一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光pcr引物、探針及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光PCR引物、探針及方法。該方法結(jié)合了實(shí)時熒光PCR技術(shù)及熔解曲線分析技術(shù)，根據(jù)熔解曲線峰型及Tm值差異鑒定犬細(xì)小病毒疫苗與野毒株；操作簡單：只需一個反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)三種基因型野毒株及兩種疫苗與的鑒別檢測；檢測速度快且高通量：全部操作過程不需3小時，不需要病毒的細(xì)胞培養(yǎng)，極大縮短了病毒三種不同基因型及兩種疫苗與野毒株的鑒別檢測所需時間；準(zhǔn)確性高、特異性好，重復(fù)性好，可以準(zhǔn)確、快速、高通量地進(jìn)行分析，有利于在臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
【專利說明】
一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色焚光PGR引物、探針及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及病毒疫苗毒與野毒株的鑒別方法，具體涉及一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光檢測方法和試劑盒，該方法是一種基于兩條雙標(biāo)記自猝滅探針的探針熔解曲線分析技術(shù)，用于犬細(xì)小病毒野毒株與疫苗株的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)為單鏈小DNA病毒，是引起犬急性出血性胃腸炎和幼犬急性心肌炎的主要病原。CPV-2在20世紀(jì)70年代后期出現(xiàn)，但在幾年內(nèi)就被新的抗原變異型所取代。目前，國內(nèi)CPV主要流行株為CPV-2a/2b，在2010年，夏咸柱等首次報道了CPV-2c型變異株，2014年Gali Bingga等人通過PCR-HRM方法鑒定出在江蘇某地CPV_2c型變異株在腹瀉犬中的檢出率高達(dá)10%，表明在我國CPV抗原型也在不斷變化。因此，對CPV不同抗原型進(jìn)行基因分型檢測對監(jiān)控該病毒的進(jìn)化和變異有著重要意義。
[0003]而原始型CPV-2基因型已被新出現(xiàn)的上述三種抗原變異型完全取代，僅以弱毒活疫苗的形式用于CPV的防控。目前，國內(nèi)用于預(yù)防犬細(xì)小病毒病的疫苗株主要有:碩騰動物保健品有限公司的四聯(lián)活疫苗-衛(wèi)佳1五(含弱毒活疫苗株NL-35-D株)和英特威國際有限公司的寵必威?尤免康(含弱毒活疫苗株154株)，以上兩個疫苗株均為原始CPV-2型的弱毒株。雖然接種疫苗可預(yù)防犬細(xì)小病毒病的流行，但有報道稱接種犬細(xì)小病毒弱毒活疫苗株的犬依然發(fā)生犬細(xì)小病毒感染發(fā)病的現(xiàn)象。此外，接種疫苗也對疾病的及時準(zhǔn)確診斷帶來了一定的難度，從而影響其疾病治療效果。因此，快速區(qū)分犬細(xì)小病毒的疫苗株和野毒株對疫苗株的安全評價及疾病的快速準(zhǔn)確診斷具有一定的臨床意義。
[0004]傳統(tǒng)的CPV分型方法有病毒分離與鑒定(VI)、血凝抑制試驗(yàn)(HI)、普通PCR方法、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)方法、MGB探針方法、測序和高分辨率熔解曲線(HRM)法等。其中病毒分離與鑒定方法需借助3種不同單克隆抗體才能完成分型，費(fèi)時、費(fèi)力，不易快速鑒別CPV不同亞型;血凝抑制試驗(yàn)方法對CPV病毒滴度要求較高，一般滴度大于1:64才可利用相應(yīng)單克隆抗體來鑒別，而滴度小于I: 32則需通過在MDCK或F81細(xì)胞上擴(kuò)增后方能用單克隆抗體來檢測;PCR方法利用CPV-2b序列引物3末段堿基錯配方式區(qū)分CPV-2a和CPV-2b型，此方法雖然能區(qū)分CPV-2a和CPV-2b，但特異性不高、容易同時擴(kuò)增出兩個基因型，此外，新出現(xiàn)的CPV變異株表明，3末段堿基錯配法保守性差，易受到病毒核酸序列突變影響，因此，普通PCR方法很難對CPV進(jìn)行準(zhǔn)確分型;限制性片段長度多態(tài)性方法能夠區(qū)分CPV-2b和CPV-2c型，但區(qū)分不了CPV-2a和CPV-2b型，因?yàn)镸bo Π酶對CPV_2a和CPV_2b酶切結(jié)果相同，此方法只能在用單克隆抗體確認(rèn)為CPV-2b的前體下才能鑒別CPV-2b和CPV-2c基因型;MGB探針方法雖然能夠區(qū)分CPV不同基因型，但需同時合成兩個或兩個以上探針，價格昂貴，不易在臨床檢測中使用；測序方法雖然準(zhǔn)確率高，但價格偏高、所需時間較長，一般至少要24小時才能完成。上述方法均存在操作復(fù)雜、費(fèi)時、費(fèi)用高等缺點(diǎn)，在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用受限。PCR-HRM分析法可以很好的區(qū)分CPV不同基因型，但由于起始模板濃度及不同批次樣品離子濃度差異，需要進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，且由于CPV-2b和CPV-2c在426位點(diǎn)的較小差異，很難在首輪熔解曲線上直觀區(qū)分，需要進(jìn)行雜交后二次熔解曲線分析，操作相對繁瑣、費(fèi)時(Bingga G,Liu Zj Zhang Jj Zhu Y， Lin Lj Ding S， et al.High resolut1n melting curveanalysis as a new tool for rapid identificat1n of canine parvovirus type 2strains.Mol Cell Probes.2014，28(5): 271-278)。
[0005]區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的傳統(tǒng)的方法有MGB探針方法、測序和高分辨率熔解曲線(HRM)法等。這幾種方法上面已經(jīng)詳細(xì)描述了各自缺點(diǎn)，均存在操作復(fù)雜、費(fèi)時等缺點(diǎn)，在臨床實(shí)踐中的推廣應(yīng)用受限。
[0006]因此，目前急需一種操作相對簡易、檢測結(jié)果可靠且可快速的區(qū)分不同基因型犬細(xì)小病毒，及疫苗株與野毒株的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]為了解決上述存在的問題，本發(fā)明建立了一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光檢測方法，該方法操作簡易、快速、檢測結(jié)果可靠，有利于在臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光檢測的引物及探針。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光檢測方法。
[0010]本發(fā)明的再一目的在于提供一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光檢測試劑盒。
[0011 ]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光PCR引物，其核苷酸序列如下所示:
Fl:5 ’-TATAGCACATCAAGATACAGGAAGA-3'(SEQ ID NO:1)，
Rl:5'-TCCAATTGGATCTGTTGG-3'(SEQ ID NO:2)，
F2:5’-TGGAAATCACAGCAAACTC-3’(SEQ ID NO:4)，
R2:5’-CTAAAGCCATGTTTCCGT-3’(SEQ ID NO:5)。
[0012]—種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光PCR探針，其核苷酸序列如下所示:
探針Pl: 5’- CCTATCATCTTCCTGTAACAAATGATAG -3’(SEQ ID NO: 3)，
探針P2:5’_ CGACCGTAAATAATATGGATAAAACTGCGGTCG -3’(SEQ ID NO:6)。
[0013]進(jìn)一步的，所述探針序列5’端標(biāo)記的熒光基團(tuán)為FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一種，探針序列3 ’端標(biāo)記的淬滅基團(tuán)為TAMRA、MGB、BHQ中一種;且探針PI和P2的5 ’端標(biāo)記的熒光基團(tuán)不相同。
[0014]—種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光PCR試劑盒，該試劑盒中含有上述所述的引物。
[0015]進(jìn)一步的，所述試劑盒中還含有上述所述的探針。
[0016]—種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光PCR方法，包括以下步驟: 1)從樣品中提取病毒DNA；
2)以提取的DNA為模板，用引物對Fl、R1、F2和R2，及探針Pl和探針P2進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；
3)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，確定樣品中的病毒類型。
[0017]進(jìn)一步的，步驟2)中的熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:
CldH2O2.8μ1
Premix Ex-Taq5.Ομ?
ΙμΜ 弓丨物 Fl0.2μ1
ΙΟμΜ 引物Rl0.2μ1
ΙΟμΜ 探針Pl0.2μ1
ΙμΜ 引物 F20.2μ1
ΙΟμΜ 引物 R20.2μ1
ΙΟμΜ 探針Ρ20.2μ1
DNA模板I.Ομ?
總體積10μ1。
[0018]進(jìn)一步的，步驟2)中的熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min;95°C變性15s，50°C退火15s，72°C延伸15s;循環(huán)55次。
[0019]進(jìn)一步的，步驟3)中的熔解曲線分析程序?yàn)?95 °C變性3min; 37 °C退火3min; 45°C到75 °C以0.1°C /s的速率，5次/ 0C連續(xù)采集探針Pl和P2的熒光信號，進(jìn)行熔解曲線分析。
[0020]進(jìn)一步的，步驟3)中所述熔解曲線分析的具體分析過程為:
1)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-pfu熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定樣品中含有犬細(xì)小病毒疫苗株CPV-pfu;
2)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-1nt熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.(TC，且樣品熔解峰基部的開口比陽性野毒株CPV-2a峰型的基部開口寬，且寬4±0.5°C，則判定樣品中含有犬細(xì)小病毒疫苗株CPV-1nt;
3)在引物F1、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2c熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定樣品中含有犬細(xì)小病毒野毒株CPV-2c;
4)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，且在引物Fl、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果中，該樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2b熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定該樣品中含有犬細(xì)小病毒野毒株CPV_2b;
5)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.(TC，且樣品熔解峰基部的開口比陽性野毒株CPV-1nt的基部開口窄，且窄4±0.5°C;同時在引物F1、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果中，該樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2a熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定該樣品中含有犬細(xì)小病毒野毒株CPV_2a。
[0021]本發(fā)明的有益效果是:
I)本發(fā)明首次建立了一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗與野毒株的雙色熒光檢測方法、弓丨物及探針。操作簡單:只需一個反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)三種不同基因型野毒與兩種疫苗株的鑒別檢測;檢測速度快且高通量:全部操作過程不需3小時，不需要病毒的細(xì)胞培養(yǎng)，極大縮短了病毒三種不同基因型野毒株與兩種疫苗株鑒別檢測所需時間；準(zhǔn)確性高、特異性好，重復(fù)性好，可以準(zhǔn)確、快速、高通量地進(jìn)行分析，有利于在臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。
[0022]2)本發(fā)明的PCR引物對F1/R1，對犬細(xì)小病毒CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c可特異性擴(kuò)增，有助于提高PCR的效率，減少病毒鑒別分型的時間。PCR引物對F2/R2，對犬細(xì)小病毒疫苗(包括輝瑞衛(wèi)佳^伍和英特威寵必威β優(yōu)免康)與野毒株可特異性擴(kuò)增，有助于提高PCR的效率，減少病毒鑒別的時間。探針Pl可特異性與犬細(xì)小病毒CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c鑒別位點(diǎn)雜交，特異性較好。探針P2可特異性與犬細(xì)小病毒兩種疫苗與野毒株鑒別位點(diǎn)雜交，特異性較好。引物對Fl/Rl、F2/R2，探針Pl和P2，均不與其他常見犬類腹瀉病毒核酸結(jié)合，有利于提高本發(fā)明對結(jié)果分析的正確性。
[0023]3)本發(fā)明的一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗與野毒株的雙色熒光檢測方法的最低檢測限可達(dá)到單拷貝，靈敏度較高。
【附圖說明】
[0024]圖1為標(biāo)準(zhǔn)化樣品雙色熒光檢測方法熔解曲線圖，其中A為FAM和HEX雙通道同時檢測熔解曲線圖(即B和C圖的疊加)，B和C分別為FAM和HEX單通道分別檢測熔解曲線圖；標(biāo)準(zhǔn)樣品CPV-2a、CPV-2b、CPV_2c、疫苗CPV-1nt、疫苗CPV-pf u、水對照分別重復(fù)三個樣本；
圖2為雙色熒光檢測方法特異性試驗(yàn)熔解曲線圖，其中A為FAM和HEX雙通道同時檢測熔解曲線圖(S卩B和C圖的疊加)，B和C分別為FAM和HEX單通道分別檢測熔解曲線圖；標(biāo)準(zhǔn)樣品 CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、疫苗 CPV-1nt、疫苗 CPV-pfu，及水對照、CDV、CAV-2、CCV、CRV 和CPIV分別重復(fù)三個樣本；
圖3為雙色熒光檢測方法靈敏度試驗(yàn)擴(kuò)增曲線圖和熔解曲線圖，其中A為CPV-2a的FAM和HEX雙通道同時檢測的擴(kuò)增曲線圖，S卩C和D圖中曲線的疊加圖；B為CPV-2a的FAM和HEX雙通道同時檢測的熔解曲線圖，即E和F圖中曲線的疊加圖；C和D分別為FAM單通道和HEX單通道檢測的擴(kuò)增曲線圖$和?分別為FAM單通道和HEX單通道檢測的熔解曲線圖；
圖4為臨床樣品雙色熒光檢測方法熔解曲線圖，其中A為FAM和HEX雙通道同時檢測熔解曲線圖(S卩B和C圖的疊加)，B和C分別為FAM和HEX單通道分別檢測熔解曲線圖；標(biāo)準(zhǔn)樣品CPV-2a、CPV-2b、CPV_2c、疫苗CPV-1nt、疫苗CPV-pf u、水對照分別重復(fù)三個樣本，臨床樣本33個，編號分別為⑶1-3JS1-30，無重復(fù);結(jié)果顯示樣本JSll號為基因型CPV-2a和CPV-2b混合感染樣本，603、界1、133、界5-6、界8-10、邛12-13、邛15-18、邛23-27、邛29共20個樣本為〇卩￥-23基因型，601-2、界2、界7、界19、邛21-22、邛28、界30共9個樣本為0卩￥-213基因型，界4、JS14、JS20共3個樣本為CPV-2c基因型，這33個樣本共34個毒株NCBI登錄號為KJ754509-KJ754542o
【具體實(shí)施方式】
[0025]—種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光PCR引物，其核苷酸序列如下所示:
Fl:5 ’-TATAGCACATCAAGATACAGGAAGA-3'(SEQ ID NO:1)，
Rl:5'-TCCAATTGGATCTGTTGG-3'(SEQ ID NO:2)，F(xiàn)2:5’-TGGAAATCACAGCAAACTC-3’(SEQ ID NO:4)，
R2:5’-CTAAAGCCATGTTTCCGT-3’(SEQ ID NO:5)。
[0026]—種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光PCR探針，其核苷酸序列如下所示:
探針Pl: 5’- CCTATCATCTTCCTGTAACAAATGATAG -3’(SEQ ID NO: 3)，
探針P2:5’_ CGACCGTAAATAATATGGATAAAACTGCGGTCG -3’(SEQ ID NO:6)。
[0027]優(yōu)選的，所述探針序列5 ’端標(biāo)記的熒光基團(tuán)為FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一種，探針序列3 ’端標(biāo)記的淬滅基團(tuán)為TAMRA、MGB、BHQ中一種;且探針PI和P2的5 ’端標(biāo)記的熒光基團(tuán)不相同。
[0028]—種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光PCR試劑盒，該試劑盒中含有上述所述的引物。
[0029]優(yōu)選的，所述試劑盒中還含有上述所述的探針。
[0030]—種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光PCR方法，包括以下步驟:
1)從樣品中提取病毒DNA；
2)以提取的DNA為模板，用引物對Fl、R1、F2和R2，及探針Pl和探針P2進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；
3)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，確定樣品中的病毒類型。
[0031 ]優(yōu)選的，步驟2)中的熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:
CldH2O2.8μ1
Premix Ex-Taq5.Ομ?
ΙμΜ 弓丨物 Fl0.2μ1
ΙΟμΜ 引物Rl0.2μ1
ΙΟμΜ 探針Pl0.2μ1
ΙμΜ 引物 F20.2μ1
ΙΟμΜ 引物 R20.2μ1
ΙΟμΜ 探針Ρ20.2μ1
DNA模板I.Ομ?
總體積10μ1。
[0032]優(yōu)選的，步驟2)中的熒光?0財廣增反應(yīng)程序?yàn)?95°(:預(yù)變性51^11;95°(:變性158，50°C退火15s，72°C延伸15s;循環(huán)55次。
[0033]優(yōu)選的，步驟3)中的熔解曲線分析程序?yàn)?95°C變性3min; 37 °C退火3min; 45°C到75 °C以0.1°C /s的速率，5次/ 0C連續(xù)采集探針Pl和P2的熒光信號，進(jìn)行熔解曲線分析。
[0034]優(yōu)選的，步驟3)中所述熔解曲線分析的具體分析過程為:
1)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-pfu熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定樣品中含有犬細(xì)小病毒疫苗株CPV-pfu;
2)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-1nt熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.(TC，且樣品熔解峰基部的開口比陽性野毒株CPV-2a峰型的基部開口寬，且寬4±0.5°C，則判定樣品中含有犬細(xì)小病毒疫苗株CPV-1nt;
3)在引物F1、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2c熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定樣品中含有犬細(xì)小病毒野毒株CPV-2c;
4)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，且在引物Fl、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果中，該樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2b熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定該樣品中含有犬細(xì)小病毒野毒株CPV_2b;
5)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.(TC，且樣品熔解峰基部的開口比陽性野毒株CPV-1nt的基部開口窄，且窄4±0.5°C;同時在引物F1、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果中，該樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2a熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定該樣品中含有犬細(xì)小病毒野毒株CPV-2a。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0035]實(shí)施例1引物及探針
經(jīng)過對所設(shè)計的大量引物和探針進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)引物對F1/RUF2/R2，及探針Pl和P2對雙色熒光法區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的效果最好，其堿基序列如下所示。
[0036]Fl:5’-TATAGCACATCAAGATACAGGAAGA-3’(SEQ ID N0:1)，
Rl:5'-TCCAATTGGATCTGTTGG-3'(SEQ ID NO:2)，
探針Pl:5’-FAM- CCTATCATCTTCCTGTAACAAATGATAG -BHQ1_3’(SEQ ID NO: 3)，
F2:5’-TGGAAATCACAGCAAACTC-3’(SEQ ID NO:4)，
R2:5’-CTAAAGCCATGTTTCCGT-3’(SEQ ID NO:5)，
探針P2: 5 ’-HEX-CGACCGTAAATAATATGGATAAAACTGCGGTCG-BHQ1-3 '(SEQ ID NO:6)。
[0037]實(shí)施例2標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備、雙色熒光PCR擴(kuò)增及熔解曲線分析
I)犬細(xì)小病毒DNA的提取
分別取感染有CPV的病料樣品，病料樣品可以是全血、糞便、直腸拭子等易于獲得且對動物體無嚴(yán)重傷害的樣品，全血可直接取200μ1備用，糞便和直腸試子需取一定量溶解于ImL PBS鹽酸緩沖溶液中，靜置10-20min后取200μ1備用;CPV疫苗，加入3mL PBS鹽酸緩沖溶液進(jìn)行溶解，取200yL備用。按TAKARA的MiniBEST Viral RNA/DNA Extract1n KitVer.4.0的說明書進(jìn)行核酸提取。
[0038]2)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備
為了驗(yàn)證本發(fā)明方法可行性與可靠性，同時構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品(經(jīng)序列測定正確)，為之后的臨床樣品檢測提供陽性對照，本發(fā)明需優(yōu)先制備犬細(xì)小病毒三個不同基因型的野毒株〇?￥-2&丄?￥-213、0?￥-2(3陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品，以及疫苗株CPV_int、CPV-pfu的陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品。標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟如下:取經(jīng)過測序確定基因型為CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c的野毒株，購買碩騰動物保健品有限公司的四聯(lián)活疫苗-衛(wèi)佳1五，其中含CPV-2弱毒活疫苗株NL-35-D株，命名為CPV-pfu;購買英特威國際有限公司的寵必威M尤免康，其中含CPV-2弱毒活疫苗株154株，命名為CPV-1nt ；分別提取上述野毒株CPV_2a、CPV_2b、CPV_2c，疫苗株CPV-1nt、CPV-Pfu的核酸，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物均為:CPV-1270F: 5 ’ -TGGAAATCACAGCAAA CTC-3 ’ (SEQID N0:7)，CPV-1270R:5’-AGTCTTGGTTTTAAGTCAGTATC-3’(SEQ ID NO:8)。分別回收純化擴(kuò)增的產(chǎn)物，分別100倍稀釋后作為CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、CPV-1nt、CPV-pfu的陽性對照樣品O
[0039]3)陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品的雙色熒光PCR
分別以上述獲得的5種陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品為DNA模板，分別進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)和熔解曲線分析；
PCR反應(yīng)體系:
CldH2O2.8μ1
Premix Ex-Taq5.Ομ?
ΙμΜ 弓丨物 Fl0.2μ1
ΙΟμΜ 引物Rl0.2μ1
ΙΟμΜ 探針Pl0.2μ1
ΙμΜ 引物 F20.2μ1
ΙΟμΜ 引物 R20.2μ1
ΙΟμΜ 探針Ρ20.2μ1
DNA模板I.Ομ?
總體積ΙΟμΙ。
[0040]PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下:
95°C 預(yù)變性 5min;95°C 變性 158，50°(:退火158，72°(:延伸158;循環(huán)55次。
[0041 ]熔解曲線分析程序如下:
95°(:變性3111丨11;37°(:退火31^11;45°(:到75°(:以0.1°(:/8的速率，5次/°(:連續(xù)采集?厶1和HEX熒光信號，進(jìn)行熔解曲線分析。
[0042]4)陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品熔解曲線分析結(jié)果分析
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用LightCycler 96分析儀進(jìn)行分析。犬細(xì)小病毒三種不同基因型野毒株CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c，及疫苗株CPV-1nt、CPV-pf u標(biāo)準(zhǔn)樣品熔解曲線分析結(jié)果如圖1所不O
[0043]圖1C為HEX熒光通道的分析結(jié)果(即引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果)，從中可以看出，疫苗CPV-pf u熔解溫度較高為57.70 ± 0.08°C，CPV-1nt熔解溫度較低為53.1 ± 0.06°C，而3種野毒株(CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c)的熔解溫度最低且?guī)缀踔丿B在一起，均為52.43± 0.13 °C ;且3種野毒株熔解峰基部的開口比CPV-1nt的窄(窄4 ± 0.5°C )，根據(jù)現(xiàn)有信息(Kylie Hewson,Amir H.Noormohammadi et al.Rapid detect1n and non-subjectivecharacterisat 1n of infect1us bronchitis virus isolates using high-resolut1n melt curve analysis and a mathematical model.Arch Virol (2009)154:649-660)，也可將3種野毒株的熔解峰稱為尖銳峰(Sharp Peak)，相對比，CPV-1nt的熔解峰可被稱為寬峰(Broad Peak)。
[0044]圖1C的結(jié)果說明，引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果可以將疫苗株CPV-pfu、CPV-1nt和野毒株區(qū)分開，而不能將3種野毒株CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c作進(jìn)一步的區(qū)分。
[0045]圖1B為FAM熒光通道分析結(jié)果(即引物F1、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果)，從中可以看出，CPV-2a熔解溫度較高為61.38 ± 0.08 °C (但疫苗株CPV-1nt的熔解溫度與其非常接近，難以區(qū)分)<?￥-2(3熔解溫度最低為51.92±0.11°(:，0?￥-213熔解溫度位于兩者之間為55.15±0.37°C (但疫苗株CPV-pfu的熔解溫度與其非常接近，難以區(qū)分)。
[0046]圖1B的結(jié)果說明，引物F1、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果可以將CPV-2a或CPV-1nt、CPV-2b或CPV-pf u、CPV-2c區(qū)分開，而不能將CPV_2a和CPV-1nt作進(jìn)一步的區(qū)分，也不能將〇卩￥-213和0?￥-?如作進(jìn)一步的區(qū)分。
[0047]圖1A為圖1B和圖1C熒光曲線的疊加圖。
[0048]結(jié)合上述圖1C、圖1B和圖1A中的結(jié)果，可獲知:
1)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若熔解溫度為57.70±0.08°C，則為犬細(xì)小病毒疫苗株CPV-pfu;
2)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若熔解溫度為53.1±0.06°C，則為犬細(xì)小病毒疫苗株CPV-1nt，且CPV-1nt熔解峰基部的開口比陽性野毒株CPV_2a的基部開口寬(寬4±0.5°C)，為了更好地描述二者峰型的差異，根據(jù)現(xiàn)有信息，可將野毒株CPV-2a的熔解峰稱為尖銳峰(Sharp Peak)，相對比，CPV-1nt的恪解峰可被稱為寬峰(Broad Peak)。
[0049]3)在引物F1、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果中，若熔解溫度為51.92±0.11°C，則為犬細(xì)小病毒野毒株CPV_2c ；
4)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中的熔解溫度為52.43±0.13°C，且在引物Fl、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果中的熔解溫度為55.15 ±0.37°C，則為犬細(xì)小病毒野毒株CPV-2b；
5)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中的熔解溫度為52.43±0.13°C，且熔解峰基部的開口比陽性野毒株CPV-1nt的基部開口窄(窄4± 0.5°C );同時在引物Fl、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果中的熔解溫度為61.38±0.08°C，則為犬細(xì)小病毒野毒株CPV-2a。
[0050]上述該結(jié)論已通過測序方法得到證實(shí)。
[0051 ]實(shí)施例3特異性實(shí)驗(yàn)
下面對本發(fā)明建立的檢測方法作特異性檢測。
[0052]分別提取其他常見犬腹灣病毒核酸，如提取犬痕熱(Canine distemper virys ,CDV)、犬腺病毒 _2(Canine adenovirys type 2，CAV_2)、犬冠狀病毒(Caninecorona virus , CCV )、犬輪狀病毒(Canine rotavirus，CRV)和犬副流感病毒(Canineparainfluenza virys，CPIV)，將CDV、CCV、CRV和CPIV的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以上面病毒的cDNA、CAV-2的核酸及水分別作為PCR模板，以上述實(shí)施例2中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)和熔解曲線分析方法進(jìn)行分析，并與犬細(xì)小病毒野毒株CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、疫苗株CPV-1nt、CPV-pfu的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行對比分析，熔解曲線峰型化圖如圖2所示。
[0053]從圖2A~C中可以看出，本發(fā)明檢測方法只能特異性擴(kuò)增出犬細(xì)小病毒三種不同基因型野毒株CPV-2a、CPV-2b、CPV_2c及疫苗株CPV-1nt、CPV-pf u的熔解峰，而對其它犬腹瀉常見病毒，如CDV、CAV-2、CCV、CRV和CPIV都沒有擴(kuò)增出特異熔解峰。表明本發(fā)明引物組Fl/R1、F2/R2及探針P1、P2具有很好的特異性，可以用于犬細(xì)小病毒疫苗株及野毒株的熒光檢測。
[0054]實(shí)施例4靈敏度實(shí)驗(yàn)
下面對本發(fā)明建立的檢測方法作靈敏度檢測。
[0055]將實(shí)施例2中標(biāo)準(zhǔn)樣品CPV_2a克隆至PMD18T_Vector中，形成陽性質(zhì)粒p_2a，對P-2a做核酸檢測，換算質(zhì)粒數(shù)，做10倍梯度稀釋，形成1.29xl09、l.29xl08、l.29xl07、1.29xl0\l.29xl0\l.29xl0\l.29xl0\l.29xl0\l.29xl0\l.29xl0° copies/μ?共 10個梯度，按上述實(shí)施例2中的熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)和熔解曲線分析方法進(jìn)行分析，擴(kuò)增曲線圖和熔解曲線峰型化圖如圖3所示。
[0056]圖3為CPV_2a的雙色熒光檢測方法靈敏度試驗(yàn)擴(kuò)增曲線圖和熔解曲線圖，其中A為CPV-2a的FAM和HEX雙通道同時檢測的擴(kuò)增曲線圖，S卩C和D圖中曲線的疊加圖；B*CPV-2a的FAM和HEX雙通道同時檢測的熔解曲線圖，S卩E和F圖中曲線的疊加圖；(:和0分別為FAM單通道和HEX單通道檢測的擴(kuò)增曲線圖；E和F分別為FAM單通道和HEX單通道檢測的熔解曲線圖；
從圖3中可以明顯看出，本發(fā)明檢測方法隨著核酸濃度的降低呈現(xiàn)明顯的下降的熒光信號，當(dāng)質(zhì)粒濃度降低至1.29 copiesAU，F(xiàn)AM通道和HEX通道還可以檢測到相應(yīng)明顯的熒光信號。本發(fā)明方法靈敏度較高。
[0057]實(shí)施例5臨床樣品熒光PCR擴(kuò)增及熔解曲線分析
I)從樣本中提取病毒核酸:方法同上述實(shí)施例2中核酸提取方法。
[0058]2)以提取的病毒核酸為模板，方法同上述實(shí)施例2中熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)和熔解曲線分析；同時以實(shí)施例2中所述的陽性標(biāo)準(zhǔn)品CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、CPV-1nt、CPV-pfu作為陽性對照。
[0059]3)臨床樣品熔解曲線分析結(jié)果分析。
[0060]熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用LightCycler96分析儀進(jìn)行分析。本發(fā)明檢測了33份臨床樣品，熔解曲線分析結(jié)果如圖4所示。
[0061]從圖4所示的犬細(xì)小病毒臨床樣品檢測峰型化熔解曲線圖上可以看出，所檢測的33份臨床樣品在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果(即HEX熒光通道的分析結(jié)果)中(見圖4A和C)，以野毒株CPV-2a、疫苗株CPV-1nt、疫苗株CPV-pfu陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品作為對照，33份樣品的熔解峰和陽性對照CPV-2a熔解峰Δ Tm值的絕對值均小于1.0°C，且樣品熔解峰基部的開口相對陽性CPV-1nt熔解峰的基部開口窄(窄4 ± 0.5 °C )，說明33份臨床樣品均為野毒株。
[0062]另外，在引物F1、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果(即FAM熒光通道的分析結(jié)果)中(見圖4A和B)，以犬細(xì)小病毒CPV-2a、CPV_2b、CPV_2c陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品熔解曲線作為對照時，其中20份樣本只有I個熔解峰，且與CPV-2a陽性標(biāo)準(zhǔn)品熔解峰的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，說明這20份樣本中只含有CPV-2a型；其中9份樣本只有I個熔解峰，且與CPV-2b陽性標(biāo)準(zhǔn)品熔解峰的Δ Tm值的絕對值小于1.0 °C，說明這9份樣本中只含CPV-2b型;其中3份樣本只有I個熔解峰，且與CPV-2c陽性標(biāo)準(zhǔn)品熔解峰的Δ Tm值的絕對值小于1.(TC，說明這3份樣本中只含CPV-2c型;其中I份樣品有2個熔解峰，且分別與CPV-2a、CPV_2b陽性標(biāo)準(zhǔn)品熔解峰的Δ Tm值的絕對值小于1.0 °C，說明這I份(編號為JS11)樣本中含有CPV-2a型和CPV-2b型。
[0063]實(shí)施例6—種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光PCR方法
I)從樣本中提取病毒核酸:方法同上述實(shí)施例2中核酸提取方法。
[0064]2)以提取的病毒核酸為模板，分別進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)和熔解曲線分析；同時以實(shí)施例2中所述的陽性標(biāo)準(zhǔn)品CPV-2a、CPV-2b、CPV_2c、CPV-1nt、CPV-pf u作為陽性對照。
[0065]PCR反應(yīng)體系:
CldH2O2.8μ1
Premix Ex-Taq 5.Ομ? ΙμΜ 弓丨物 Fl0.2μ1
ΙΟμΜ 引物Rl0.2μ1 ΙΟμΜ 探針Pl0.2μ1
ΙμΜ 引物 F20.2μ1
ΙΟμΜ 引物 R20.2μ1
ΙΟμΜ 探針Ρ20.2μ1
DNA模板I.Ομ?
總體積ΙΟμΙ。
[0066]PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下:
95°C 預(yù)變性 5min;95°C 變性 158，50°(:退火158，72°(:延伸158;循環(huán)55次。
[0067]熔解曲線分析程序如下: 95°(:變性3111丨11;37°(:退火31^11;45°(:到75°(:以0.1°(:/8的速率，5次/°(:連續(xù)采集?厶1和
HEX熒光信號，進(jìn)行熔解曲線分析。
[0068]3)樣品熔解曲線分析結(jié)果分析
1)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-pfu熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定樣品中含有犬細(xì)小病毒疫苗株CPV-pfu;
2)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-1nt熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.(TC，且樣品熔解峰基部的開口比陽性野毒株CPV-2a峰型的基部開口寬(寬4±0.5°C )，則判定樣品中含有犬細(xì)小病毒疫苗株CPV-1nt，
3)在引物F1、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2c熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定樣品中含有犬細(xì)小病毒野毒株CPV-2c;
4)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，且在引物Fl、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果中，該樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2b熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定該樣品中含有犬細(xì)小病毒野毒株CPV_2b;
5)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.(TC，且樣品熔解峰基部的開口比陽性野毒株CPV-1nt的基部開口窄(窄4 ± 0.5°C );同時在引物Fl、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果中，該樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2a熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定該樣品中含有犬細(xì)小病毒野毒株CPV_2a。
[0069]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光PCR引物，其核苷酸序列如下所示: Fl:5'-TATAGCACATCAAGATACAGGAAGA-3'(SEQ ID N0:1)， Rl:5'-TCCAATTGGATCTGTTGG-3'(SEQ ID NO:2)， F2:5'-TGGAAATCACAGCAAACTC-3'(SEQ ID NO:4)， R2:5'-CTAAAGCCATGTTTCCGT-3'(SEQ ID NO:5)。2.—種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光PCR探針，其核苷酸序列如下所示: 探針Pl: 5’- CCTATCATCTTCCTGTAACAAATGATAG -3’(SEQ ID NO: 3)， 探針P2:5’_ CGACCGTAAATAATATGGATAAAACTGCGGTCG -3’(SEQ ID NO:6)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于，所述探針序列5’端標(biāo)記的熒光基團(tuán)為FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一種，探針序列3’端標(biāo)記的淬滅基團(tuán)為TAMRA、MGB、BHQ中一種;且探針PI和P2的5 ’端標(biāo)記的熒光基團(tuán)不相同。4.一種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光PCR試劑盒，其特征在于，該試劑盒中含有權(quán)利要求1所述的引物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒中還含有權(quán)利要求2或3所述的探針。6.—種快速區(qū)分犬細(xì)小病毒疫苗株與野毒株的雙色熒光PCR方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)從樣品中提取病毒DNA; .2)以提取的DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的引物對Fl、R1、F2和R2，及權(quán)利要求2或3所述探針Pl和探針P2進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物； .3 )對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，確定樣品中的病毒類型。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:步驟2)中的熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為: CldH2O2.8μ1 Premix Ex-Taq5.Ομ? ΙμΜ 弓丨物 Fl0.2μ1 ΙΟμΜ 引物Rl0.2μ1 ΙΟμΜ 探針Pl0.2μ1 ΙμΜ 引物 F20.2μ1 ΙΟμΜ 引物 R20.2μ1 ΙΟμΜ 探針Ρ20.2μ1 DNA 模板1.Ομ? 總體積10μ1。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:步驟2)中的熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?950C預(yù)變性5min;95°C變性15s，50°C退火15s，72°C延伸15s;循環(huán)55次。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:步驟3)中的熔解曲線分析程序?yàn)?95°C變性3min;37°C退火3min;45°C到75°C以0.1°C/s的速率，5次/°C連續(xù)采集探針Pl和P2的熒光信號，進(jìn)行熔解曲線分析。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:步驟3)中所述熔解曲線分析的具體分析過程為: I)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CP V-pf u熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定樣品中含有犬細(xì)小病毒疫苗株CPV-pfu; .2 )在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-1 n t熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.(TC，且樣品熔解峰基部的開口比陽性野毒株CPV-2a峰型的基部開口寬，則判定樣品中含有犬細(xì)小病毒疫苗株CPV-1nt; 3)在引物Fl、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2c熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定樣品中含有犬細(xì)小病毒野毒株CPV-2c; .4)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，且在引物Fl、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果中，該樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2b熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定該樣品中含有犬細(xì)小病毒野毒株CPV_2b; .5)在引物F2、R2和探針P2的熒光檢測結(jié)果中，若樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2a、CPV-2b或CPV-2c熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.(TC，且樣品熔解峰基部的開口比陽性野毒株CPV-1nt的基部開口窄；同時在引物F1、R1和探針Pl的熒光檢測結(jié)果中，該樣品熔解溫度與陽性對照CPV-2a熔解溫度的Δ Tm值的絕對值小于1.0°C，則判定該樣品中含有犬細(xì)小病毒野毒株CPV_2a。
【文檔編號】C12N15/11GK105838826SQ201610296557
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】陳琴苓, 劉志成, 張建峰, 嘎利兵嘎, 張春紅, 魏文康
【申請人】廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所