACTTCTTCCATGTT(SEQ ID No.20)(下劃線部分為Clal的識(shí)別酶 切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收后采用實(shí)施例3步驟一中的方法酶切連接pGFPN載體 后獲得PSCHS2蛋白的亞細(xì)胞定位表達(dá)載體。
[0102] 經(jīng)測(cè)序，在PT0R載體的酶切位點(diǎn)Clal處正向插入SEQ ID如.3所示？30?2基因的 重組質(zhì)粒(圖8)即為大豆疫霉PSCHS2的亞細(xì)胞定位表達(dá)載體。
[0103] 二、大豆疫霉PSCHS2蛋白的亞細(xì)胞定位轉(zhuǎn)化子的獲得
[0104] 采用CaCl2-PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法制備大豆疫霉PSCHS2基因的亞細(xì)胞定位 轉(zhuǎn)化子。具體為將步驟一中制備的亞細(xì)胞定位表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化大豆疫霉PS6,同時(shí)以 pGFPN空載體轉(zhuǎn)化大豆疫霉PS6作為對(duì)照，將生長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子經(jīng)G418抗性V8固體培養(yǎng)基平板 25°C培養(yǎng)篩選，借助共聚焦激光掃描顯微鏡觀察PSCHS2蛋白在大豆疫霉中的分布，以野生 型大豆疫霉菌株P(guān)S6及轉(zhuǎn)化pGFPN標(biāo)記質(zhì)粒的大豆疫霉菌株P(guān)S6為對(duì)照。
[0105] 結(jié)果顯示，如圖9所示，PSCHS2蛋白主要分布在大豆疫霉卵孢子中，這與實(shí)施例4中 提到的PSCHS2基因過(guò)表達(dá)后卵孢子數(shù)量增加，PSCHS2基因沉默后卵孢子數(shù)量減少相一致， 說(shuō)明PSCHS2蛋白不但參與調(diào)控大豆疫霉卵孢子的產(chǎn)生且主要分布在卵孢子中發(fā)揮作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)： a) 由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b) 由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與大豆疫霉卵孢子相關(guān)的由a)衍生的蛋白質(zhì)。2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白的核酸分子。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子是編碼權(quán)利要求1所述 蛋白質(zhì)的基因；所述基因是如下1)至3)中任一所述的cDNA分子： 1. SEQ ID吣.3所示的。0嫩分子； 2) 在嚴(yán)格條件下與1)限定的cDNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的cDNA分子； 3) 與1)或2)限定的cDNA分子具有90%以上同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的cDNA 分子。4. 含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒或重組菌。5. 制備權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的方法，包括將權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的編碼基因在生 物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)得到權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的步驟;所述生物細(xì)胞為微生物細(xì)胞、植物細(xì) 胞或非人動(dòng)物細(xì)胞。6. 制備表達(dá)權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的重組微生物的方法，包括將權(quán)利要求1所述的蛋白 質(zhì)的編碼基因?qū)胨拗魑⑸锛?xì)胞，得到表達(dá)權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的重組微生物的步驟。7. 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)、權(quán)利要求2或3所述的核酸分子或權(quán)利要求4所述的生物材料 的應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用為下述1 )-3)中任一種： 1) 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)在作為幾丁質(zhì)合酶中的應(yīng)用； 2) 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)在調(diào)控大豆疫霉卵孢子產(chǎn)生中的應(yīng)用； 3) 權(quán)利要求2或3所述的核酸分子或權(quán)利要求4所述的生物材料在制備幾丁質(zhì)合酶中的 應(yīng)用。8. -種鑒定大豆疫霉殺菌劑的方法，包括如下a)-e)中的任意步驟： a) 鑒定所述待測(cè)物質(zhì)能否抑制權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的表達(dá)，如所述待測(cè)物質(zhì)能抑制 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的表達(dá)，則所述待測(cè)物質(zhì)為候選的所述植物大豆疫霉殺菌劑;如所述 待測(cè)物質(zhì)不能抑制權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的表達(dá)，則所述待測(cè)物質(zhì)為非候選的所述植物大 ?疫霉殺菌劑； b) 鑒定所述待測(cè)物質(zhì)能否降低權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的表達(dá)，如所述待測(cè)物質(zhì)能降低 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的表達(dá)，則所述待測(cè)物質(zhì)為候選的所述植物大豆疫霉殺菌劑;如所述 待測(cè)物質(zhì)不能抑制權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的表達(dá)，則所述待測(cè)物質(zhì)為非候選的所述植物大 ?疫霉殺菌劑； C)鑒定所述待測(cè)物質(zhì)能否抑制權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因的轉(zhuǎn)錄，如所述待測(cè) 物質(zhì)能抑制權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因的轉(zhuǎn)錄，則所述待測(cè)物質(zhì)為候選的所述植物 大豆疫霉殺菌劑;如所述待測(cè)物質(zhì)不能抑制權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因的轉(zhuǎn)錄，則所 述待測(cè)物質(zhì)為非候選的所述植物大豆疫霉殺菌劑； d)鑒定所述待測(cè)物質(zhì)能否降低權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因的轉(zhuǎn)錄，如所述待測(cè) 物質(zhì)能降低權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因的轉(zhuǎn)錄，則所述待測(cè)物質(zhì)為候選的所述植物 大豆疫霉殺菌劑;如所述待測(cè)物質(zhì)不能降低權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因的轉(zhuǎn)錄，則所 述待測(cè)物質(zhì)為非候選的所述植物大豆疫霉殺菌劑； e)鑒定所述待測(cè)物質(zhì)能否使權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)失活，如所述待測(cè)物質(zhì)能使權(quán)利要 求1所述蛋白質(zhì)失活，則所述待測(cè)物質(zhì)為候選的所述植物大豆疫霉殺菌劑;如所述待測(cè)物質(zhì) 不能使權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)失活，則所述待測(cè)物質(zhì)為非候選的所述植物大豆疫霉殺菌劑。9. 具有如下1)_5)中至少一種功能的物質(zhì)在制備植物大豆疫霉殺菌劑中的應(yīng)用： 1) 抑制權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的表達(dá)； 2) 抑制權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因的轉(zhuǎn)錄； 3) 降低權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的表達(dá)； 4) 降低權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因的轉(zhuǎn)錄； 5) 使權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)失活。10. 擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述的核酸分子的全長(zhǎng)或其任一片段的引物對(duì)。
【文檔編號(hào)】C12N15/54GK105838687SQ201610322492
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】劉西莉, 張燦, 王為鎮(zhèn), 刁永朝, 牟文君, 劉利, 劉鵬飛, 黃中喬, 宋維珮
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)