一種藍(lán)鱈魚實(shí)時(shí)熒光pcr特異性檢測體系及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種藍(lán)鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測體系及應(yīng)用。引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。采用藍(lán)鱈魚特異性檢測引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增藍(lán)鱈魚的CoⅠ基因，實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增后會(huì)產(chǎn)生一條特異性擴(kuò)增曲線，從而將藍(lán)鱈魚成分進(jìn)行特異性鑒定。本發(fā)明特異性引物設(shè)計(jì)合理，用于藍(lán)鱈魚的物種檢測，特異性好，檢測靈敏度高，即經(jīng)過熒光PCR分析，即可將藍(lán)鱈魚成分進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，具有很好的特異性。
【專利說明】
-種藍(lán)輯魚實(shí)時(shí)黃光PCR特異性檢測體系及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種藍(lán)轄魚物種實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測體 系及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 藍(lán)轄魚（學(xué)名：Mic;romesistius poutassou)為轄形目轄科魚類的一種，夕F表粗糖。 通過形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行判斷是對藍(lán)轄魚識(shí)別的傳統(tǒng)方法，但是運(yùn)些形態(tài)學(xué)特征的可塑性強(qiáng)， 受環(huán)境影響大，具有人為的主觀傾向性，且存在豐富的近緣物種，近緣種間的形態(tài)差異細(xì) 微，所W傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征識(shí)別方法存在識(shí)別困難與識(shí)別錯(cuò)誤的問題。
[0003] 采用DNA技術(shù)鑒定動(dòng)物物種是物種識(shí)別方法中最為熱口也是發(fā)展最快的分子技 術(shù)，快速進(jìn)化并呈母系遺傳的線粒體DNA是種群遺傳學(xué)和進(jìn)化遺傳學(xué)的理想研究對象。目 前，魚類物種的分子檢測主要集中CoI基因，藍(lán)轄魚與其它近源物種的CoI基因序列相似度 在90%左右，序列之間存在著一定的差異。實(shí)時(shí)巧光PCR是DNA技術(shù)鑒定中快捷高效的技術(shù) 之一，指在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，通過巧光化學(xué)物質(zhì)檢測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物 總量的方法，研究利用實(shí)時(shí)巧光PCR對藍(lán)轄魚進(jìn)行物種識(shí)別及在藍(lán)轄魚的物種保護(hù)及系統(tǒng) 發(fā)育研究等領(lǐng)域均具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種藍(lán)轄魚物種特異性檢測體系及該特異性檢測體系的應(yīng)用方法。本 發(fā)明可W檢測出來自動(dòng)物樣品的微量DNA，完全區(qū)分藍(lán)轄魚的基因與其它魚類基因，檢測靈 敏度高，方法快速，易操作。
[0005] 本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是:一種藍(lán)轄魚物種實(shí)時(shí)巧光PCR特異 性檢測引物和檢測體系，其中所述的引物序列是：
[0006] 上游引物沈Q ID NO. 1:5 ' -CAGTAGGAGGGCTAACAG-3 ' ；
[0007] 下游引物沈Q ID NO. 2:5 ' -GGAATCAATGGACGAAGG-3 ' ；
[000引進(jìn)一步地，所述藍(lán)轄魚物種實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測體系還包括由其他試劑所組 成的反應(yīng)體系如下表1:
[0009] ± 姑位4如王丄山以A化口,化認(rèn).'化1化 < 占片r-~山<
[0010]
[0011]
[001^ 其中，SYBRBipremix Ex hq購自于大連寶生物工程郁良公司（商品貨號:RR820)
[0013] 進(jìn)一步地，所述藍(lán)轄魚物種實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測體系的反應(yīng)參數(shù)如下表2:
[0014] 表2藍(lán)轄魚物種實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測體系的反應(yīng)參數(shù)
[0015]
[0016] 一種根據(jù)所述的藍(lán)轄魚物種實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測體系的應(yīng)用，利用SYBR|，> Green I與雙鏈DNA非特異性結(jié)合的特性，監(jiān)測每一PCR反應(yīng)的巧光強(qiáng)度，W檢測反應(yīng)體系中 的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0017] 進(jìn)一步地，所述藍(lán)轄魚物種進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測方法為:采用藍(lán)轄魚物種 實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測體系擴(kuò)增藍(lán)轄魚的CoI基因，WSYBRi'Premix Ex化q DNA聚合酶 進(jìn)行PCR反應(yīng)，利用SY日R?Green I與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出巧光的特性，檢測反應(yīng)體系中的 SYBR?Green I與DNA結(jié)合后發(fā)出的巧光，達(dá)到檢測PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量目的。通過設(shè)計(jì)藍(lán)轄魚 物種特異性引物，從而引發(fā)特異性擴(kuò)增，通過巧光信號的收集處理，獲得特異性擴(kuò)增曲線。 [00 1引本發(fā)明特異性引物設(shè)計(jì)合理，用于藍(lán)轄魚物種檢測，特異性好，檢測靈敏度高。采 用本方法檢測藍(lán)轄魚動(dòng)物成分結(jié)果顯示，采用藍(lán)轄魚物種特異性檢測引物實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò) 增藍(lán)轄魚的CoI基因，會(huì)產(chǎn)生一條特異性擴(kuò)增曲線，即經(jīng)過實(shí)時(shí)巧光PCR分析，即可將藍(lán)轄魚 成分進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，具有很好的特異性。
【附圖說明】
[0019] 圖1.相似序列的物種分布情況，其中，方框內(nèi)的物種為藍(lán)轄魚所在的位置；
[0020] 圖2.引物的特異性分析，如圖所示只有Micromesistius poutassou的物種能和所 設(shè)計(jì)的引物完全互補(bǔ)結(jié)合，沒有檢驗(yàn)到完全匹配的其它物種，證明引物的特異性較好；
[0021] 圖3.引物PCR擴(kuò)增的電泳檢測結(jié)果圖，圖中：M、DL2000marker; 1、藍(lán)轄魚2、藍(lán)轄魚 3、太平洋轄魚4、黑線轄5、大西洋轄6、阿拉斯加轄魚7、空白對照。
[0022] 圖4.藍(lán)轄魚實(shí)時(shí)巧光PCR的溶解曲線檢測結(jié)果圖，圖中：1、藍(lán)轄魚2、藍(lán)轄魚3、太平 洋轄魚4、黑線轄5、大西洋轄6、阿拉斯加轄魚7、空白對照。
[0023] 圖5.藍(lán)轄魚與其他轄形目海洋魚類的實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測結(jié)果圖，圖中：1、藍(lán) 轄魚2、綠青轄3、太平洋轄魚4、北太平洋無須轄5、黑線轄6、大西洋轄7、黑轄8、阿拉斯加轄 魚9、空白對照。
[0024] 圖6.靈敏度分析結(jié)果圖，圖中：1、25ng/iiL擴(kuò)增結(jié)果;2、5ng/iiL擴(kuò)增結(jié)果;3、lng/化 擴(kuò)增結(jié)果;4、0.2ng/iiL擴(kuò)增結(jié)果;5、0. (MngAiL擴(kuò)增結(jié)果;6、0.0 lngAiL擴(kuò)增結(jié)果;7、空白對 照。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不局限于具體實(shí)施 例。本發(fā)明下述具體實(shí)施例中所設(shè)及的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法，所用 的試劑或藥品，如無特殊說明，均由常規(guī)方法制備或者可由商業(yè)途徑獲得，其中所用空白對 照為水。
[0026] 實(shí)施例1巧光PCR特異性檢測引物序列的設(shè)計(jì)
[0027] 1.藍(lán)轄魚相近物種CoI基因的分析
[002引登錄NCBKhttp://www.ncbi .nlm.nih.g N程序在nr數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性序列的 捜索，返回的相似序列的物種分布情況如圖1所示，并將所有序列WMicromesistius poutassou及CoI為關(guān)鍵詞在nr數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行捜索，將捜索結(jié)果的序列下載存盤后，進(jìn)行 Blast列下載存盤。圖1為相似序列的物種分布情況，其中，方框內(nèi)的物種為藍(lán)轄魚所在的位 置。
[0029] 2.藍(lán)轄魚物種特異性檢測引物的設(shè)計(jì)
[0030] 將下載的序列進(jìn)行序列的相似性分析和序列性分析，在序列的差異處設(shè)計(jì)特異性 引物。
[0031 ] 3.藍(lán)轄魚物種特異性檢測引物的特異性分析
[0032] 將設(shè)計(jì)好的引物在NCBI中，利用primer blast程序選擇nr數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行引物的特 異性分析，如圖2結(jié)果所示：在返回的結(jié)果中，只有Micromesistius poutassou的物種能和 所設(shè)計(jì)的引物完全互補(bǔ)結(jié)合，沒有檢驗(yàn)到完全匹配的其它物種，證明引物的特異性較好。
[0033] 4.藍(lán)轄魚物種特異性檢測引物合成
[0034] 在寶生物公司合成藍(lán)轄魚物種特異性檢測引物1對，其序列為：
[0035] 上游引物沈Q ID NO. 1:5 ' -CAGTAGGAGGGCTAACAG-3 ' ；
[0036] 下游引物沈Q ID NO. 2:5 ' -GGAATCAATGGACGAAGG-3 ' ；
[0037] 5.藍(lán)轄魚DNA的提取
[0038] 采用DNA提取試劑盒(購于寶生物公司）提取藍(lán)轄魚(取自大連國富水產(chǎn)食品有限 公司）模板DNA，用微量分光光度計(jì)檢測提取藍(lán)轄魚模板DNA的濃度為10化邑。
[0039] 6.藍(lán)轄魚CoI基因的克隆及測序驗(yàn)證
[0040] 瓊脂糖凝膠電泳檢測：W合成的特異性引物PCR擴(kuò)增藍(lán)轄魚的CoI基因后，W2%瓊 脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示（如圖3所示），經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后會(huì)分別產(chǎn)生 147bp的特異性電泳條帶，電泳效果最好，PCR擴(kuò)增效率最高。
[0041] 片段的切膠回收:采用寶生物公司的DNA片段回收試劑盒將目的條帶回收及純化， 操作過程按試劑盒附帶的說明書進(jìn)行。
[0042] 回收片段的連接、克隆及測序：回收片段與克隆載體PMD-19T連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)菌液 PCR檢測，陽性菌株送上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測定，確定所克隆的目的片段的序列 信息。
[0043] 序列驗(yàn)證:測序結(jié)果采用NCBI的Blast N程序通過序列比對進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果顯 示，所克隆的片段為藍(lán)轄魚的CoI基因片段。
[0044] 實(shí)施例2實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測體系的應(yīng)用
[0045] 藍(lán)轄魚物種實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測體系的應(yīng)用，即利用所述藍(lán)轄魚物種實(shí)時(shí)巧 光PCR特異性檢測體系擴(kuò)增藍(lán)轄魚的CoI基因，對藍(lán)轄魚物種進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測， 具體步驟如下：
[0046] 親3胺値值物!釉出時(shí)忠弈PCR賠見化捻畑Il化器的!^廊化器
[0047]
[004引藍(lán)轄魚物種實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測體系的反應(yīng)參數(shù)如下表4:
[0049] 親4苦値值物釉違時(shí)巧朵PCR特異忡捻細(xì)Il化累的反應(yīng)參數(shù)
[(K)加]
[0051] 采用藍(lán)轄魚物種實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測組合物進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增藍(lán)轄魚的 CoI基因時(shí)，WsYBR?Premix Ex hq DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，利用SYBRgiGreen I與雙鏈 DNA結(jié)合后發(fā)出巧光，檢測反應(yīng)體系中的SYBR?Green I與DNA結(jié)合后發(fā)出的巧光，通過設(shè) 計(jì)藍(lán)轄魚物種特異性引物，從而引發(fā)特異性擴(kuò)增，通過巧光信號的收集處理，獲得特異性擴(kuò) 增曲線，如圖4及圖5所示，證明了所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的有效性及特異性的結(jié)果。
[0052] 實(shí)施例3特異性檢測
[0053] 利用所述藍(lán)轄魚物種實(shí)時(shí)巧光PCR特異性檢測體系進(jìn)行藍(lán)轄魚的物種成分實(shí)時(shí)巧 光PCR特異性檢測藍(lán)轄魚等轄形目樣品，采用DNA提取試劑盒提取各待測樣品的模板DNA，用 微量分光光度計(jì)分別檢測所提取的模板DNA的濃度為SOngAiL,分別按照上述步驟4中所述 反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生的30個(gè)循環(huán)W下的特異性擴(kuò)增曲線即為藍(lán)轄魚，其 他樣品在30個(gè)循環(huán)W后出現(xiàn)擴(kuò)增曲線或沒有擴(kuò)增曲線，此方法可W準(zhǔn)確的對藍(lán)轄魚的成分 進(jìn)行鑒定，具有很好的特異性，如圖5所示。
[0054] 實(shí)施例4靈敏度檢測
[0055] 采用DNA提取試劑盒提取陽性樣品的模板DNA，用微量分光光度計(jì)分別檢測所提取 的模板 DNA 梯度稀釋，制備成 25ngAiL、5ng/iiL、IngAiUO.化g/iiL、0.04ngAiL、0.0 lngAiLS 個(gè) 濃度梯度樣品，分別按照上述步驟3中所述反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增，W 確定本標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測靈敏度，結(jié)果如圖6所示，所產(chǎn)生特異性擴(kuò)增曲線即為藍(lán)轄魚，當(dāng)DNA 濃度^ 0. (MngAiL時(shí)均可W特異擴(kuò)增，即該標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測靈敏度為0.04ngAiL。此方法可 W準(zhǔn)確的對藍(lán)轄魚的成分進(jìn)行鑒定，具有很好的靈敏度。
[0056] W上內(nèi)容是結(jié)合優(yōu)選技術(shù)方案對本發(fā)明所做的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定發(fā)明的 具體實(shí)施僅限于運(yùn)些說明。對本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明 的構(gòu)思的前提下，還可W做出簡單的推演及替換，都應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種藍(lán)鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測引物，其特征在于：引物序列如SEQ ID NO .1 和SEQ ID NO .2所示。2. -種藍(lán)鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測體系，其特征在于:包括如權(quán)利要求1所述 的引物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種藍(lán)鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測體系，包括下述試 劑： 2X 泫改的 SYBRk Pranix Ex Taq 12 5 μ L 濃度為Η) μ mol/L的上游引物SEQ ID Ν0.1 (X25 μ L 濃度為 10 μ mol/L 的下游引物 SEQ ID Ν0.2 :(),25 U L。 濃度<50ng的待檢樣品的DNA模板 1 μL. 雙蒸水 11 PL4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種藍(lán)鱈魚物種實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測體系，其特征在于： 所述檢測體系的反應(yīng)參數(shù)為:變性，95°C，30s;擴(kuò)增，95°C，5s; 60°C，30s，40個(gè)循環(huán)。5. 利用權(quán)利要求2所述檢測體系對藍(lán)鱈魚物種進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK105838788SQ201610204804
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月31日
【發(fā)明人】蔣丹, 劉淑艷, 劉冉, 蘇旺
【申請人】蔣丹, 劉淑艷, 劉冉, 蘇旺