一種基于微球和微柱陣列芯片的乳滴數(shù)字pcr定量方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于微球和微柱陣列芯片的乳滴數(shù)字PCR定量方法，包括：(1)制備微柱陣列芯片；(2)抽取表面修飾鏈霉親和素的聚苯乙烯微球，稀釋后分步加入到目標(biāo)磁珠的懸濁液中孵育，富集微球磁珠復(fù)合物，重懸；(3)取步驟(2)中的微球磁珠復(fù)合物的重懸液，通入到裝置中沖洗，通過統(tǒng)計芯片上截留的微球磁珠復(fù)合物，得到目標(biāo)磁珠的個數(shù)，從而達(dá)到對核酸高靈敏定量的目的。本發(fā)明芯片組裝簡單，成本低；在保留了BEAMing實(shí)驗(yàn)高靈敏度特點(diǎn)的同時使得BEAMing技術(shù)的目標(biāo)磁珠計數(shù)方法更加方便易行，為核酸的高靈敏檢測提供了一個簡便、快速的實(shí)用工具。
【專利說明】
一種基于微球和微柱陣列芯片的乳滴數(shù)字PCR定量方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于乳滴數(shù)字PCR領(lǐng)域，特別涉及一種基于微球和微柱陣列芯片的乳滴數(shù) 字PCR定量方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR反應(yīng))是現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的核心技術(shù)，其特異性擴(kuò)增目 的核酸片段的方法提高了核酸分子檢測的靈敏度，在諸多生物研究和疾病診斷中起著重要 的作用。根據(jù)PCR反應(yīng)擴(kuò)增原理衍生出了許多核酸定量技術(shù)，其中BEAMing(beads， emulsion,amplification,and magnetics)是一種基于磁珠固相擴(kuò)增的乳滴數(shù)字PCR技術(shù) [D.Dressman,H.Yan,G.Traverso,et.al.,Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2003，100:8817- 8822]。其基本流程是將修飾有引物的磁珠和單個靶標(biāo)分子單獨(dú)包裹在一個油包水腔體中， 靶標(biāo)分子在磁珠表面進(jìn)行復(fù)制，之后對乳滴破乳，收集磁珠并與統(tǒng)計有核酸擴(kuò)增的磁珠個 數(shù)。通過擴(kuò)增反應(yīng)，BEAMing可以將單個靶標(biāo)分子轉(zhuǎn)化為單個磁珠表面上的上萬個靶標(biāo)分子 拷貝，放大了靶標(biāo)分子的信號。由于單個靶標(biāo)分子僅在一個磁珠表面進(jìn)行擴(kuò)增，一個目標(biāo)磁 珠對應(yīng)一個靶標(biāo)分子拷貝，檢測目標(biāo)磁珠個數(shù)就可以了解溶液中靶標(biāo)分子的拷貝數(shù) [F.Diehl，M.Li，Y.He，et al.,BEAMing:single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions [J] .Nature Methods，2006，3:551_559 · ]DBEAMing 實(shí)驗(yàn)中的乳液 可以在普通的PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出的目的產(chǎn)物可以分離提純回收，因此在實(shí)驗(yàn)上更加 靈活和方便。
[0003]目前，BEAMing技術(shù)已被用于突變和mRNA等核酸片段的定量檢測[X.Shi，C.Tang， ff.ffang,et al.,Digital quantification of gene expression using emulsion PCR [J]·Electrophoresis，2010,31:528-534.]、[Y.Tong，W·Zhu，X·Huang，et al·，PCR amplification from single DNA molecules on magnetic beads in emulsion: application for high-throughput screening of transcription factor targets[J] .Nucleic Acids Research，2005,33(17):150.]、[I.Ti emann-Boege，C·Curt i s， D.N.Shinde,et al.,Product length,dye choice,and detection chemistry in the bead-emulsion amplification of millions of single DNA molecules in parallel [J] .Analytical Chemistry，2009,81(14) :5770-5776.]，由于BEAMing技術(shù)所用的磁珠直 徑通常在3μπι以下，且數(shù)量很大。對信號磁珠的計數(shù)是BEAMing技術(shù)中的一個關(guān)鍵步驟。流式 細(xì)胞技術(shù)是BEAMing常用的計數(shù)方法，然而昂貴的儀器和試劑限制了該技術(shù)的推廣^有研究 將磁珠分散在聚丙稀酰胺凝膠中制成磁珠陣列用于人工計數(shù)[J. Boulanger，L.Muresan， I.Tiemann-Boege,Massively parallel haplotyping on microscopic beads for the high-throughput phase analysis of single molecules[J]. Summaries of Technical Papers of Annual Meeting Architectural Institute of Japan D Environmental Engineering，2012，7(4): 292-294.]，然而隨機(jī)的磁珠排列以及有限的顯微鏡視野也對計 數(shù)造成了不便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于微球和微柱陣列芯片的乳滴數(shù)字PCR 定量方法，該方法芯片組裝簡單，成本低;在保留了 BEAMing實(shí)驗(yàn)高靈敏度特點(diǎn)的同時使得 BEAMing技術(shù)的目標(biāo)磁珠計數(shù)方法更加方便易行，為核酸的高靈敏檢測提供了一個簡便、快 速的實(shí)用工具。
[0005] 本發(fā)明的一種基于微球和微柱陣列芯片的乳滴數(shù)字PCR定量方法，包括：
[0006] (1)將硅片清洗、涂膠后采用深反應(yīng)離子刻蝕在硅片上刻蝕出微柱陣列，微柱陣列 之間的間距隨行數(shù)減小，采用等離子去膠工藝去除殘膠后得到硅片模具;將硅片模具硅烷 化，將配制好的PDMS澆筑在硅片模具上，PDMS加熱固化后剝離即得到微柱陣列芯片；
[0007] (2)抽取表面修飾鏈霉親和素的聚苯乙烯微球，稀釋后分步加入到BEAMing實(shí)驗(yàn)中 生物素修飾的目標(biāo)磁珠的懸濁液中孵育，富集微球磁珠復(fù)合物，重懸；
[0008] (3)取步驟(2)中的微球磁珠復(fù)合物的重懸液，通入到微柱陣列芯片中沖洗，通過 統(tǒng)計芯片上截留的微球磁珠復(fù)合物，得到目標(biāo)磁珠的個數(shù)。
[0009] 所述步驟(1)中的清洗為采用體積比10:1的出5〇4/出02清洗溶液清洗。
[0010] 所述步驟(1)中微井陣列之間的間距變化范圍為50~6μπι。
[0011] 所述步驟(2)中聚苯乙烯微球的直徑比微柱陣列最小間距大，目標(biāo)磁珠的直徑比 微柱陣列最小間距小。
[0012] 所述步驟(2)中的重懸為采用PBST溶液重懸。
[0013] 所述PBST溶液的組成為pH 7.4的PBS溶液和0.01 % Tween 20。
[0014] 所述步驟(3)中的沖洗為采用PBST溶液沖洗。
[0015]本發(fā)明包括了由微柱陣列芯片設(shè)計制備及表面修飾鏈霉親和素的聚苯乙烯微球 的分離和計數(shù)。通過表面修飾鏈霉親和素的聚苯乙烯微球捕獲BEAMing實(shí)驗(yàn)中生物素修飾 的目標(biāo)磁珠，利用磁場將微球磁珠復(fù)合物富集并和游離微球分離，然后利用微柱陣列芯片 攔截微球磁珠復(fù)合物，可以方便地達(dá)到統(tǒng)計磁珠數(shù)量的目的。微柱陣列芯片采用基于微球 尺寸和微柱間尺寸差異的攔截原理，而規(guī)則的內(nèi)部結(jié)構(gòu)降低了后期軟件統(tǒng)計微球數(shù)量的難 度。鏈霉親和素(Streptavidin，SA)修飾微球在溶液中具有較好的分散性，可以有效結(jié)合一 端帶有生物素的目標(biāo)磁珠，形成復(fù)合物。磁鐵可以有效分離磁珠微球復(fù)合物和游離微球。微 柱陣列芯片的孔徑可以攔截微球?yàn)V過多余磁珠，同時規(guī)則的排列有利于后續(xù)的統(tǒng)計。本發(fā) 明降低了 BEAMing檢測計數(shù)的成本，提高了檢測效率。
[0016] 有益效果
[0017] (1)本發(fā)明計數(shù)簡單，微球與磁珠充分結(jié)合，每個微球上具有相對固定的磁珠吸附 量，只要統(tǒng)計微球數(shù)便可知道整個溶液中磁珠數(shù)量的大致范圍；微柱陣列的規(guī)則排布降低 了統(tǒng)計微球的難度，便于未來軟件自動化計數(shù)；
[0018] (2)BEAMing具有乳滴PCR多反應(yīng)腔的特點(diǎn)，可以很容易達(dá)到幾十萬級甚至百萬級 的反應(yīng)腔數(shù)，同時又不增加實(shí)驗(yàn)操作難度；
[0019] (3)根據(jù)檢測要求和通量的不同，還可以增加微柱數(shù)和芯片面積，改變微球直徑大 小參數(shù)和微柱間距等，并且可以對微球進(jìn)行不同基團(tuán)修飾，做到多重檢測；
[0020] (4)本發(fā)明檢測成本低，制備操作簡單，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明微柱陣列芯片內(nèi)部的示意圖；
[0022]圖2為本發(fā)明微柱陣列芯片攔截微球的示意圖；
[0023]圖3為微乳滴與磁珠分布不意圖；
[0024] 圖4為上清液和沉淀中微球形態(tài);其中，左圖為上清液中的微球，右圖為磁珠微球 復(fù)合物；
[0025] 圖5為不同模板濃度溶液樣本的芯片攔截結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 1 · 1 BEAMing 實(shí)驗(yàn)
[0029] 本實(shí)施例的引物序列如表1所示。引物1的5 '端帶有雙生物素基團(tuán)修飾，可以穩(wěn)定 地結(jié)合在磁珠表面且不會在后續(xù)熱循環(huán)反應(yīng)中脫離，將SA修飾磁珠 Dynabeads M_270(美國 Invitrogen公司）與引物 1 在結(jié)合緩沖液(5mM pH 7.5Tris-HCl，0.5mM EDTA，1M NaCl)中室 溫孵育15min，過量的引物1可以保證磁珠表面SA位點(diǎn)飽和。之后利用磁場富集磁珠并用重 懸液(20mM pH 8.4Tris-HCl，50mM KC1)清洗三次，最后用重懸液重懸。反應(yīng)油乳混合液由 7% (wt/vol )ABIL WE09(德國Evonik Degussa公司），20% (vol/vol)礦物油（美國Sigma公 司）和73% (vol/vol)Tegosoft DEC(德國Evonik Degussa公司）組成。反應(yīng)預(yù)混液成分(40μ L體系）如表2所示。在一個1.5mL離心管中依次加入一顆5mm鋼珠，油乳混合液和反應(yīng)預(yù)混 液，蓋緊管蓋放入Tissuelyser-24全自動樣品研磨儀(上海凈信科技公司）中振蕩形成油包 水液滴體系。擴(kuò)增反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)PCR儀（日本Takara公司）中進(jìn)行，反應(yīng)條件包括:94°C2min熱 啟動激活酶活性，98°C15s變性，60°C45s退火，72°C75s延伸，共45個從變性到延伸循環(huán)進(jìn)行 DNA擴(kuò)增。擴(kuò)增完成之后，取出PCR反應(yīng)管，收集乳液至1.5mL離心管中，加入破乳緩沖液 (10mM Tris-HCl(pH 7.5)，l%Triton-X 100，l%SDS，100mM NaCl，lmM EDTA)，充分振蕩混 勾后放入離心機(jī)(德國Eppendof公司）中3200g離心3min，吸去上層油相之后重復(fù)以上步驟 一次。富集磁珠，移除管內(nèi)液體后加入結(jié)合緩沖液重懸。至此帶有目標(biāo)核酸拷貝信息的磁珠 制備完畢。
[0030] 表1引物序列
[0031]

[0032] 表2反應(yīng)預(yù)混液成分
[0033]
[0034] 1.2微柱陣列芯片制作
[0035]微柱陣列芯片制作包括兩個部分:硅片模具的制作和PDMS模具的制作。
[0036] 1.2.1硅片模具的制作
[0037] 將硅片置于煮沸的清洗溶液(H2S〇4: H202 = 10 :1 )中不斷晃動浸泡lOmin。取出硅 片，放入去離子水清洗腔中噴淋清洗并甩干。將LC100A正膠旋均勻涂在清洗后的硅片上。涂 完后前烘，去除光刻膠中的水分，增大膠與硅片表面的粘附性，然后利用曝光顯影工藝，將 掩膜版上的圖案轉(zhuǎn)移到光刻膠上，暴露出硅片上被刻蝕的部分。利用深反應(yīng)離子刻蝕 (DRIE)在硅片上刻蝕出一系列的微柱陣列，微柱之間的間距隨著行數(shù)不斷減小，變化范圍 為50~6μπι，最后用等離子去膠工藝去除殘膠。至此，硅片模具制作完成。
[0038] 1.2.2 PDMS模具的制作
[0039]對制作好硅片模具硅烷化，然后取PDMS預(yù)聚體和固化劑按10:1的比例配制PDMS。 將配制好的PDMS澆筑在硅片模具上，靜置1~2h，90 °C加熱lh。待PDMS完全固化后剝離，微井 陣列轉(zhuǎn)化為微柱陣列，然后用藍(lán)膜包覆，手動切割打孔。最后將載玻片與芯片通過等離子體 鍵合。至此芯片組裝完成。
[0040] 1.3聚苯乙烯微球表面修飾鏈霉親和素(市售）
[0041 ] 1.4檢測流程
[0042] 抽取SA修飾微球，用結(jié)合緩沖液稀釋，分五次逐步加入到制備好的磁珠懸濁液中 充分吹打，放在恒溫震蕩儀中孵育30min，隨后6000rpm離心5min，吸去上清液。加入TOST溶 液(pH 7.4PBS溶液，0.01 %Tween 20)重懸，吹打混勻。富集磁珠，吸去上清液。用PBST溶液 重懸。
[0043] 微柱陣列芯片進(jìn)樣過程采取負(fù)壓進(jìn)樣，利用進(jìn)樣儀將PBST溶液通入到裝置中，以 10mL/h的速率沖洗裝置。取微球和磁珠 TOST重懸液，用TOST溶液重懸，通入到裝置中?；旌?液進(jìn)樣完成后，用PBST沖洗裝置兩次。為了防止進(jìn)樣過程氣體混入，導(dǎo)致混合液在裝置內(nèi)分 布不均，每一步的液體選擇在前一步即將完成時加入。最后的沖洗可以先放到顯微鏡下觀 察，若有磁珠殘留，則可以增加沖洗次數(shù)。
[0044] 2結(jié)果討論
[0045] 2.1檢測原理
[0046] 本方法選用直徑為2.8μπι的表面修飾有SA的Dynabeads M-270磁珠作為擴(kuò)增反應(yīng) 的固相載體，并與過量的帶雙生物素基團(tuán)的引物1飽和結(jié)合。由于磁珠的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于待檢 測核酸分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布可以很容易使單個磁珠與祀標(biāo)分子共存在一個微乳滴液 腔中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。預(yù)混液中的帶生物素的引物2參與靶標(biāo)分子的擴(kuò)增使目標(biāo)磁珠上帶上 生物素，引物3的存在提高了磁珠表面目標(biāo)分子的擴(kuò)增效率。SA修飾聚苯乙烯微球可以有效 地捕獲目標(biāo)磁珠，緩慢加入微球可以使微球充分與目標(biāo)磁珠結(jié)合。故磁珠微球復(fù)合物會隨 著磁珠一起在磁場下富集，游離微球則隨著上清液一起吸除。微球直徑為l〇ym，設(shè)計的微柱 陣列間距最小為6μπι。微球與擴(kuò)增磁珠的復(fù)合物會因尺寸大而被截留在通道內(nèi)（圖2)，游離 的磁珠則會隨著液體流出芯片。通過統(tǒng)計芯片上截留下來的微球，就可以知道溶液中目標(biāo) 磁珠大致個數(shù)。
[0047] 2.2乳液的熱穩(wěn)定性及試劑配比
[0048] 乳液熱穩(wěn)定性是PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)很重要的一個因素，分別在熱循環(huán)前和熱循環(huán)后吸 取0.5yL乳液平鋪在載玻片中，倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司)400 X倍數(shù)觀察，如圖3所示， 乳滴在熱循環(huán)前后的狀態(tài)沒有發(fā)生變化，其分散性和均勻性良好，說明該乳液具有良好的 熱穩(wěn)定性。
[0049] 2.3定量結(jié)果分析
[0050] 實(shí)驗(yàn)采用分步多次加入微球的方法來保證SA微球能與目標(biāo)磁珠充分結(jié)合，在本實(shí) 驗(yàn)中每一步加入的微球數(shù)量約在500個左右，其具體加入的數(shù)量亦可根據(jù)實(shí)際情況做調(diào)整。 充分孵育之后，利用磁鐵聚集磁珠，吸取上清液放置在顯微鏡下觀察，上清中的微球如圖4 左圖所示，說明加入的微球總量已足夠完全捕獲磁珠。圖4右圖所示與磁珠微球復(fù)合物由于 磁場富集作用聚集在管底，游離微球則與上清液一起分離。
[0051] 為了驗(yàn)證該方法的可行性，選取了一段長度為66bp的CDNA片段作為檢測標(biāo)的。將 含有該序列的cDNA溶液按兩倍梯度稀釋之后分別用該方法對這三個溶液樣本進(jìn)行了檢測， 并做了空白對照實(shí)驗(yàn)，圖5為芯片中截取部分微球攔截結(jié)果。三張芯片共分別截取到287個， 148個和85個微球，轉(zhuǎn)化為核酸拷貝數(shù)約為5740，2960和1700個拷貝，而空白對照試驗(yàn)無微 球截獲。該結(jié)果與稀釋倍數(shù)相對照呈現(xiàn)了較好的線性關(guān)系，表明本方法具有可行性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于微球和微柱陣列芯片的乳滴數(shù)字PCR定量方法，包括： (1) 將硅片清洗、涂膠后采用深反應(yīng)離子刻蝕在硅片上刻蝕出微柱陣列，微柱陣列之間 的間距隨行數(shù)減小，采用等離子去膠工藝去除殘膠后得到硅片模具;將硅片模具硅烷化，將 配制好的PDMS澆筑在硅片模具上，PDMS加熱固化后剝離即得到微柱陣列芯片； (2) 抽取表面修飾鏈霉親和素的聚苯乙烯微球，稀釋后分步加入到BEAMing實(shí)驗(yàn)中生物 素修飾的目標(biāo)磁珠的懸濁液中孵育，富集微球磁珠復(fù)合物，重懸； (3) 取步驟(2)中的微球磁珠復(fù)合物的重懸液，通入到微柱陣列芯片中沖洗，通過統(tǒng)計 芯片上截留的微球磁珠復(fù)合物，得到目標(biāo)磁珠的個數(shù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于微球和微柱陣列芯片的乳滴數(shù)字PCR定量方法，其特 征在于:所述步驟(1)中的清洗為采用體積比10:1的出50 4/出02清洗溶液清洗。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于微球和微柱陣列芯片的乳滴數(shù)字PCR定量方法，其特 征在于:所述步驟(1)中微井陣列之間的間距變化范圍為50~6μπι。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于微球和微柱陣列芯片的乳滴數(shù)字PCR定量方法，其特 征在于:所述步驟(2)中聚苯乙烯微球的直徑比微柱陣列最小間距大，目標(biāo)磁珠的直徑比微 柱陣列最小間距小。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于微球和微柱陣列芯片的乳滴數(shù)字PCR定量方法，其特 征在于:所述步驟(2)中的重懸為采用PBST溶液重懸。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種基于微球和微柱陣列芯片的乳滴數(shù)字PCR定量方法，其特 征在于:所述PBST溶液的組成為pH 7.4的PBS溶液和0.01 % Tween 20。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于微球和微柱陣列芯片的乳滴數(shù)字PCR定量方法，其特 征在于:所述步驟(3)中的沖洗為采用PBST溶液沖洗。
【文檔編號】C12Q1/68GK105838801SQ201610297439
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月6日
【發(fā)明人】毛紅菊, 程祖樂, 王琨, 夏文薇, 金慶輝, 趙建龍
【申請人】中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所