一種診治食管癌的分子標(biāo)志物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了DEPDC1B基因及其表達(dá)產(chǎn)物可作為食管癌早期診斷的分子標(biāo)志物。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)表明DEPDC1B基因在食管癌患者和正常食管組織中存在差異表達(dá)，通過檢測(cè)受試者食管組織中DEPDC1B基因的表達(dá)情況即可判斷受試者是否患有食管癌。另外，本發(fā)明還公開了DEPDC1B基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以作為食管癌治療的靶標(biāo)，用于指導(dǎo)新藥的研發(fā)。
【專利說明】
-種診治食管癌的分子標(biāo)志物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地設(shè)及DEPDC1B基因在食管癌的診斷、治療中的用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 食管癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。中國是食管癌的高發(fā)國家，食管癌 在腫瘤相關(guān)的死因中排名第四。在河北省磁縣，食管癌的發(fā)病率和死亡率均排名在所有腫 瘤的首位。由于食管癌早期缺乏特異癥狀，大部分患者在就診時(shí)已處于疾病的中晚期。另 夕h盡管手術(shù)水平不斷提高，食管癌細(xì)胞對(duì)放療、化療的耐受使食管癌患者五年生存率仍維 持在較低水平。因此，及早發(fā)現(xiàn)食管癌的高危人群，高危人群定期接受食管內(nèi)鏡檢查，才能 早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療食管癌患者，最終才能提高食管癌患者的生存率，改善患者 的生存質(zhì)量，保存勞動(dòng)力，更好地創(chuàng)造社會(huì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種可用于食管癌早期診斷的分子標(biāo)志物。相比現(xiàn)有的食 管癌的診斷方法，使用基因標(biāo)志物來診斷食管癌的具有及時(shí)性、特異性和靈敏性，從而使患 者在疾病早期就能知曉疾病風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0005] 本發(fā)明提供了檢測(cè)DEPDC1B基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷食管癌的工具中的應(yīng)用。
[0006] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)DEPDC1B基因表達(dá)的產(chǎn)品包括檢測(cè)DEPDC1B基因 mRNA水平的產(chǎn) 品、和/或檢測(cè)DEPDC1B蛋白水平的產(chǎn)品。
[0007] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)DEPDC1B基因表達(dá)的產(chǎn)品包括:通過RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫 檢測(cè)、原位雜交或忍片檢測(cè)DEPDC1B基因表達(dá)W診斷食管癌的產(chǎn)品。
[000引進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增DEPDC1B基因的 引物;所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增DEPDC1B基因的引物； 所述用免疫檢測(cè)診斷食管癌的產(chǎn)品包括:與DEPDC1B蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜 交診斷食管癌的產(chǎn)品包括:與DEPDC1B基因的核酸序列雜交的探針;所述用忍片診斷食管癌 的產(chǎn)品包括:蛋白忍片和基因忍片;其中，蛋白忍片包括與DEPDC1B蛋白特異性結(jié)合的抗體， 基因忍片包括與DEPDC1B基因的核酸序列雜交的探針。
[0009] 所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增DEPDC1B基因的 引物如沈Q ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
[0010] 所述檢測(cè)DEPDC1B基因表達(dá)的產(chǎn)品可W是檢測(cè)DEPDC1B基因表達(dá)的試劑、也可W是 包含所述試劑的試劑盒、忍片、試紙等，也可W是使用所述試劑的高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0011] 所述診斷食管癌的工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)；高 通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷食管癌的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的 基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜， 容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知DEPDCIB基因的異常與 食管癌相關(guān)也屬于DEPDC1B基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種診斷食管癌的工具，所述工具包括檢測(cè)DEPDC1B基因表達(dá)的 試劑;所述試劑包括檢測(cè)DEPDC1B基因 mRNA的引物和/或探針、檢測(cè)DEPDC1B蛋白的抗體。
[0013] 所述工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0014] 其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白質(zhì)忍片;所述基因忍片包括固相載體W及固定 在固相載體的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括用于檢測(cè)DEPDC1B基因轉(zhuǎn)錄水平的針 對(duì)DEPDC1B基因的寡核巧酸探針；所述蛋白質(zhì)忍片包括固相載體W及固定在固相載體的 DEPDC1B蛋白的特異性抗體;所述基因忍片可用于檢測(cè)包括DEPDC1B基因在內(nèi)的多個(gè)基因 (例如，與食管癌相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)忍片可用于檢測(cè)包括DEPDC1B蛋 白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與食管癌相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過將多個(gè)與食管癌 的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可大大提高食管癌診斷的準(zhǔn)確率。
[001引其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒;所述基因檢測(cè)試 劑盒包括用于檢測(cè)DEPDC1B基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括DEPDC1B蛋 白的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或 忍片方法檢測(cè)D E P D C1B基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選地，所述試劑包括針對(duì) DEPDC1B基因的引物和/或探針。根據(jù)DEPDC1B基因的核巧酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可W用于 檢測(cè)DEPDC1B基因表達(dá)水平的引物和探針。
[0016] 所述試紙包括檢測(cè)DEPDC1B基因表達(dá)的試劑。
[0017] 所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括檢測(cè)DEPDC1B基因表達(dá)的試劑。
[0018] 與DEPDC1B基因的核酸序列雜交的探針可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其 它衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核巧酸序列特異性結(jié) 合，任何長(zhǎng)度都可W。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述探針 的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì) 雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不 超過30個(gè)堿基對(duì)，與目的核巧酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度W15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ) 序列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，W免影響雜交效率。
[0019] 進(jìn)一步，所述DEPDCIB蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述 DEPDC1B蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如，，嵌合抗 體、3〇。乂^曰13^(曰13'）2爪等。只要所述片段能夠保留與06口0018蛋白的結(jié)合能力即可。用于 蛋白質(zhì)水平的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可W使用任何方法來制備 所述抗體。
[0020] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)DEPDC1B基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4所示的引物對(duì)。
[0021] 本發(fā)明還提供了 DEPDC1B基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑在制備治療食管癌的藥 物中的應(yīng)用。所述抑制劑包括抑制DEPDC1B基因表達(dá)的試劑、和/或抑制DEPDC1B基因表達(dá)產(chǎn) 物的試劑。
[0022] 進(jìn)一步，所述抑制DEPDC1B基因表達(dá)的試劑包括抑制基因轉(zhuǎn)錄的試劑、抑制基因翻 譯的試劑;所述抑制DEPDC1B基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括抑制DEPDC1B基因 mRNA的試劑、抑制 DEPDCIB蛋白的試劑。所述抑制DEPDCIB基因 mRNA的試劑包括抑制mRNA穩(wěn)定性的試劑、抑制 mRNA翻譯活性的試劑。所述抑制DEPDC1B蛋白的試劑包括抑制DEPDC1B蛋白穩(wěn)定性的試劑、 抑制DEPDCIB蛋白活性的試劑、抑制DEPDCIB蛋白功能的試劑。
[0023] 進(jìn)一步，抑制DEPDC1B基因 mRNA的試劑包括針對(duì)DEPDC1B基因 mRNA的雙鏈核糖核 酸;抑制DEPDCIB蛋白功能的試劑包括DEPDCIB抗原蛋白的腫瘤疫苗、抑制DEPDCIB蛋白功能 的抗體。所述抗體可W是多克隆抗體，或是單克隆抗體。
[0024] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述針對(duì)DEPDCIB基因 mRNA的雙鏈核糖核酸是 S iRNA。為了確保DEPDCIB基因能夠被高效剔除或沉默，根據(jù)DEPDCIB基因的mRNA序列設(shè)計(jì)了 SiRNA特異性片段。SiRNA的設(shè)計(jì)根據(jù)已發(fā)表的通用設(shè)計(jì)原則化Ibashir et.al 2001， Schwarz et.al 2003,Khvorova et.al 2003,Reynolds et.al2004,Hsieh et.al 2004, Ui-Tei et.al 2004)，通過在線工具完成設(shè)計(jì)，該在線工具為：siRNASelectionProgramof Whitehead Institute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/ SiRNAext/)和化OCK-iTTM RNAi Designer ofINVITR0GEN(winner of the 2004Frost& Sullivan Excellence in Research Award,https://rnaidesigner.invitrogen. com/ Sirna/)。為了進(jìn)一步提高SiRNA片斷的有效性，綜合兩個(gè)在線設(shè)計(jì)工具的優(yōu)點(diǎn)來設(shè)計(jì)用于 篩選的SiRNA片斷。最后，通過同源性比對(duì)(NCBI BLAST)來過濾SiRNA序列，W提高SiRNA片 斷的特異性并減少RNAi干擾的脫祀效應(yīng)。
[0025] 優(yōu)選地，所述SiRNA的序列如沈Q ID NO.7和沈Q ID NO.8所示。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種用于治療食管癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括上面所 述的DEPDCIB基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑。
[0027] 本發(fā)明的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體，其中該載體可為賦形劑、稀釋 劑、增稠劑、填充劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、油脂或非油脂的基劑、表面活性劑、懸浮劑、膠 凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、著色劑或香料其中之一或兩者W上的混合。
[0028] 本發(fā)明的藥物組合物可用于制造治療食管癌的藥劑。
[0029] 本發(fā)明的藥物組合物首選應(yīng)用于哺乳動(dòng)物，其中該哺乳動(dòng)物優(yōu)選為人類病患。
[0030] 本發(fā)明的藥物組合物可例如W 口服、注射等方式給予至該人類病患體內(nèi)。
[0031] 本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療食管癌的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可W 大大提到治療的成功率。
[0032] 在本發(fā)明的上下文中/'DEPDCIB基卸'包括DEPDCIB基因 W及DEPDCIB基因的任何 功能等同物的多核巧酸。DEPDCIB基因包括與目前國際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫GeneBank中 DEPDC1B基因（NC_000005.10)DNA序列具有70%W上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA 序列。
[0033] 優(yōu)選地，DEPDCIB基因的編碼序列包括W下任--種DNA分子：
[0034] (1)序列表中沈Q ID NO. 1所示的DNA序列；
[0035] (2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0036] (3)與（1)或(2)限定的DNA序列具有70 %、優(yōu)選地，90 % W上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0037] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述DEPDCIB基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[0038] 在本發(fā)明的上下文中，DEPDCIB基因表達(dá)產(chǎn)物包括DEPDCIB蛋白W及DEPDCIB蛋白 的部分膚。所述DEPDC1B蛋白的部分膚含有與食管癌相關(guān)的功能域。
[0039] "DEPDC1B蛋白"包括DEPDC1B蛋白W及DEPDC1B蛋白的任何功能等同物。所述功能 等同物包括DEPDC1B蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、 天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與DEPDC1B的DNA雜交的DNA所編碼的蛋 白質(zhì)。
[0040] 優(yōu)選地，DEPDC1B蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：
[0041] (1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0042] (2)將SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，較佳地1-30 個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)。
[0043] (3)與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又稱為序列同一性）， 更優(yōu)選地，與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多膚。
[0044] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述DEPDC1B蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸 序列的蛋白質(zhì)。
[0045] 通常，已知的是，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0046] 通過添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是DEPDC1B蛋白的融 合蛋白。對(duì)于與DEPDC1B蛋白融合的膚或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留 DEPDC1B蛋白的生物學(xué)活性即可。
[0047] 本發(fā)明的DEPDC1B蛋白也包括對(duì)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只 要經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留DEPDC1B蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類修飾蛋白質(zhì)中 突變的氨基酸數(shù)目通常是10個(gè)或者更少，例如6個(gè)或者更少，例如3個(gè)或者更少。
[004引在本發(fā)明的上下文中，"診斷食管癌"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有食管癌、也 包括判斷受試者是否存在患有食管癌的風(fēng)險(xiǎn)。
[0049] 在本發(fā)明的上下文中，"治療食管癌"從疾病的狀態(tài)變化來分，可W包括疾病的緩 解、疾病的完全治愈，還包括用于評(píng)價(jià)疾病的治療效果。
[0050] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0051] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了DEPDC1B基因表達(dá)與食管癌相關(guān)，通過檢測(cè)受試者組織中 DEPDC1B的表達(dá)，可W判斷受試者是否患有食管癌、或者判斷受試者是否存在患有食管癌的 風(fēng)險(xiǎn)，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。
[0052] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標(biāo)記物-DEPDC1B基因，相比傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，基因診 斷更及時(shí)、更特異、更靈敏，能夠?qū)崿F(xiàn)食管癌的早期診斷，從而降低食管癌的死亡率。
【附圖說明】
[0053]圖I顯示利用基因忍片檢測(cè)DEPDCIB基因在食管癌組織與正常組織中的表達(dá)情況； [0化4] 圖2顯示利用Western blot檢測(cè)DEPDC1B蛋白在食管癌組織與正常組織中的表達(dá) 情況；
[0055 ] 圖3顯示利用QPCR檢測(cè)S i RNA對(duì)DEPDC1B基因的干擾效率；
[0化6] 圖4顯示利用Western blot檢測(cè)SiRNA對(duì)DEPDC1B蛋白表達(dá)的影響；
[0057]圖5顯示抑制DEPDC1B蛋白功能對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響。
[005引具體的實(shí)施方式
[0059] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。W下實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York = Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0060] 實(shí)施例1 DEPDC1B基因的差異表達(dá)
[0061] 1、實(shí)驗(yàn)材料；
[0062] 食管癌組織為醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的標(biāo)本，正常食管組織為胃鏡室鏡下取出的標(biāo) 本，手術(shù)切除的食管腫瘤組織離體后立即取材，取材時(shí)均佩戴一次性無菌手套，應(yīng)用高壓滅 菌的手術(shù)刀片切取。
[0063] 所有病例均經(jīng)病理確診。包括食管癌組織40例，正常食管組織30例。其中食管鱗癌 34例，食管腺癌6例。W正常食管組織作為對(duì)照組。所有患者術(shù)前均病理證實(shí)，術(shù)前均未行放 療、化療等治療，且無其他部位的腫瘤等。所有組織均在手術(shù)半小時(shí)內(nèi)液氮保存后，移入-80 度冰箱凍存。
[0064] 2、組織RNA的高密度人類基因表達(dá)譜忍片分析
[0065] 依托博奧生物公司提供的基因忍片分析平臺(tái)的技術(shù)服務(wù)，選擇AFFX人類基因組表 達(dá)譜忍片(AFFX Human Genome U133Plus2.OArray,Affimetrix公司），完成了RNA標(biāo)本的基 因忍片篩查分析，其工作原理及全部操作流程參照該公司常規(guī)的基因忍片分析方法，主要 細(xì)節(jié)如下：
[0066] 2.1組織RNA樣品的制備
[0067] 利用RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit,Qiagen公司）制備組織RNA，保存于超低溫 冰箱-80°C;
[0068] 2.2取W上人類基因組表達(dá)譜忍片與組織RNA進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)；
[0069] 2.3利用LuxScanlOKA雙通道激光掃描儀，對(duì)雜交后的基因忍片進(jìn)行掃描分析；
[0070] 2.4利用SAM軟件，并W正常食管組織為對(duì)照，對(duì)食管癌組織的忍片掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行 處理與統(tǒng)計(jì)分析，其聚類分析(gene cluster analysis);
[0071] 2.5W兩倍異常絕對(duì)值差異作為量化比較的界限，獲得食管癌組織與正常食管組 織之間差異表達(dá)候選基因；
[007^ 3、結(jié)果
[0073] 結(jié)果如圖1所示，與正常食管組織相比，食管癌組織中DEPDC1B基因的mRNA水平顯 著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇. 05)。
[0074] 實(shí)施例2 DEPDC1B蛋白的差異表達(dá) [00巧]1、研究對(duì)象同實(shí)施例1。
[0076] 2、組織總蛋白的提取
[0077] 按照化i如化全細(xì)胞/組織蛋白提取試劑盒的說明書進(jìn)行蛋白提取的操作。
[0078] 3、Weste;rn blot檢測(cè)
[0079] 總蛋白用化andford法定量，取適量與樣品緩沖液混合煮沸5min，冷卻5min;取 30pg蛋白上樣到制備好的15%聚丙締酷胺凝膠，進(jìn)行電泳，開始設(shè)為80V恒壓，看見Marker 后增加至120V;將電泳后的膠取出，使用Bio.Rad半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)于IOOV轉(zhuǎn)移50min;轉(zhuǎn)膜完畢 后，用IxPBS洗一次，浸入封閉液，40°C過夜;倒掉封閉液，加入Western洗涂液洗涂5-lOmin， 加入一抗搖床室溫雜交化;按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋于封閉緩沖液中，解育 60min;洗膜液洗3次，每次IOmin;使用E化試劑顯影、定影檢測(cè)蛋白表達(dá)。
[0080] 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0081 ]將蛋白條帶的灰度值使用Image J軟件進(jìn)行分析，We-actin為內(nèi)參，將DEPDC1B蛋 白條帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。
[00劇 5、結(jié)果
[0083] 結(jié)果如圖2所示，與正常食管組織相比，食管癌組織中DEPDC1B蛋白的表達(dá)水平顯 著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇. 05)。
[0084] 實(shí)施例3抑制DEPDC1B基因表達(dá)
[0085] UsiRNA設(shè)計(jì)合成
[00化]針對(duì)DEPDC1B的SiRNA序列：
[0087] SiRNAl-DEPDClB:
[008引 正義鏈為5'-UGGAAAUUUAAUAACAUCCUU-3'（沈Q ID N0.7);
[0089] 反義鏈為5'-GGAUGUUAUUAAAUUUCCAGA-3'（沈Q ID N0.8)，
[0090] siRNA2-DEPDClB：
[0091] 正義鏈為5'-AUAAGUGACGAUUGUCUUCAA-3'（沈Q ID N0.9);
[0092] 反義鏈為5'-GAAGACAAUCGUCACUUAUAC-3'（SEQ ID N0.10)，
[0093] siRNA3-DEPDClB：
[0094] 正義鏈為5'-UGAACUUCGAAUUGACAAGUU-3'（沈Q ID NO.ll);
[0095] 反義鏈為5'-CUUGUCAAUUCGAAGUUCAUC-3'（SEQ ID N0.12)
[0096] W上S i RNA序列與陰性對(duì)照S iRNA序列（S i RNA-NC)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司 提供。
[0097] 2、食管癌細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 [009引 2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0099] 食管癌細(xì)胞系ECA109接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中、將其放置于37 °C、5 % CO播養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)80 %融合時(shí)，用0.化％膜蛋白酶消化傳代。
[0100] 2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0101 ]將食管癌細(xì)胞按1 X 10^孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中細(xì) 胞培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購自于Invitrogen公司）的說明書轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分 為、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(2化M)，其中，陰性對(duì)照組SiRNA與DEPDC1B基因的序列無同源性， 濃度為20nM/孔，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染。
[0102] 2、利用QPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)S iRNA的干擾效率。
[0103] 2.1提取細(xì)胞總RNA利用常規(guī)方法進(jìn)行操作。
[0104] 2.2逆轉(zhuǎn)錄
[0105] 利用TAKARA公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄。
[0106] 2.3QPCR
[0107] 采用反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行管。配制W下反應(yīng)體系：SYBR Green聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5iil，正向引物(5測(cè)）化1，反向引物(5iiM)化1，模板CDNA 2.化1，無酶 水8.扣1;擴(kuò)增DEPDCIB基因的正向引物序列為5'-GATTACTATGGTCACTTG-3'（沈Q ID NO.3)， 反向引物序列為5'-CATCATCCTCATCAATAG-3'（SEQ ID NO.4);擴(kuò)增GAPDH基因的正向引物序 列為5'-4446661^41^41'(：1'(：16-3'（569 10則.5)，反向引物序列為5'-GCTGTTGTCATACTTCTC-3 '（沈Q ID NO. 6)，各項(xiàng)操作均于冰上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C5min， (95°C10s，60°C60s)*45個(gè)循環(huán)。WSYBR Green作為巧光標(biāo)記物，在Li曲t切cler巧光實(shí)時(shí) 定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，A A CT法進(jìn)行相對(duì)定 量。
[010引 2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0109] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，干擾DEPDC1B基因表達(dá)組與對(duì)照組之間的差異 采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0110] 2.5 結(jié)果
[0111] 結(jié)果如圖 3所示，與siRNA2-DEPDClB、siRNA3-DEPDClB相比，SiRNAl-DEPDClB能夠 更有效的抑制DEPDC1B基因的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，使用SiRNAl-DEPDClB進(jìn) 行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
[0112] 3、Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SiRNAl-DEPDClB的干擾效率
[0113] 步驟同實(shí)施例2。
[0114] 結(jié)果如圖4所示，與轉(zhuǎn)染SiRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染SiRNAl-DEPDClB的細(xì)胞中DEPDC1B 蛋白的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇.05)。
[0115] 實(shí)施例4 DEPDC1B基因的表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖能力的測(cè)定 [0116] 使用Cell Counting kit-8(cck-8)試劑盒用于檢測(cè)食管癌細(xì)胞增殖
[0117] 1、步驟
[0118] 按照前面實(shí)施例的方法進(jìn)行食管癌細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，細(xì)胞分為二個(gè)實(shí)驗(yàn)組：
[0119] 組1:轉(zhuǎn)染SiRNA-NC細(xì)胞組；
[0120] 組2:轉(zhuǎn)染SiRNAl-DEPDClB 細(xì)胞組。
[0121] 轉(zhuǎn)染2地后，W2.5 X lOVml密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)=復(fù) 孔，每孔加入IOyl的CCK-8溶液，37°C，5 %C〇2培養(yǎng)箱中解育4h;然后按照試劑盒說明，選擇 450nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度值(OD值）。
[0122] 2、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0123] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0124] 3、結(jié)果
[01巧]結(jié)果如表1所示，與轉(zhuǎn)染SiRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染SiRNAl-DEPDClB細(xì)胞組細(xì)胞增殖緩 慢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DEPDC1B基因表達(dá)促進(jìn)了食管癌細(xì) 胞的增殖。
[01%]表1食管癌細(xì)胞OD值 「A4 〇-7l LUUB」 頭砸例b嘗昔絕細(xì)M沉體甲W頭粒
[0129] 1、步驟：
[0130] 將食管癌細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2*103個(gè)細(xì)胞/孔/200iU，細(xì)胞貼壁 后進(jìn)行如下處理：
[0131] 實(shí)驗(yàn)組1(對(duì)照組）：食管癌細(xì)胞中加入無關(guān)單抗(1:50);
[0132] 實(shí)驗(yàn)組2:食管癌細(xì)胞中加入抗人DEPDC1B單抗(1:50)。
[0133] 將細(xì)胞在37°C、5%C02培養(yǎng)箱解育24小時(shí)后，加入化-TdRQ此i/孔），再培養(yǎng)24小 時(shí)，收集細(xì)胞，加液體閃爍液，的十?dāng)?shù)儀檢測(cè)cpm值。
[0134] 2、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0135] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0136] 3、結(jié)果
[0137] 結(jié)果如圖5所示，相比于對(duì)照組，加入抗人DEPDC1B單抗的細(xì)胞組細(xì)胞增殖減緩。上 述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制DEPDC1B蛋白的功能可W抑制食管癌細(xì)胞增殖。
[0138] 上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，運(yùn)些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)DEPDC1B基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷食管癌的工具中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括:通過RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、 免疫檢測(cè)、原位雜交、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)DEPDC1B基因表達(dá)以診斷食管癌的產(chǎn)品； 所述用RT-PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增DEPDC1B基因的引物;所述用實(shí)時(shí) 定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增DETOC1B基因的引物;所述用免疫檢測(cè)診 斷食管癌的產(chǎn)品包括:與DETOC1B蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診斷食管癌的產(chǎn) 品包括：與DEPDC1B基因的核酸序列雜交的探針;所述用芯片診斷食管癌的產(chǎn)品包括:蛋白 芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與DETOC1B蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與 DEPDC1B基因的核酸序列雜交的探針。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至 少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增DEroClB基因的引物如SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示。4. 一種診斷食管癌的工具，其特征在于，所述工具包括檢測(cè)DEPDC1B基因表達(dá)的試劑； 所述試劑包括檢測(cè)DEPDC1B基因 mRNA的引物和/或探針、檢測(cè)DEPDC1B蛋白的抗體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的工具，其特征在于，所述檢測(cè)DETOC1B基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物對(duì)。 6. DEPDC1B基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑在制備治療食管癌的藥物中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制劑包括抑制DEPDC1B基因表達(dá)的 試劑、和/或抑制DETOC1B基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制DEPDC1B基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包 括抑制針對(duì)DETOC1B基因的s iRNA、和/或DETOC1B蛋白的抗體。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述針對(duì)DEPDC1B基因的siRNA序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。10. -種用于治療食管癌的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)所述的抑制劑。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK105838797SQ201610274305
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年4月28日
【發(fā)明人】楊承剛, 肖楓, 宋宏濤
【申請(qǐng)人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司