雙重特異性抗體的制作方法【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供雙重特異性抗體和產(chǎn)生并使用這類(lèi)抗體的方法。通常，通過(guò)以下方式產(chǎn)生雙重特異性抗體：鑒定具有帶靜電或疏水的輕鏈可變區(qū)VL殘基的單特異性抗體，單獨(dú)地改變編碼抗體VH中一個(gè)或多個(gè)溶劑可及性殘基的核酸序列或與改變編碼抗體VL的核酸序列組合。表達(dá)改變的VH和VL并且選擇雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明還提供示例性雙重特異性抗體以及使用所述抗體的方法?！緦?zhuān)利說(shuō)明】雙重特異性抗體
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及雙重特異性抗體和生產(chǎn)及使用這類(lèi)抗體的方法。[0002]發(fā)明背景[0003]抗體是由脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)響應(yīng)于外來(lái)蛋白、糖蛋白、細(xì)胞或其他抗原性外來(lái)物質(zhì)攻擊而產(chǎn)生的特異性免疫球蛋白多肽。這個(gè)過(guò)程的重要部分是產(chǎn)生與特定外來(lái)物質(zhì)特異性結(jié)合的抗體。這類(lèi)多肽對(duì)特定抗原的結(jié)合特異性高度精致，并且能夠由各個(gè)脊椎動(dòng)物生成的眾多特異性在其復(fù)雜程度和變異程度方面令人矚目。數(shù)千種抗原能夠引發(fā)反應(yīng)，每種反應(yīng)幾乎排他地指向激發(fā)它的特定抗原。[0004]特異性抗原識(shí)別作用是抗體在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用必需的。在抗體庫(kù)產(chǎn)生時(shí)，重鏈(HC)和輕鏈(LC)的組合性締合在全部脊椎動(dòng)物中均保守。然而，兩條鏈中存在多樣性的非對(duì)稱性。HC可變結(jié)構(gòu)域(VH)含有顯著更高的序列多樣性并且比LC可變結(jié)構(gòu)域(VL)更經(jīng)常地貢獻(xiàn)抗原識(shí)別決定簇。然而，鑒于抗體識(shí)別及結(jié)合特定外來(lái)物質(zhì)的變異性，一些抗體的抗原結(jié)合能十分依賴I。[0005]抗體和抗體片段對(duì)某種特定抗原或多種抗原的特異性使得抗體成為合乎需要的治療藥?？贵w和抗體片段可以用來(lái)靶向具有多效生物學(xué)作用的特定抗原(例如，細(xì)胞因子）。因而，當(dāng)前且持續(xù)需要鑒定和表征治療性抗體、尤其是可用于治療多種疾病和病癥如過(guò)敏性疾病、炎性疾病、自身免疫疾病和增生性疾病的抗體、片段及其衍生物。[0006]發(fā)明簡(jiǎn)述[0007]本發(fā)明提供產(chǎn)生雙重特異性抗體和抗體片段的方法。本發(fā)明也提供使用這些方法鑒定的特異性抗體以及它們的用途。[0008]-般地，本發(fā)明的方法涉及，將抗體的VH多樣化以產(chǎn)生可以在文庫(kù)中穩(wěn)定表達(dá)的雙重特異性抗體變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體在多樣化之前表征為:具有可以配對(duì)在一起以形成與第一表位特異性結(jié)合但不與第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)的VdPVt?？贵w可以進(jìn)一步表征為:在Vl的位置32、50或91(Kabat編號(hào)體系）的任意一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸處具有帶靜電殘基或疏水殘基。隨后在這些位置的一個(gè)或多個(gè)處具有疏水殘基或帶靜電殘基的這種抗體，在VH中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基（例如，溶劑暴露的氨基酸殘基)處進(jìn)行改變。隨后可以將該VH和Vl(例如，作為文庫(kù))表達(dá)，并且自表達(dá)的VH和Vl選擇能夠特異性結(jié)合第一和第二表位的多樣化雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段。[0009]在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生包含可變重鏈結(jié)構(gòu)域(VH)和可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(Vl)的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，其中雙重特異性抗體的VH和I配對(duì)在一起以形成與第一表位和第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述方法包括步驟：（a)提供包含VH和Vl的抗體，其中VH和Vl配對(duì)在一起以形成與第一表位結(jié)合但不與第二表位結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且其中所述抗體在Vl的位置32、50或91處包含至少一個(gè)帶靜電或疏水的氨基酸；（b)改變編碼步驟(a)的抗體的VH的核酸序列，其中改變一個(gè)或多個(gè)溶劑可及性氨基酸殘基；（c)表達(dá)步驟(b)的Vl和改變的VH;和⑷選擇包含步驟(c)的Vl和改變的VH的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該VH和I配對(duì)在一起以形成與第一表位和第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)。[0010]在一些實(shí)施方案中，至少兩個(gè)在位置32、50或91處的氨基酸是帶靜電或疏水的。在一些實(shí)施方案中，在位置32、50和91處的全部三個(gè)氨基酸是帶靜電或疏水的。在一些實(shí)施方案中，帶靜電殘基是酪氨酸。在一些實(shí)施方案中，疏水性殘基是色氨酸。在一些實(shí)施方案中，基于多個(gè)天然存在的重鏈氨基酸序列的多樣性，改變編碼Vh的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，溶劑暴露的殘基位置是選自VH的位置33、34、50-58和95-97的氨基酸殘基位置。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括:改變編碼步驟(a)的抗體的Vl的核酸序列，其中改變一個(gè)或多個(gè)溶劑可及性氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中，溶劑暴露的殘基位置是選自Vl的氨基酸93-96的氨基酸殘基位置。在一些實(shí)施方案中，在步驟(d)的選擇過(guò)程中，改變的VH與Vl展示在噬菌體上。在一些實(shí)施方案中，步驟(a)的抗體包括包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDN0:9)的輕鏈可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)CDRL1、包含氨基酸序列YTSHRYT(SEQID勵(lì)：10)的〇)此2和包含氨基酸序列QQDYTSPWTF(SEQID如：11)的0)1^3。在一些實(shí)施方案中，步驟(&)的抗體包括包含氨基酸序列DYSMH(SEQIDNO:13)的重鏈可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)⑶RHI、包含氨基酸序20)的⑶RH3。在一些實(shí)施方案中，步驟(d)的雙重特異性抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)互斥地結(jié)合第一表位和第二表位。在其他實(shí)施方案中，步驟(d)的雙重特異性抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)結(jié)合第一表位和第二表位。在一些實(shí)施方案中，第一表位來(lái)自一個(gè)生物分子并且第二表位來(lái)自相同的生物分子。在其他實(shí)施方案中，第一表位來(lái)自第一生物分子并且第二表位來(lái)自第二生物分子。在一些實(shí)施方案中，第一生物分子和第二生物分子選自114/115和114/IL13。在一些實(shí)施方案中，第一生物分子和第二生物分子是細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，第一或第二生物分子是在體內(nèi)與抗體結(jié)合時(shí)可以增加雙重特異性抗體半壽期的分子。在一些實(shí)施方案中，第一或第二生物分子是血清白蛋白或新生兒Fc受體(FcRn)。在一些實(shí)施方案中，第一或第二生物分子是在體內(nèi)與抗體結(jié)合時(shí)可以增加雙重特異性抗體的效應(yīng)子功能的分子。在一些實(shí)施方案中，第一或第二生物分子與天然殺傷細(xì)胞或巨噬細(xì)胞上的細(xì)胞表面蛋白結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞表面蛋白是Fc受體或Clq。在一些實(shí)施方案中，雙重特異性抗體的Vh和Vl配對(duì)在一起以形成以10_6或更低的Kd與第一表位或第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，雙重特異性抗體的Vh和Vl配對(duì)在一起以形成以10_9或更低的Kd與第一表位或第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，雙重特異性抗體的Vh和Vl配對(duì)在一起以形成以1(T12或更低的Kd與第一表位或第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，雙重特異性抗體的VH和Vl配對(duì)在一起以形成以10_6或更低的Kd與第一表位和第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，雙重特異性抗體的Vh和Vl配對(duì)在一起以形成以10_9或更低的Kd與第一表位和第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，雙重特異性抗體的Vh和Vl配對(duì)在一起以形成以10_12或更低的Kd與第一表位和第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，第一生物分子和第二生物分子在結(jié)構(gòu)上不是相似的。在一些實(shí)施方案中，步驟(d)的選擇包括深度測(cè)序、超深度測(cè)序和/或下一代測(cè)序。[0011]如下文描述，使用本發(fā)明方法產(chǎn)生的示例性抗體包括結(jié)合白介素4(IL4)和白介素5(IL5)二者的抗體，以及結(jié)合IL4和白介素13(IL13)二者的抗體。這些抗體的成功產(chǎn)生表明，改變抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列可以充當(dāng)產(chǎn)生具有雙重特異性和功能的抗體的一般工程化路徑。雙重特異性抗體，包括但不限于本文所述的IL4/IL5抗體和IL4/IL13抗體，具有同時(shí)靶向兩條途徑(冗余或非冗余)的潛力并且可用于治療多種疾病和病癥，包括但不限于免疫疾病、炎性疾病和增生性疾病。[0012]因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過(guò)上文描述的本發(fā)明方法產(chǎn)生的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，雙重特異性抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，片段是Fab或scFv。在一些實(shí)施方案中，雙重特異性抗體是IgG。[0013]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含圖4八、48、4(：、74、7(：或70的任一種抗體的氨基酸序列。[0014]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含以下六個(gè)CDR:(i)包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDN0:9)的CDRL1;(ii)包含氨基酸序列丫丁5111^1'(5￡010腸：10)的〇)乩2;(^1)包含氨基酸序列000￥15?訂？（5￡010腸：11)的〇0此3;(丨￥)包含氨基酸序列0￥0111(3￡〇10^):14)的001?111;(￥)包含氨基酸序列N0:2lW9CDRH3。[0015]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含以下六個(gè)CDR:(i)包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDN0:9)的CDRL1;(ii)包含氨基酸序列丫丁5111^1'(5￡010腸：10)的〇)乩2;(^1)包含氨基酸序列000￥15?訂？（5￡010腸：11)的〇0此3;(丨￥)包含氨基酸序列0￥?111(3￡〇10^):15)的001?111;(￥)包含氨基酸序列NO:2〇W9CDRH3。[0016]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含以下六個(gè)CDR:(i)包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDN0:9)的CDRL1;(ii)包含氨基酸序列丫丁5冊(cè)￥!'(5￡010腸：10)的〇)乩2;(111)包含氨基酸序列000￥1???1^?(5￡010腸：12)的〇0此3;(丨￥)包含氨基酸序列0￥1^11(3￡〇10^):16)的001?111;(￥)包含氨基酸序列NO:2〇W9CDRH3。[0017]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含以下六個(gè)CDR:(i)包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDN0:9)的CDRL1;(ii)包含氨基酸序列丫丁5111^1'(5￡010腸：10)的〇)乩2;(^1)包含氨基酸序列000￥15?訂？（5￡010腸：11)的〇0此3;(丨￥)包含氨基酸序列0￥31111(3￡〇10^):13)的001?111;(￥)包含氨基酸序列GVIFQSGATYYADDFK(SEQIDN0:22)的CDRH2;和（vi)包含氨基酸序列GGIFYGMDY(SEQIDNO:2〇W9CDRH3。[0018]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含以下六個(gè)CDR:(i)包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDN0:9)的CDRL1;(ii)包含氨基酸序列丫丁5111^1'(5￡010腸：10)的〇)乩2;(^1)包含氨基酸序列000￥15?訂？（5￡010腸：11)的〇0此3;(丨￥)包含氨基酸序列0￥31111(3￡〇10^):13)的001?111;(￥)包含氨基酸序列GIIFYTGHTYYADDFK(SEQIDN0:23)的CDRH2;和（vi)包含氨基酸序列GGIFYGMDY(SEQIDNO:2〇W9CDRH3。[0019]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含以下六個(gè)CDR:(i)包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDNO:9)的CDRL1;(ii)包含氨基酸序列丫丁5111^1'(5￡010勵(lì)：10)的〇)乩2;(^1)包含氨基酸序列000￥乂1乂2?'1〇^(5￡010勵(lì)：24)的CDRL3，其中、lie、Leu或Lys，并且X2是Ser或His;(iv)包含氨基酸序列DYFIH(SEQID勵(lì)：15)的〇?111;(￥)包含氨基酸序列父161￥￥0厶16卩1父2￥厶父3父4卩1((5￡010勵(lì):25)的〇)1?112，其中Xi是Ala或Gly，X2是1'111'、116、\%1或厶1&，父3是厶8卩、\^1或6111，并且父4是厶8卩、6111、厶811、56『、116、1^11、11^^13或?116;和（￥1)包含氨基酸序列66正￥61?^(5￡010勵(lì)：20)的〇)1?113〇在一些實(shí)施方案中，雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段包含以下六個(gè)CDR:(i)包含氨基酸序列以50571冊(cè)44(5￡010勵(lì):9)的〇)虬1;(^)包含氨基酸序列￥15111^1'(5￡010勵(lì)：10)的CDRL2;(iii)包含氨基酸序列QQDYTHPWTF(SEQIDNO:27)的CDRL3;(iv)包含氨基酸序列DYFIH(SEQIDN0:15)的CDRHl;(v)包含氨基酸序列GGIVYDATGFTTYAEEFK(SEQIDN0:28)的CDRH2;和（vi)包含氨基酸序列GGIFYGMDY(SEQIDN0:20)的CDRH3。在一些實(shí)施方案中，雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段包含以下六個(gè)CDR:(i)包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDN0:9)的CDRLl;(ii)包含氨基酸序列YTSHRYT(SEQID勵(lì)：10)的〇)乩2;(^1)包含氨基酸序列99〇￥10^'\0^(5￡〇10如:31)的0)此3;(1￥)包含氨基酸序列0￥?111(5￡〇10如：15)的CDRHl;(v)包含氨基酸序列AGIVYDATGFTVYADDFK(SEQIDN0:32)的CDRH2;和（vi)包含氨基酸序列GGIFYGMDY(SEQIDN0:20)的⑶RH3。在一些實(shí)施方案中，雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段還包含構(gòu)架區(qū)3(FR3)，所述構(gòu)架區(qū)3包含氨基酸序列GRXmTX2DX3STSTX4(SEQIDNO:26)，其中Xi是Val或Phe，X2是Arg或11e，X3是Thr、Phe、Met或Pro，并且X4是Ala或Val。[0020]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含選自SEQIDN0:l、5、29或33的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和選自SEQIDN0:2、3、4、6、7、8、30或34的重鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段以500nM或更低的Kd結(jié)合IL4并且以約900nM或更低的Kd結(jié)合IL5。在一些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段以100nM或更低的Kd結(jié)合IL4并且以約100nM或更低的Kd結(jié)合IL5。在一些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段以10nM或更低的Kd結(jié)合IL4并且以約50nM或更低的Kd結(jié)合IL5。在其他實(shí)施方案中，分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段以500nM或更低的Kd結(jié)合IL4并且以約900nM或更低的Kd結(jié)合IL13。在一些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段以100nM或更低的Kd結(jié)合IL4并且以約100nM或更低的Kd結(jié)合IL13。在一些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段抑制或阻斷IL4、IL5或IL13與其受體的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是IgG抗體。在一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合片段是Fab片段或單鏈可變片段(scFv)。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)架序列的至少一部分是人共有構(gòu)架序列。在一些實(shí)施方案中，抗體是嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。[0021]本發(fā)明還提供包含任一種前述雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及編碼本文公開(kāi)的任一種雙重特異性抗體的分離的核酸，包括表達(dá)該抗體的載體(例如，表達(dá)載體）。[0022]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含前述核酸和/或載體的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CH0)細(xì)胞）。在其他實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞(例如，大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞）。本發(fā)明還提供產(chǎn)生任一種前述雙重特異性抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)產(chǎn)生雙重特異性抗體的宿主細(xì)胞并且從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基回收雙重特異性抗體。[0023]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種治療受試者中哮喘的方法，所述方法包括向受試者施用本文公開(kāi)的任一種雙重特異性抗體，其中所述施用按足以治療或預(yù)防受試者中哮喘的量和時(shí)間進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括施用選自以下的至少一種額外的哮喘治療藥：IgE詰抗劑、抗組胺藥、茶堿(theophylline)、沙丁胺醇（salbutamol)、丙酸倍氯米松（beclomethasonedipropionate)、色甘酸鈉（sodiumcromoglycate)、類(lèi)固醇（steroid)和抗炎藥。在一些實(shí)施方案中，哮喘是過(guò)敏性哮喘。[0024]在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種治療受試者中增生性疾病的方法，所述方法包括向受試者施用本文公開(kāi)的任一種雙重特異性抗體，其中所述施用按足以治療受試者中增生性疾病的量和時(shí)間進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，增生性疾病是癌癥。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括向受試者施用選自化療藥、細(xì)胞毒藥物和抗血管生成藥的額外抗增生藥。[0025]附圖簡(jiǎn)述[0026]圖1A和圖1B顯示hul9Cll抗體⑶R的誘變作圖。為了測(cè)量hul9CllFab變體的相對(duì)抗原結(jié)合親和力，通過(guò)Fab表達(dá)和抗M13噬菌體辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合物來(lái)定量抗原結(jié)合，檢測(cè)了連續(xù)稀釋的噬菌體展示的抗IL4hul9Cll野生型(wt)或LCCDR丙氨酸突變體與ELISA孔上包被的抗gD抗體(A)或IL4(B)的結(jié)合。gD是與輕鏈的C末端融合的表達(dá)肽標(biāo)簽。將抗gD抗體直接包被在ELISA孔上，而IL4用ELISA孔上包被的非阻斷性抗IL4抗體捕獲。[0027]圖1C顯示，通過(guò)開(kāi)展如圖1A和圖1B中的測(cè)定法比較噬菌體展示的Fab變體的相對(duì)IL4結(jié)合親和力，檢查了各CDR位點(diǎn)處丙氨酸突變的影響。使用氨基酸的單字母代碼。通過(guò)以下方式確定相對(duì)IL4-結(jié)合強(qiáng)度：用線性回歸模型擬合數(shù)據(jù)，隨后以IL4結(jié)合作用的斜率(相對(duì)于噬菌體濃度)除以Fab表達(dá)的斜率。低值(點(diǎn)線下方)被認(rèn)為相對(duì)hu191lwt的低IL4結(jié)合親和力，提示破壞性突變。[0028]圖2A是顯示hul9Cll的IL4結(jié)合作用的關(guān)鍵殘基的結(jié)構(gòu)示意圖，作圖在曲妥珠單抗Fab(PDB:1n)V)結(jié)構(gòu)的俯視圖上。分別使用P0B條目3SQ0和3BEI作為重鏈和輕鏈的模板，利用M0E生成hul9Cll的結(jié)構(gòu)模型。對(duì)IL4結(jié)合作用重要的殘基是LC殘基31、32、50、53、91、92和HC殘基31、32、96、98及99(按1^匕&七編號(hào)）。在抗原結(jié)合位點(diǎn)的俯視圖中這些殘基在模型結(jié)構(gòu)上以紅色著色。通過(guò)位點(diǎn)定向突變生成在噬菌體上展示的hul9CllFab變體的文庫(kù)。以粗體標(biāo)記容許全部20種氨基酸(優(yōu)選野生型殘基）的HC殘基，而標(biāo)記的其他HC殘基和LC殘基被容許有限的突變以模擬天然多樣性。[0029]圖2B的表格顯示組合文庫(kù)的設(shè)計(jì)，以募集第二抗原特異性至hul9Cll。顯示所選擇克隆的CDR序列，所選擇的克隆包括與親本hul9Cll野生型相比具有突變的抗IL5特異性(5A)、抗IL4/5特異性(E7、B1)和抗IL4/13特異性(F1、F2)抗體克隆。文庫(kù)中隨機(jī)化的殘基和分離的克隆中的突變根據(jù)其特性而加陰影:具有芳族側(cè)鏈的Y、W、F;疏水性L、I、V、A、M;堿性K、R、H;酸性D、E;極性S、T、N、Q;和P、G。顯示了通過(guò)噬菌體競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法的IC50所度量的相對(duì)抗原結(jié)合親和力。將Fab展示噬菌體首先在溶液中與相應(yīng)抗原的連續(xù)稀釋物溫育2小時(shí)，未結(jié)合的噬菌體隨后被抗原包被的ELISA孔短暫捕獲并且用抗M13HRP綴合物檢測(cè)。將抑制50%噬菌體與抗原包被孔結(jié)合的抗原濃度計(jì)算為IC50AB指無(wú)可檢測(cè)的、噬菌體克隆直接與抗原包被孔的結(jié)合。[0030]圖3顯示10個(gè)生成的噬菌體展示文庫(kù)(2144-1至2144-10)的IL4結(jié)合能力的滴定曲線。[0031]圖4A顯示相對(duì)于抗IL4特異性hul9Cll(SEQIDN0:1)比對(duì)時(shí)，hul9Cll的雙重特異性抗IL4/IL5變體(E7(SEQIDN0:1)和B1(SEQIDN0:5))以及抗IL5特異性5A(SEQIDN0:1)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)結(jié)果。[0032]圖4B顯示相對(duì)于抗IL4特異性hul9Cll(SEQIDN0:2)比對(duì)時(shí)，hul9Cll的雙重特異性抗IL4/IL5變體(E7(SEQIDN0:4)和B1(SEQIDN0:6))以及抗IL5特異性5A(SEQIDN0:3)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)結(jié)果。[0033]圖4C顯示相對(duì)于抗IL4特異性hul9Cll(SEQIDN0:2)比對(duì)時(shí)，hul9Cll的雙重特異性抗IL4/IL13變體(F1(SEQIDN0:7)和F2(SEQIDN0:8))的重鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)結(jié)果。[0034]圖5顯示IgG形式的hul9Cll的選定變體的雙重特異性。將hul9Cll的選定變體的抗原結(jié)合特異性評(píng)估為這些變體以人IgGl樣式在250nM與包被在ELISA孔上的（一個(gè)或多個(gè)）靶抗原或幾種無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)合，用抗Fc抗體HRP綴合物檢測(cè)。[0035]圖6顯示對(duì)hul9Cll雙重特異性變體(抗IL4特異性野生型：19C11;抗IL5特異性：5A;和抗IL4/5特異性:E7和B1)在所示抗體濃度在阻斷IL5與其受體相互作用方面的結(jié)合特異性的表征。用鏈霉親和素-HRP綴合物檢測(cè)，在漸增加濃度的IgG形式的人源化19C11或變體存在下，與固定于ELISA孔上的IL5結(jié)合的生物素化IL5受體a的水平。[0036]圖7A的表格顯示IL4/IL5特異性E7的親和力成熟變體的氨基酸序列以及通過(guò)噬菌體競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法所測(cè)量的其對(duì)靶抗原的相對(duì)親和力。為了改善親和力，構(gòu)建展示E7變體的噬菌體文庫(kù)，其中以"同源物"（粗體）、"有限"（斜體)和"柔性"（灰色）隨機(jī)化策略突變選擇的殘基，所述策略分別容許野生型和同源氨基酸、基于天然抗體的有限多樣性，或大約50%的野生型和50%的全部其他氨基酸。⑶RH2主要經(jīng)歷同源突變以細(xì)致優(yōu)化新募集的針對(duì)IL5的結(jié)合功能。對(duì)于其他CDR，則靶向?qū)L4結(jié)合作用并不關(guān)鍵的那些位點(diǎn)。將選定克隆的序列與E7比對(duì)并且顯示突變。如上文，通過(guò)噬菌體IC50評(píng)定每個(gè)克隆的相對(duì)親和力。[0037]圖7B的表格顯示以Fab形式純化的E7及其親和力成熟變體1C36和1C60的親和力，其中在25°C使用固定有人IL5(R&DSystems)或IL4的CM5傳感芯片，通過(guò)BIAcore測(cè)量所述親和力。[0038]圖7C顯示相對(duì)于E7的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列（SEQIDN0:1)比對(duì)時(shí)，E7的親和力改善的雙重特異性抗114/115變體1036(3￡〇10勵(lì):29)和1060(3￡〇10勵(lì):33)的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)結(jié)果。[0039]圖7D顯示相對(duì)于E7的重鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列（SEQIDN0:4)比對(duì)時(shí)，E7的親和力改善的雙重特異性抗114/115變體1036(3￡〇10勵(lì):30)和1060(3￡〇10勵(lì):34)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)結(jié)果。[0040]圖8A和圖8B顯示對(duì)E7和E7的親和力成熟變體（1C36和1C60)的結(jié)合特異性的表征。通過(guò)抗IgG-HRP檢測(cè)E7和親和力改善的E7變體（IgG形式）（100nM)與ELISA平板上的固定化抗原和無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)的直接結(jié)合(A)。通過(guò)鏈霉親和素-HRP綴合物檢測(cè)在緩沖液(PBS)或50nME7、1C36或1C60存在下生物素化的IL5與ELISA孔上包被的IL5受體的結(jié)合(B)。[0041]發(fā)明詳述[0042]許多疾病途徑通過(guò)不止一種蛋白質(zhì)或一種具有不止一種功能的蛋白質(zhì)的作用演進(jìn)。例如，過(guò)敏性疾病、炎性疾病或自身免疫疾病(例如，哮喘)經(jīng)常涉及多種細(xì)胞因子。雙重特異性抗體可用于其中需要靶向多于一種抗原的治療性和診斷性應(yīng)用。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種用于產(chǎn)生雙重特異性抗體的新方法。當(dāng)抗體Vl包含對(duì)抗體-抗原相互作用關(guān)鍵的殘基時(shí)，則可以通過(guò)單獨(dú)地或與額外的Vl殘基和構(gòu)架殘基組合地改變VH殘基而多樣化這類(lèi)抗體。[0043]-般地，本發(fā)明的方法涉及多樣化抗體的VH以產(chǎn)生可以在文庫(kù)中穩(wěn)定表達(dá)的變體。一般地，與第一表位特異性結(jié)合、但不與第二表位特異性結(jié)合、并且特征為在Vl的位置32、50或91(按Kabat編號(hào)）的任何一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸殘基處具有帶靜電殘基或疏水殘基的抗體，在Vh的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸殘基(例如，溶劑暴露的氨基酸殘基)處被改變。隨后表達(dá)該VH和Vl，之后自表達(dá)的VH和Vl選擇能夠與第一和第二表位特異性結(jié)合的多樣化雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段。[0044]如下文描述，使用本發(fā)明方法產(chǎn)生的示例性抗體包括結(jié)合白介素4(IL4)和白介素5(IL5)二者的抗體，以及結(jié)合IL4和白介素13(IL13)二者的抗體。這些抗體表明在IL4抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，CDR)中的突變可以賦予對(duì)額外的不相關(guān)蛋白質(zhì)以及IL4的雙重結(jié)合能力，并為改變Vh中的殘基以賦予雙重特異性的一般策略提供了證據(jù)。本文所述的雙重特異性抗體，包括但不限于IL4/IL5抗體和IL4/IL13抗體，具有同時(shí)靶向多種抗原(例如，冗余或非冗余細(xì)胞因子途徑)的潛力，從而使得它們可用于治療多種疾病和病癥，包括細(xì)胞因子介導(dǎo)的疾病(例如，哮喘）。[0045]I.定義[0046]術(shù)語(yǔ)"多特異性抗體"以最廣義使用，特別地覆蓋包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vl)的抗體，其中該VhVl單元具有多表位特異性（即，能夠與一個(gè)生物分子上的兩個(gè)不同表位或不同生物分子上的各一個(gè)表位結(jié)合）。這類(lèi)多特異性抗體包括，但不限于，全長(zhǎng)抗體、具有兩個(gè)或更多個(gè)Vl結(jié)構(gòu)域和Vh結(jié)構(gòu)域的抗體、抗體片段如Fab、Fv、dsFv、scFv、雙體抗體(diabody)、雙特異性雙體抗體和三體抗體(triabody)、已經(jīng)共價(jià)或非共價(jià)連接的抗體片段。"多表位特異性"指與相同或不同靶上兩個(gè)或兩個(gè)以上不同表位特異性結(jié)合的能力。"雙重特異性"或"雙特異性"指與相同或不同靶上兩個(gè)不同表位特異性結(jié)合的能力。但是，與雙特異性抗體不同，雙重特異性抗體是如下形式的天然IgG抗體，其中兩個(gè)抗原結(jié)合臂具有相同的氨基酸序列并且每個(gè)Fab臂均能夠識(shí)別兩種抗原。雙重特異性允許抗體以單個(gè)Fab或IgG分子形式以高親和力與兩種不同抗原相互作用。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，IgGl形式的多特異性抗體以5yM至0.001pM、3yM至0.0OlpM、lyM至0.001pM、0.5yM至0.0OlpM、或者0.1yM至0.0OlpM的親和力與每個(gè)表位結(jié)合。"單特異性"指僅結(jié)合一種表位的能力。[0047]通常，抗體包括基本4鏈抗體單元，其是由兩條相同輕鏈(L)和兩條相同重鏈(H)組成的異源四聚體糖蛋白（IgM抗體由5個(gè)基本異源四聚體單元連同稱作J鏈的額外多肽組成，并因此含有10個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，而分泌型IgA抗體可以聚合以形成包含2-5個(gè)基本4鏈單元連同J鏈的多價(jià)裝配物）。在IgG的情況下，4鏈單元通常是約150，000道爾頓。每條L鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵連接至H鏈，而根據(jù)H鏈同種型，兩條H鏈通過(guò)一個(gè)或多個(gè)二硫鍵彼此連接。每條H和L鏈還具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條H鏈在N端具有一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(VH)，后接3個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CH)(對(duì)于a鏈和y鏈)或4個(gè)CH結(jié)構(gòu)域(對(duì)于y和e同種型）。每條L鏈在N端具有一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(Vl)，后接在其另一端的恒定結(jié)構(gòu)域(&)。九與Vh對(duì)齊，并且Cl與重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)對(duì)齊。據(jù)信，特定氨基酸殘基形成輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的界面。Vh和Vl的配對(duì)共同形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。關(guān)于不同類(lèi)別抗體的結(jié)構(gòu)和特性，參見(jiàn)，例如，BasicandClinicalImmunology，第8版，DanielP.Stites,AbbaI?Terr和Tristram6.?&^1〇￥(編著），4?？?61:〇11&1^1^6，1'1〇^&11<:，(71，1994，第71頁(yè)和第6章。任何脊椎動(dòng)物物種的L鏈可以基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列而被劃分至兩個(gè)明顯不同類(lèi)型（稱作K和A)之一。取決于抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被劃分至不同的類(lèi)別或同種型。存在五個(gè)主要類(lèi)別的免疫球蛋白：184、18〇、18￡、186和1811，具有分別命名為€[、8、y、￡和y的重鏈?；贑H序列和功能方面相對(duì)輕微的差異，Y和a類(lèi)別進(jìn)一步劃分成亞類(lèi)，例如，人類(lèi)表達(dá)以下亞類(lèi):IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1^PIIgA2。[0048]術(shù)語(yǔ)"可變"指抗體之間可變結(jié)構(gòu)域的某些節(jié)段在序列方面極為不同的事實(shí)?？勺兓?V"結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)抗原結(jié)合并定義特定抗體對(duì)其特定抗原的特異性。然而，變異性在可變結(jié)構(gòu)域的110個(gè)氨基酸跨度上并非均勻地分布。相反，V區(qū)由15-30個(gè)氨基酸的稱作構(gòu)架區(qū)(FR)的相對(duì)不變區(qū)段隔開(kāi)稱作"高變區(qū)"的各長(zhǎng)9-12個(gè)氨基酸的極為可變的較短區(qū)域組成。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包括由3個(gè)高變區(qū)連接的大體上采取財(cái)斤疊構(gòu)型的4個(gè)FR，其中高變區(qū)形成環(huán)，連接該0折疊結(jié)構(gòu)并在一些情況下形成該0折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈中的高變區(qū)通過(guò)FR而緊靠在一起，并與來(lái)自其他鏈的高變區(qū)一起對(duì)抗體的抗原-結(jié)合部位的形成作出貢南犬（參見(jiàn)Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))〇恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原結(jié)合，但是展示各種效應(yīng)子功能，如使抗體參與依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)。[0049]在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"高變區(qū)"指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來(lái)自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基（例如，VL中約24-34位(Ll)、50-56位(L2)和89-97位(L3)殘基前后，和VH中約26-35位(Hl)、49-65位(H2)和95-102位(H3)殘基前后(在一個(gè)實(shí)施方案中，H1是在約31-35位殘基前后）；Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD.(1991))和/或來(lái)自"高變環(huán)"的那些殘基（例如Vl中26-32位(LI)、50-52位(L2)和91-96位（L3)殘基，和Vh中26-32位(HI)、53-55位(H2)和96-101位(H3)殘基；Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。[0050]如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"指來(lái)自基本上均一的抗體群體中的抗體，即，除了在產(chǎn)生該單克隆抗體期間可能出現(xiàn)的可能變體(此類(lèi)變體通常以微小量存在)之外，構(gòu)成該群體的各個(gè)抗體是基本上相似并且結(jié)合相同的表位。單克隆抗體一般包括包含結(jié)合靶的可變區(qū)的抗體，其中所述抗體通過(guò)包括從多種抗體選出該抗體的方法獲得。例如，該選擇方法可以是從多個(gè)克隆（例如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的匯集物)選擇單克隆。應(yīng)當(dāng)理解，可以進(jìn)一步改變所選的抗體，例如以改善對(duì)該祀的親和力、以使抗體人源化、以改善抗體在細(xì)胞培養(yǎng)物中的生產(chǎn)、以降低其體內(nèi)免疫原性、以產(chǎn)生多特異性抗體等，并且應(yīng)當(dāng)理解，包含所述改變的可變區(qū)序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。除了特異性外，單克隆抗體制備物還具有優(yōu)點(diǎn)一一它們一般不混雜其他免疫球蛋白。修飾語(yǔ)"單克隆"表明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的特征，而不應(yīng)理解為要求通過(guò)任何特定方法產(chǎn)生該抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過(guò)多種技術(shù)產(chǎn)生，包括雜交瘤方法（例如，Kohler等人，Nature,256:495(1975);Harlow等人，Antibodies:ALaboratoryManual,(ColdSpringHarborLaboratoryPress，第2版，1988);Hammerling等人，MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas563_681(Elsevier，N.Y.,1981))、重組DNA方法（參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567)、噬菌體展示技術(shù)（參見(jiàn)，例如，(：1&〇1^〇11等人，他加代，352:624-628(1991);Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1991);Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004);和Lee等人，J.Immunol.Methods284(l-2):119-132(2004))、以及從具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動(dòng)物中生產(chǎn)人抗體或人樣抗體的技術(shù)（參見(jiàn)，例如，W098/24893、W0/9634096、W0/9633735和W091/10741;Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci?USA90:2551(1993);Jakobovits等人，Nature362:255-258(1993);Bruggemann等人，YearinImmunol.7:33(1993);美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,545,806、5,569,825、5，591，669(均屬于661^1^^1);5,545,807;恥97/17852、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,545,807;5,545,806;5，569,825;5，625,126;5，633,425;和5，661，016;Marks等人，Bio/Technology,10:779-783(1992);Lonberg等人，Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature368:812-813(1994);FishwiId等人，NatureBiotechnology，14:845-851(1996);Neuberger，NatureBiotechnology，14:826(1996);以及Lonberg和Huszar，Intern?Rev?Immunol.,13:65-93(1995))。[0051]單克隆抗體在本文中特別地包括嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體和親和力成熟抗體。嵌合抗體是這樣的抗體，在所述抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類(lèi)別或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而所述鏈的其余部分與源自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類(lèi)別或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源；以及這種抗體的片段，只要它們展示想要的生物活性即可（美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567;和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。目的嵌合抗體在本文中包括"靈長(zhǎng)類(lèi)化"抗體，所述靈長(zhǎng)類(lèi)化抗體包含源自非人靈長(zhǎng)類(lèi)(例如，舊世界猴、猿等)的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。[0052]非人(例如，嚙齒類(lèi))抗體的"人源化"形式是含有源自非人抗體中最少序列的嵌合抗體。就大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白（受體抗體），其中來(lái)自所述受體的高變區(qū)的殘基由來(lái)自非人物種(供體抗體）（如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物）的具有所需抗體特異性、親和力和能力的高變區(qū)的殘基替換。在一些情況下，該人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人殘基替換。另外，人源化抗體可以包含在受體抗體中或在供體抗體中不存在的殘基。作出這些修飾以進(jìn)一步精化抗體性能。通常，人源化抗體將包含至少1個(gè)、并且一般2個(gè)，可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高變環(huán)與非人免疫球蛋白的對(duì)應(yīng)，而全部或基本上全部的FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的。人源化抗體任選地也可以包含免疫球蛋白恒定區(qū)（Fc)，一般是人免疫球蛋白恒定區(qū)，的至少一部分。對(duì)于進(jìn)一步細(xì)節(jié)，參見(jiàn)Jones等人，Nature321:522_525(1986);Reichmann等人，Nature332:323-329(1988);和Presta，Curr.Op?Struct.Biol?2:593_596(1992)。[0053]"人抗體"是這樣的抗體，所述抗體具有與人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列、和/或使用產(chǎn)生人抗體的任何技術(shù)產(chǎn)生。人抗體的該定義特別排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。[0054]"親和力成熟的"抗體是在一個(gè)或多個(gè)CDR中存在一個(gè)或多個(gè)改變的抗體，其中與沒(méi)有這些改變的親本抗體相比，所述改變導(dǎo)致抗體對(duì)抗原的親和力改善。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將對(duì)靶抗原具有納摩爾或甚至皮摩爾親和力。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生親和力成熟的抗體。Marks等人，Bio/Technology10:779-83(1992)描述了借助VH和VL結(jié)構(gòu)域改組的親和力成熟。CDR和/或構(gòu)架殘基的隨機(jī)誘變由Barbas等人，ProcNat?Acad?Sci?USA91:3809-13(1994);Schier等人，Gene169:147-55(1995);Yelton等人，J.Immunol?155:1994-2004(1995);Jackson等人，J.Immunol.154(7):3310-19(1995);和Hawkins等人，J.Mol?Biol?226:889-96(1992)描述。[0055]"完整抗體"是包含抗原結(jié)合位點(diǎn)以及Cl和至少重鏈恒定結(jié)構(gòu)域--ChI、Ch2和Ch3的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如，人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地，完整抗體具有一種或多種效應(yīng)子功能。[0056]"抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選地完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括?&13、？&13'、？(&13'）2和?7片段;雙體抗體;線性抗體(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，641，870，實(shí)施例2;Zapata等人，ProteinEng?8(10):1057-1062(1995));單鏈抗體分子；和從抗體片段形成的多特異性抗體。[0057]表述"線性抗體"通常指在Zapata等人，ProteinEng?8(10):1057-1062(1995)中描述的抗體。簡(jiǎn)而言之，這些抗體包含一對(duì)串聯(lián)的Fd區(qū)段(Vh-ChI-Vh-ChI)，它們與互補(bǔ)輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異或單特異的。[0058]木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱作"Fab"片段，和一個(gè)殘余"Fc"片段一一該命名反映易于結(jié)晶的能力。Fab片段由完整L鏈連同H鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(Vh)和一條重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(ChI)組成。胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生一個(gè)大的F(ab'）2片段，所述片段大致對(duì)應(yīng)于二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段，具有二價(jià)抗原結(jié)合活性并且仍然能夠交聯(lián)抗原。Fab'片段因在ChI結(jié)構(gòu)域的羧基端處具有額外幾個(gè)殘基(包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸)而與Fab片段不同。Fab'-SH在本文是Fab'的名稱，其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基攜帶游離巰基。F(ab'）2抗體片段最初作為之間具有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)Fab'片段產(chǎn)生?？贵w片段的其他化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。[0059]Fc片段包含通過(guò)二硫鍵結(jié)合在一起的兩條H鏈的羧基端部分。抗體的效應(yīng)子功能由Fc區(qū)中的序列決定;該區(qū)域也是某些類(lèi)型細(xì)胞上存在的Fc受體(FcR)所識(shí)別的部分。[0060]"Fv"由緊密、非共價(jià)締合的一個(gè)重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。自這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊產(chǎn)生6個(gè)高變環(huán)(來(lái)自H和L鏈的各3個(gè)環(huán)），其貢獻(xiàn)用于抗原結(jié)合的氨基酸殘基并向該抗體賦予抗原結(jié)合特異性。然而，甚至單一可變結(jié)構(gòu)域(或僅包含3個(gè)抗原特異性CDR的半個(gè)Fv)也可以具有識(shí)別并結(jié)合抗原的能力，雖然經(jīng)常以小于完整結(jié)合部位的親和力進(jìn)行。[0061]"單鏈Fv"也縮寫(xiě)為"sFv"或"scFv"，是包含連接成為單條多肽鏈的Vh和Vl抗體結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選地，sFv多肽還包含在Vh結(jié)構(gòu)域和I結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，所述多肽接頭能夠使scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述，參見(jiàn)Pluckthun，ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore||^，Springer-Verlag,NewYork,第269-315頁(yè)（1994);Borrebaeck1995。[0062]術(shù)語(yǔ)"雙體抗體"指通過(guò)以下方式制備的小抗體片段:構(gòu)建在Vh和Vl結(jié)構(gòu)域之間具有短接頭(約5-10個(gè)殘基)的sFv片段(參見(jiàn)前述段落），從而實(shí)現(xiàn)V結(jié)構(gòu)域的鏈間而非鏈內(nèi)配對(duì)，產(chǎn)生雙價(jià)片段，即具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段。雙特異性雙體抗體是兩個(gè)"交叉"sFv片段的異源二聚體，其中這兩個(gè)抗體的Vh和VL結(jié)構(gòu)域存在于不同的多肽鏈上。在例如EP404，097;W093/11161;和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)中更充分地描述了雙體抗體。.[0063]"帶靜電的"意指具有電荷。通常，帶靜電的氨基酸具有極性側(cè)鏈或帶電荷側(cè)鏈。具有極性側(cè)鏈的氨基酸的例子包括絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。具有帶負(fù)電荷側(cè)鏈的氨基酸的例子包括天冬氨酸和谷氨酸。具有帶正電荷側(cè)鏈的氨基酸的例子包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸。[0064]"疏水性"意指與水不相容、或不易在水中溶解、不易吸收水或不易與水混合。通常，疏水性氨基酸具有非極性側(cè)鏈并且示例包括丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和纈氨酸。[0065]術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞因子"是一個(gè)上位術(shù)語(yǔ)，用于指由一個(gè)細(xì)胞群體釋放、作為細(xì)胞間介質(zhì)而作用于另一細(xì)胞的蛋白質(zhì)。細(xì)胞因子的例子包括淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子包括生長(zhǎng)激素如人生長(zhǎng)激素、N-甲硫酰人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素;胰島素和胰島素原;松弛素和松弛素原;糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素（TSH)和促黃體激素(LH);肝生長(zhǎng)因子;成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子;催乳素；胎盤(pán)催乳激素;腫瘤壞死因子和;繆勒管抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽;抑制素;活化素;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;整聯(lián)蛋白；促血小板生成素(TP0);神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF-P;血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-a和TGF-P;胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II;促紅細(xì)胞生成素(EP0);骨誘導(dǎo)因子;干擾素如干擾素-a、_財(cái)P-y;集落刺激因子(CSF)如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF);粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF);和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF);白介素（IL)如ILl、ILla、IL2、IL3、114、115、116、117、118、1111、1112、1113;腫瘤壞死因子如了陬-€[或了陬-0;和其他多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞因子"包括來(lái)自天然來(lái)源或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列細(xì)胞因子的生物活性等同物。[0066]如本文所用，"密碼子集合"指用來(lái)編碼所需的變異氨基酸的一組不同的核苷酸三聯(lián)體序列。可以合成，例如通過(guò)固相合成法合成，一組寡核苷酸，包括代表由密碼子集合提供的核苷酸三聯(lián)體的所有可能組合并編碼所需氨基酸群組的序列。密碼子命名的標(biāo)準(zhǔn)形式是本領(lǐng)域已知和本文所述的IUB代碼形式。一個(gè)密碼子集合一般由3個(gè)斜體大寫(xiě)字母表示，例如，順1(、順3、乂￥2、0￥1(等(例如，順1(密碼子指密碼子的位置1和2中~=厶/^/6/(：及位置3中1(=G/T(按等摩爾比），以編碼全部20種天然氨基酸）。如本文所用的"非隨機(jī)密碼子集合"因此指，密碼子集合編碼選定氨基酸，其中所述選定氨基酸部分滿足、優(yōu)選地完全滿足本文中所述的氨基酸選擇標(biāo)準(zhǔn)。合成在某些位置具有選定核苷酸"簡(jiǎn)并性"的寡核苷酸是本領(lǐng)域熟知的，例如TRIM法（Knappek等人，JJ.Mol.Biol.296:57-86,1999);Garrard和Henner,Gene128:103,1993)。具有某些密碼子集合的寡核苷酸集合可以使用商業(yè)核酸合成儀(例如可從AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA獲得）合成，或可以商業(yè)地獲得（例如，從LifeTechnologies，Rockvi1le，MD)。因此，具有一定密碼子集合的寡核苷酸集合一般將包括具有不同序列的多個(gè)寡核苷酸，差異由整個(gè)序列內(nèi)部的密碼子集合確定。如根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸具有允許與可變結(jié)構(gòu)域核酸模板雜交的序列并且還可以，但不一定，包括限制性酶位點(diǎn)(例如，用于克隆目的）。[0067]"結(jié)合"目的抗原的本發(fā)明抗體是這樣的抗體，所述抗體以足夠親和力結(jié)合該抗原，從而所述抗體可以作為診斷劑和/或治療劑用于靶向蛋白質(zhì)或表達(dá)該抗原的細(xì)胞或組織，并且不明顯與其他蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)。在這類(lèi)實(shí)施方案中，如熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)或ELISA)所測(cè)定的，抗體與"非祀"蛋白結(jié)合的程度將小于該抗體與其特定靶蛋白的結(jié)合的約10%。就抗體與靶分子的結(jié)合而言，術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"或"特異結(jié)合于"或"特異于"特定多肽或特定多肽靶上的表位意指，該結(jié)合可測(cè)量地與非特異性相互作用不同。可以測(cè)量特異性結(jié)合，例如，通過(guò)與對(duì)照分子的結(jié)合相比來(lái)確定分子的結(jié)合。例如，可以通過(guò)與類(lèi)似于靶的對(duì)照分子(例如過(guò)量的未標(biāo)記靶)競(jìng)爭(zhēng)來(lái)測(cè)定特異性結(jié)合。在這種情況下，如果標(biāo)記的靶與探針的結(jié)合受過(guò)量未標(biāo)記的靶競(jìng)爭(zhēng)性抑制，則指示特異性結(jié)合。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"或"特異結(jié)合于"或"特異于"特定多肽或特定多肽靶上的表位，可以，例如，通過(guò)分子對(duì)靶具有下述Kd來(lái)顯示：1(T4M或更低、備選地1(T5M或更低、備選地10_6M或更低、備選地10_7M或更低、備選地10_8M或更低、備選地10_9M或更低、備選地10一1()M或更低、備選地10-nM或更低、備選地10-12M或更低、或在10-4M至10-12M、或10-6M至10-1QM、或1(T7M至10、范圍內(nèi)。技術(shù)人員明了，親和力和Kd值反相關(guān)。對(duì)抗原的高親和力由低Kd值量度。在一個(gè)實(shí)施方案中，，術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"指這樣的結(jié)合，其中分子與特定多肽或特定多肽上的表位結(jié)合而基本上不與任何其他多肽或多肽表位結(jié)合。[0068]除非另外說(shuō)明，否則就本發(fā)明的多肽而言"生物活性的"和"生物學(xué)活性"和"生物學(xué)特征"意指具有與生物分子結(jié)合的能力。[0069]"生物分子"指核酸、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)及其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物分子存在于自然界中。[0070]當(dāng)用來(lái)描述本文中公開(kāi)的各種抗體時(shí)，"分離的"意指抗體已經(jīng)獲得鑒定并從表達(dá)其的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物分離和/或回收。其自然環(huán)境的雜質(zhì)組分是一般將會(huì)干擾該多肽的診斷性或治療性用途的物質(zhì)，并且可以包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將該抗體純化至（1)足以通過(guò)轉(zhuǎn)杯測(cè)序儀(spinningcupsequenator)獲得至少15個(gè)殘基的N端或內(nèi)部氨基酸序列的程度;或(2)通過(guò)在非還原或還原條件下SDS-PAGE和使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選地使用銀染所確定的均一性。由于不存在多肽自然環(huán)境中的至少一種組分，在重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體包括在分離的抗體中。然而，一般，分離的多肽通過(guò)至少一個(gè)純化步驟制備。[0071]術(shù)語(yǔ)"控制序列"指，在特定宿主生物中表達(dá)有效連接的編碼序列所必需的DNA序列。適于原核生物的控制序列例如包括啟動(dòng)子、任選地操縱基因序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、多聚腺苷化信號(hào)和增強(qiáng)子。[0072]當(dāng)一個(gè)核酸與另一個(gè)核酸序列處于功能性關(guān)系中時(shí)，該核酸是"有效連接的"。例如，前序列或分泌性前導(dǎo)序列的DNA與編碼多肽的DNA有效連接，則其可以表達(dá)為參與所述多肽分泌的前蛋白；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與編碼序列有效連接，則其可以影響所述編碼序列的轉(zhuǎn)錄;或者，核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列有效連接，則該核糖體結(jié)合位點(diǎn)被放置在利于翻譯的位置。通常，"有效連接"意指連接的DNA序列是連續(xù)的，并且，在分泌性前導(dǎo)序列情況下，是連續(xù)的并在讀框中。然而，增強(qiáng)子不必是連續(xù)的。連接通過(guò)在便利的限制性位點(diǎn)處連接而完成。如此類(lèi)位點(diǎn)不存在，則可以根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成性寡核苷酸銜接頭或接頭。[0073]相對(duì)于本文中鑒定的多肽序列，"氨基酸序列同一性百分?jǐn)?shù)（％)"定義為，比對(duì)序列并根據(jù)需要引入空位以實(shí)現(xiàn)最大序列同一性百分?jǐn)?shù)并且不考慮任何保守性置換作為序列同一性的部分時(shí)，候選序列中與正在比較的多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)。為了確定氨基酸序列同一性百分?jǐn)?shù)的比對(duì)可以按本領(lǐng)域能力范圍內(nèi)的多種方式實(shí)現(xiàn)，例如，使用可公開(kāi)獲得的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于測(cè)量比對(duì)的適宜參數(shù)，包括為實(shí)現(xiàn)正在比較的序列全長(zhǎng)范圍內(nèi)的最大比對(duì)所需要的任何算法。然而，出于本文目的，可以使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2,產(chǎn)生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech，Inc.授權(quán)，并且源代碼已經(jīng)隨用戶文檔提交至華盛頓特區(qū)20559的美國(guó)版權(quán)局，在那里它以美國(guó)版權(quán)登記號(hào)TXU510087登記。ALIGN-2程序可通過(guò)Genentech,Inc.，SouthSanFrancisco,加利福尼亞州公開(kāi)獲得。該ALIGN-2程序應(yīng)當(dāng)匯編用于UNIX操作系統(tǒng)、優(yōu)選地?cái)?shù)字式UNIXV4.0D上。全部序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定，并且不變。[0074]除非另外說(shuō)明，否則本文所述的氨基酸序列是連續(xù)氨基酸序列。[0075]本發(fā)明的"結(jié)構(gòu)上不相似的"生物分子指，不屬于相同類(lèi)別(蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖等）、或例如當(dāng)指蛋白質(zhì)時(shí)彼此具有小于60%氨基酸同一性、小于50%氨基酸同一性、小于40%氨基酸同一性、小于30%氨基酸同一性、小于20%氨基酸同一性或小于10%氨基酸同一性的生物分子。[0076]雜交反應(yīng)的"嚴(yán)格性"可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定，并且通常是依賴于探針長(zhǎng)度、洗滌溫度和鹽濃度的經(jīng)驗(yàn)計(jì)算值。通常，較長(zhǎng)的探針需要較高的溫度以正確退火，而較短的探針需要較低的溫度。當(dāng)在低于其解鏈溫度的環(huán)境中存在互補(bǔ)鏈時(shí)，雜交通常取決于變性的DNA再退火的能力。探針和可雜交序列之間的期望同源性程度越高，可以使用的相對(duì)溫度越高。因此，隨之而來(lái)，較高的相對(duì)溫度將傾向于使反應(yīng)條件更嚴(yán)格，而較低的溫度將傾向于使反應(yīng)條件的嚴(yán)格性較低。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的其它細(xì)節(jié)和解釋?zhuān)瑓⒁?jiàn)Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,(1995)。[0077]如本文定義，"嚴(yán)格條件"或"高嚴(yán)格條件"可以由以下確定：（1)使用低離子強(qiáng)度和高溫進(jìn)行洗滌，例如，〇.015M氯化鈉/0.0015M梓檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉，在50°C;(2)在雜交期間使用變性劑，如甲酰胺，例如，50%(v/v)甲酰胺，以及0.1%牛血清白蛋白/0.1%Ficol1/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH6.5，和750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉，在42°C;或（3)在使用50%甲酰胺、5xSSC(0.75MNaCl、0.075M檸檬酸鈉）、50mM磷酸鈉（pH6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5xDenhardt溶液，超聲的鮭精DNA(50μg/ml)、0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖的溶液中在42°C過(guò)夜雜交，在42°C于0.2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉）中洗滌10分鐘，隨后為由55°C含有EDTA的O.lxSSC組成的10分鐘高嚴(yán)格洗滌。[0078]"中等嚴(yán)格條件"可以如Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarborPress,1989所述確定，包括使用嚴(yán)格性比上文所述低的洗滌溶液和雜交條件(例如，溫度、離子強(qiáng)度和％SDS)。中等嚴(yán)格條件的例子是在37°C于包含20%甲酰胺、5XSSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸三鈉）、50mM磷酸鈉（pH7?6)、5XDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20mg/ml變性剪切鮭精DNA的溶液中孵育過(guò)夜，隨后在約37-50°C于1XSSC中洗滌濾膜。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了如何按照需要調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)諸如探針長(zhǎng)度等因素。[0079]抗體"效應(yīng)子功能"指，歸因于抗體Fc區(qū)（天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū)）的那些生物活性，其隨抗體同種型而變動(dòng)?？贵w效應(yīng)子功能的例子包括:Clq結(jié)合和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性;Fc受體結(jié)合;抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如，B細(xì)胞受體)的下調(diào);和B細(xì)胞活化。[0080]"抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性"或"ADCC"指一種形式的細(xì)胞毒性，其中結(jié)合到某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如，天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的Fc受體(FcRs)上的分泌型Ig使得這些細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞可以與攜帶抗原的靶細(xì)胞特異性結(jié)合并隨后用細(xì)胞毒素殺傷靶細(xì)胞?？贵w"武裝"了細(xì)胞毒性細(xì)胞并且是這類(lèi)殺傷作用絕對(duì)需要的。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，即NK細(xì)胞，僅表達(dá)FcyRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、FcyRII和FcyRIIIaRavetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol?9:457-92(1991)的第464頁(yè)表3中總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評(píng)估目的分子的ADCC活性，可以進(jìn)行體外ADCC測(cè)定法，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，500，362或5，821，337中描述的測(cè)定法?？梢杂糜诖祟?lèi)測(cè)定法的效應(yīng)細(xì)胞括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。備選或額外地，可以在體內(nèi)，例如，在動(dòng)物模型中，如在Clynes等人，（Proc.Natl.Acad.Sci.USA)95:652-656(1998)公開(kāi)的動(dòng)物模型中，評(píng)估目的分子的ADCC活性。[0081]"Fc受體"或"FcR"描述與抗體的Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。另外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的受體（y受體），并且包括FcyRI、FcyRII和FcyRIII亞類(lèi)受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA("激活性受體"）和FcyRIIB("抑制性受體"），它們具有相似氨基酸序列，主要區(qū)別在于其胞質(zhì)域。激活性受體FcyRIIA在其胞質(zhì)域中含有免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM)。抑制性受體FcyRIIB在其胞質(zhì)域中含有免疫受體酪氨酸抑制基序（IHM)(參見(jiàn)Da&r〇n,"Annu.Rev.Immunol."15:203-234(1997)中的綜述）JcR在Ravetch和Kinet,(Annu.Rev?Immunol9:457-492(1991));Capel等人，（Immunomethods4:25-34(1994));和deHaas等人，(J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995))中綜述。本文中的術(shù)語(yǔ)"FcR"涵蓋其他FcR，包括將來(lái)鑒定的那些。該術(shù)語(yǔ)還包括負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移母體IgG至胎兒的新生兒受體FcRn(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))。[0082]"人效應(yīng)細(xì)胞"是表達(dá)一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。優(yōu)選地，細(xì)胞至少表達(dá)FcyRIII并且執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，優(yōu)選TOMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以從天然來(lái)源(例如，從血液)分離。[0083]"補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性"或"CDC"指在補(bǔ)體存在下靶細(xì)胞的溶解。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的活化由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(Clq)與(適宜亞類(lèi))抗體的結(jié)合來(lái)啟動(dòng)，其中所述抗體結(jié)合至其關(guān)連抗原上。為評(píng)估補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行CDC測(cè)定法，例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述。[0084]"治療有效量"指抗體或抗體片段在受試者中治療疾病或病癥的量。在變應(yīng)性疾病、炎性疾病或自身免疫性疾病(例如，哮喘、關(guān)節(jié)炎等)情況下，治療有效量的抗體或抗體片段(例如，針對(duì)IL4和IL5或IL4和IL13的雙重特異性或多特異性抗體或抗體片段)可以改善或治療疾病，或預(yù)防、減少、改善或治療與疾病相關(guān)的癥狀。在增生性疾病(例如，癌性腫瘤）的情況下，治療有效量的抗體或抗體片段可以減少癌細(xì)胞的數(shù)目；縮減原發(fā)腫瘤大??；抑制（即，某種程度減緩并且優(yōu)選地終止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)至外周器官中；抑制（即，某種程度減緩并且優(yōu)選地終止)腫瘤轉(zhuǎn)移;某種程度抑制腫瘤生長(zhǎng);和/或某種程度減輕一種或多種與該病癥相關(guān)的癥狀。就抗體或抗體片段可以阻止生長(zhǎng)和/或殺死現(xiàn)存癌細(xì)胞而言，它可以是抑制細(xì)胞的和/或細(xì)胞毒的。對(duì)于癌癥療法，可以例如通過(guò)評(píng)估存活持續(xù)時(shí)間、至病情進(jìn)展時(shí)間（TTP)、無(wú)疾病存活持續(xù)時(shí)間(DFS)、無(wú)病情進(jìn)展存活持續(xù)時(shí)間(PFS)、反應(yīng)率(RR)、反應(yīng)持續(xù)時(shí)間和/或生活質(zhì)量，量度體內(nèi)功效。[0085]"減少或抑制"意指引起優(yōu)選地20%或更多、更優(yōu)選地50%或更多、并且最優(yōu)選地75%、85%、90%、95%或更多的總體減少的能力。減少或抑制可以指正在治療的病癥的癥狀、轉(zhuǎn)移的存在或大小、原發(fā)腫瘤的大小或血管發(fā)生性病癥中血管的大小或數(shù)目。[0086]如本文所用的"炎性疾病"指導(dǎo)致炎癥的病理學(xué)狀態(tài)，典型地由嗜中性粒細(xì)胞的趨化作用引起。[0087]本文中所用的"自身免疫病"是起于并且針對(duì)個(gè)體的自身組織的疾病或病癥，或者其共分離或表現(xiàn)，或從其導(dǎo)致的病狀。[0088]炎性、自身免疫性、或炎性自身免疫性疾病或病癥的實(shí)例包括，但是不限于，哮喘(asthma)如支氣管哮喘（asthmabronchiale)、支氣管哮喘（bronchialasthma)和自身免疫性哮喘（auto-immuneasthma)、關(guān)節(jié)炎（arthritis)(類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoidarthritis)如急性關(guān)節(jié)炎(acutearthritis)、慢性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(chronicrheumatoidarthritis)、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（goutyarthritis)、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acutegoutyarthritis)、慢性炎性關(guān)節(jié)炎（chronicinflammatoryarthritis)、變性關(guān)節(jié)炎(degenerativearthritis)、感染性關(guān)節(jié)炎（infectiousarthritis)、萊姆關(guān)節(jié)炎（Lymearthritis)、增生性關(guān)節(jié)炎（proliferativearthritis)、銀肩病關(guān)節(jié)炎（psoriaticarthritis)、椎骨關(guān)節(jié)炎（vertebralarthritis)，和幼年發(fā)作型類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(juvenile-onsetrheumatoidarthritis)、骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis)、慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)炎（arthritischronicaprogrediente)、變形性關(guān)節(jié)炎（arthritisdeformans)、慢性原發(fā)多發(fā)性關(guān)節(jié)炎（polyarthritischronicaprimaria)、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎（reactivearthritis)和強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosingspondylitis))、炎性過(guò)度增生性皮膚病(inflammatoryhyperproliferativeskindiseases)、銀肩?。╬soriasis)如斑塊狀銀肩?。╬laquepsoriasis)、滴狀銀肩?。╣utattepsoriasis)、膿皰性銀肩?。╬ustularpsoriasis)和趾甲銀肩病(psoriasisofthenails)、皮炎(dermatitis)，包括接觸性皮炎(contactdermatitis)、慢性接觸性皮炎（chroniccontactdermatitis)、過(guò)敏性皮炎(allergicdermatitis)、過(guò)敏性接觸性皮炎（allergiccontactdermatitis)、皰疫樣皮炎(dermatitisherpetiformis)，和特異性皮炎(atopicdermatitis)、X連鎖的IgM過(guò)多綜合征(x-linkedhyperIgMsyndrome)、蕁麻疫(urticaria)如慢性變應(yīng)性蕁麻疫(chronicallergicurticaria)和慢性特發(fā)性蕁麻疫(chronicidiopathicurticaria)，包括慢性自身免疫性蕁麻疹（chronicautoimmuneurticaria)、多發(fā)性肌炎/皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis)、幼年型皮肌炎（juveniledermatomyositis)、中毒性表皮壞死松解癥(toxicepidermalnecrolysis)、硬皮病（scleroderma)(包括全身性硬皮?。╯ystemicscleroderma))、硬化（sclerosis)如系統(tǒng)性硬化病（systemicsclerosis)、多發(fā)性硬化(multiplesclerosis)(MS)如脊髓-視神經(jīng)MS(spin〇-〇pticalMS)、原發(fā)性進(jìn)行性MS(primaryprogressiveMS(PPMS))和復(fù)發(fā)緩解性MS(relapsingremittingMS(RRMS))、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化病（progressivesystemicsclerosis)、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis)、動(dòng)脈硬化（arteriosclerosis)、散播性硬化（sclerosisdisseminata)和共濟(jì)失調(diào)性硬化(ataxicsclerosis)、炎性腸?。↖BD)(例如，節(jié)段性回腸炎（Crohn'sdisease)、自身免疫介導(dǎo)的胃腸病、結(jié)腸炎如潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerativecolitis)、潰瘍性結(jié)腸炎(colitisulcerosa)、顯微鏡性結(jié)腸炎(microscopiccolitis)、膠原性結(jié)腸炎(collagenouscolitis)、息肉狀結(jié)腸炎(colitispolyposa)、壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizingenterocolitis)和透壁性結(jié)腸炎（transmuralcolitis)、與自身免疫炎性腸病（autoimmuneinf1animatoryboweldisease))、壞疽性胺皮病（pyodermagangrenosum)、結(jié)節(jié)性紅斑（erythemanodosum)、原發(fā)性硬化膽管炎（primarysclerosingcholangitis)、表層鞏膜炎（episcleritis))、呼吸窘迫綜合癥（respiratorydistresssyndrome)、包括成人或急性呼吸窘迫綜合癥(adultoracuterespiratorydistresssyndrome(ARDS))、腦膜炎(meningitis)、全部或部分葡萄膜的炎癥、虹膜炎（iritis)、脈絡(luò)膜炎（choroiditis)、自身免疫血液?。╝utoimmunehematologicaldisorder)、類(lèi)風(fēng)濕性脊椎炎(rheumatoidspondylitis)、突發(fā)性聽(tīng)力喪失(suddenhearingloss)、IgE_介導(dǎo)的疾病如過(guò)敏反應(yīng)（anaphylaxis)和過(guò)敏性與特應(yīng)性鼻炎（allergicandatopicrhinitis)、IgE過(guò)多綜合征（hyperIgEsyndrome)、腦炎（encephalitis)如Rasmussen腦炎(Rasmussen'sencephalitis)和邊緣性和/或腦干腦炎（1imbicand/orbrainstemencephalitis)、葡萄膜炎(uveitis)、如前葡萄膜炎(anterioruveitis)、急性前葡萄膜炎(acuteanterioruveitis)、肉芽腫性葡萄膜炎（granulomatousuveitis)、非肉芽腫性葡萄膜炎（nongranulomatousuveitis)、晶狀體抗原性葡萄膜炎（phacoantigenicuveitis)、后葡萄膜炎（posterioruveitis)，或自身免疫性葡萄膜炎（autoimmuneuveitis)、伴有和不伴有腎病綜合征的腎小球腎炎(GN)(glomerulonephritis(GN)withandwithoutnephroticsyndrome)，如慢性或急性腎小球腎炎（chronicoracuteglomerulonephritis)如原發(fā)性GN(primaryGN)、免疫介導(dǎo)的GN(immune-mediatedGN)、膜性GN(膜性腎病）（membranousGN(membranousnephropathy))、特發(fā)性膜性GN(idiopathicmembranousGN)或特發(fā)性膜性腎病（idiopathicmembranousnephropathy)、膜(membrano-)或膜性（membranous)增生性GN(MPGN)(membran〇-〇rmembranousproliferativeGN(MPGN))，包括I型和II型，和快速進(jìn)行性GN(rapidlyprogressiveGN)、過(guò)敏性體質(zhì)（allergicconditions)、變態(tài)反應(yīng)(allergicreaction)、濕疫（eczema)，包括變應(yīng)性或特發(fā)性濕疹（allergicoratopiceczema)、硬皮?。╯cleroderma)、惠普爾病(Whipple'sdisease)、增生性療痕(hypertrophicscarring)、先兆子癇（preeclampsia)、腹腔粘連(abdominaladhesions)、涉及T細(xì)胞浸潤(rùn)和慢性炎癥反應(yīng)的病狀、慢性肺部炎性疾病（chronicpulmonaryinflammatorydisease)、自身免疫性心肌炎（autoimmunemyocarditis)、白細(xì)胞黏附性缺陷（leukocyteadhesiondeficiency)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus(SLE))或系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemiclupuserythematodes)如皮膚SLE(cutaneousSLE)、亞急性皮膚型紅斑狼瘡（subacutecutaneouslupuserythematosus)、新生兒期狼瘡綜合征（NLE)(neonatallupussyndrome(NLE))、播散性紅斑狼瘡（lupuserythematosusdisseminatus)、狼瘡（lupus)(包括腎炎（nephritis)、腦炎（cerebritis)、兒科（pediatric)、非腎（non-renal)、腎外(extra-renal)、盤(pán)狀（discoid)、秀頂性狼瘡（alopecia))、幼年發(fā)作型（I型）糖尿病(juvenileonset(TypeI)diabetesmellitus)，包括兒科胰島素依賴性糖尿病(pediatricinsulin-dependentdiabetesmellitus(IDDM))、成人發(fā)作型糖尿?。↖I型糖尿病）（adultonsetdiabetesmellitus(TypeIIdiabetes))、自身免疫性糖尿病(autoimmunediabetes)、特發(fā)性尿崩癥（idiopathicdiabetesinsipidus)、與細(xì)胞因子及T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫反應(yīng)、結(jié)核病(tuberculosis)、結(jié)節(jié)?。╯arcoidosis)、肉芽腫（granulomatosis)，包括淋巴瘤樣肉芽腫（lymphomatoidgranulomatosis)、韋格納肉芽腫?。╓egener'sgranulomatosis)、粒細(xì)胞缺乏癥(agranulocytosis)、血管炎類(lèi)(vasculitides)，包括血管炎(vasculitis)(包括大血管血管炎（largevesselvasculitis)(包括風(fēng)濕性多肌痛(polymyalgiarheumatic)和巨細(xì)胞(Takayasu's)動(dòng)脈炎（giantcell(Takayasu's)arteritis))、中等血管血管炎(mediumvesselvasculitis)(包括Kawasaki?。↘awasaki'sdisease)和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎(polyarteritisnodosa))、顯微鏡下多動(dòng)脈炎(microscopicpolyarteritis)、CNS血管炎(CNSvasculitis)、壞死性、皮膚型或超敏性血管炎（necrotizing，cutaneous，orhypersensitivityvasculitis)、系統(tǒng)性壞死性血管炎（systemicnecrotizingvasculitis)，和ANCA相關(guān)的血管炎(ANCA-associatedvasculitis)，如Churg-Strauss血管炎或綜合征（Churg-Straussvasculitisorsyndrome(CSS)))、顳動(dòng)脈炎（temporalarteritis)、再生障礙性貧血（aplasticanemia)、自身免疫性再生障礙性貧血(autoimmuneaplasticanemia)、Coombs陽(yáng)性貧血（Coombspositiveanemia)、先天性再生障礙性貧血(DiamondBlackfananemia)、溶血性貧血(hemolyticanemia)或免疫性溶血性貧血（immunehemolyticanemia)，包括自身免疫性溶血性貧血（autoimmunehemolyticanemia(AIHA))、惡性貧血（perniciousanemia(anemiaperniciosa))、Addison病（Addison'sdisease)、純紅細(xì)胞貧血或發(fā)育不良（pureredcellanemiaoraplasia(PRCA))、因子VIII缺乏癥（FactorVIIIdeficiency)、血友病A(hemophiliaA)、自身免疫性嗜中性粒細(xì)胞減少癥（autoimmuneneutropenia)、泛白細(xì)胞減少癥(pancytopenia)、白細(xì)胞減少癥（leukopenia)、涉及白細(xì)胞滲出的疾?。╠iseasesinvolvingleukocytediapedesis)、CNS炎性疾?。–NSinflammatorydisorders)、多器官損傷綜合征(multipleorganinjurysyndrome)，如繼發(fā)于敗血癥、創(chuàng)傷或出血的那些多器官損傷綜合征、抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病(antigen-antibodycomplex-mediateddiseases)、抗腎小球基底膜?。╝nti-glomerularbasementmembranedisease)、抗磷脂抗體綜合征（anti-phospholipidantibodysyndrome)、變應(yīng)性神經(jīng)炎（allergicneuritis)、Bechet或Behcet?。˙echet'sorBehcet'sdisease)、Castleman綜合征(Castleman'ssyndrome)、Goodpasture綜合征（Goodpasture'ssyndrome)、Reynaud綜合征（Reynaud'ssyndrome)、Sjogren綜合征（Sjogren'ssyndrome)、Stevens_Johnson綜合征（Stevens-Johnsonsyndrome)、類(lèi)天皰瘡(pemphigoid)，如大皰性類(lèi)天皰瘡(pemphigoidbullous)和皮膚類(lèi)天皰瘡（skinpemphigoid)、天皰瘡（pemphigus)(包括尋常性天皰瘡(pemphigusvulgaris)、落葉狀天皰瘡(pemphigusfoliaceus)、粘膜類(lèi)天皰瘡性天皰瘡(pemphigusmucus-membranepemphigoid)和紅斑性天皰瘡（pemphiguserythematosus))、自身免疫性多內(nèi)分泌腺?。╝utoimmunepolyendocrinopathies)、Reiter病或綜合征（Reiter'sdiseaseorsyndrome)、免疫復(fù)合物腎炎（immunecomplexnephritis)、抗體-介導(dǎo)的腎炎（antibody-mediatednephritis)、視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitisoptica)、多發(fā)性神經(jīng)?。╬olyneuropathies)、慢性神經(jīng)?。╟hronicneuropathy)如IgM多發(fā)性神經(jīng)病（IgMpolyneuropathies)或IgM-介導(dǎo)的神經(jīng)?。↖gM-mediatedneuropathy)、血小板減少癥（thrombocytopenia)(如由心肌梗死患者發(fā)展），包括血栓性血小板減少性紫癜（thromboticthrombocytopenicpurpura(TTP))，和自身免疫性或免疫介導(dǎo)的血小板減少癥(autoimmuneorimmune-mediatedthrombocytopenia)，如特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathicthrombocytopenicpurpura(ITP))(包括慢性或急性ITP)、睪丸和卵巢的自身免疫病，包括自身免疫性睪丸炎（orchitis)和卵巢炎(oophoritis)、原發(fā)性甲狀腺功能減退癥(primaryhypothyroidism)、甲狀旁腺功能減退癥(hypoparathyroidism)、自身免疫性內(nèi)分泌疾病(autoimmuneendocrinediseases)(包括甲狀腺炎（thyroiditis)如自身免疫性甲狀腺炎(autoimmunethyroiditis)、橋本病(Hashimoto'sdisease)、慢性甲狀腺炎（chronicthyroiditis)(橋本甲狀腺炎(Hashimoto'sthyroiditis))或亞急性甲狀腺炎（subacutethyroiditis)、自身免疫性甲狀腺疾?。╝utoimmunethyroiddisease)、特發(fā)性甲狀腺功能減退癥（idiopathichypothyroidism)、Grave?。℅rave'sdisease)、多內(nèi)分泌腺綜合征（polyglandularsyndromes)，如自身免疫性多內(nèi)分泌腺綜合征（autoimmunepolyglandularsyndromes)(或多內(nèi)分泌腺內(nèi)分泌病綜合征(polyglandularendocrinopathysyndromes))、副腫瘤性綜合征（paraneoplasticsyndromes)，包括神經(jīng)系統(tǒng)副腫瘤綜合征（neurologicparaneoplasticsyndromes)如Lambert-Eaton月幾無(wú)力綜合征（Lambert-Eatonmyasthenicsyndrome)或Eaton-Lambert綜合征（Eaton-Lambertsyndrome)、僵人或僵者綜合征(stiff-manorstiff-personsyndrome)、腦脊髓炎（encephalomyelitis)，如變應(yīng)性腦脊髓炎（allergicencephalomyelitis)或過(guò)敏性腦脊髓炎（encephalomyelitisallergic)和實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎（experimentalallergicencephalomyelitis(EAE))、重癥肌無(wú)力(myastheniagravis)如胸腺腫瘤相關(guān)重癥肌無(wú)力（thymoma-associatedmyastheniagravis)、小腦變性（cerebellardegeneration)、神經(jīng)性肌強(qiáng)直（neuromyotonia)、視性眼陣攣或視性眼陣攣肌陣攣綜合征（opsoclonusoropsoclonusmyoclonussyndrome(OMS))，和感覺(jué)神經(jīng)?。╯ensoryneuropathy)、多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病（multifocalmotorneuropathy)、Sheehan綜合征（Sheehan'ssyndrome)、自身免疫性肝炎（autoimmunehepatitis)、慢性肝炎（chronichepatitis)、類(lèi)狼瘡肝炎（lupoidhepatitis)、巨細(xì)胞肝炎(giantcellhepatitis)、慢性活動(dòng)性肝炎(chronicactivehepatitis)或自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎（autoimmunechronicactivehepatitis)、淋巴細(xì)胞間質(zhì)性肺炎(lymphoidinterstitialpneumonitis)、閉塞性細(xì)支氣管炎（非移植物）抗NSIP(bronchiolitisobiiterans(non-transplant)vsNSIP)、Gui1lain-Barre綜合征(Guillain_Barr6syndrome)、Berger?。˙erger'sdisease)(IgA神經(jīng)病（IgAnephropathy))、特發(fā)性IgA神經(jīng)?。╥diopathicIgAnephropathy)、線狀I(lǐng)gA皮膚病(linearIgAdermatosis)、原發(fā)性膽汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis)、肺硬變(pneumonocirrhosis)、自身免疫性腸病綜合征（autoimmuneenteropathysyndrome)、腹腔疾?。–eliacdisease)、乳糜瀉（celiacsprue)(谷蛋白腸?。╣lutenenteropathy))、難治性口炎性腹瀉(refractorysprue)、特發(fā)性口炎性腹瀉（idiopathicsprue)、冷球蛋白血癥（cryoglobulinemia)、肌萎縮側(cè)索硬化(amyl〇trophiclateralsclerosis)(ALS;LouGehrig?。?、冠狀動(dòng)脈病（coronaryarterydisease)、自身免疫性耳病（autoimmuneeardisease)如自身免疫性內(nèi)耳病(autoimmuneinnereardisease(AIED))、自身免疫性聽(tīng)力喪失（autoimmunehearingloss)、視性眼陣攣肌陣攣綜合征（opsoclonusmyoclonussyndrome(OMS))、多軟骨炎(polychondritis)如難治性或復(fù)發(fā)性多軟骨炎(refractoryorrelapsedpolychondritis)、肺泡蛋白沉著癥（pulmonaryalveolarproteinosis)、淀粉樣變性病（amyloidosis)、鞏膜炎（scleritis)、非癌性淋巴細(xì)胞增多（non-cancerouslymphocytosis)、原發(fā)性淋巴細(xì)胞增多（primarylymphocytosis)，其包括單克隆B細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多（monoclonalBcelllymphocytosis)(例如，良性單克隆免疫球蛋白病(benignmonoclonalgammopathy)和意義不確定性單克隆免疫球蛋白?。╩onoclonalgarnmopathyofundeterminedsignificance(MGUS))、外周神經(jīng)?。╬eripheralneuropathy)、副腫瘤性綜合征（paraneoplasticsyndrome)、離子通道病(channelopathies)，如癲癇(epilepsy)、偏頭痛(migraine)、心律失常(arrhythmia)、肌肉病(musculardisorders)、耳聾（deafness)、失明（blindness)、周期性麻瘦（periodicparalysis)，和CNS的離子通道病（channelopathiesoftheCNS)、自閉癥(autism)、炎性肌?。╥nflammatorymyopathy)、局灶節(jié)段性腎小球硬化（focalsegmentalglomerulosclerosis(FSGS))、內(nèi)分泌眼?。╡ndocrineophthalmopathy)、葡萄膜視網(wǎng)膜炎(uveoretinitis)、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎（chorioretinitis)、自身免疫性肝病（autoimmunehepatologicaldisorder)、纖維肌痛（fibromyalgia)、多發(fā)性內(nèi)分泌衰竭（multipleendocrinefailure)、Schmidt綜合征（Schmidt'ssyndrome)、腎上腺炎(adrenalitis)、胃萎縮（gastrieatrophy)、早老性癡呆（preseniledementia)、脫髓鞘病（demyelinatingdiseases)，如自身免疫性脫髓鞘病(autoimmunedemyelinatingdiseases)、糖尿病性腎病（diabeticnephropathy)、Dressier綜合征（Dressler'ssyndrome)、斑秀（alopeciaareata)、CREST綜合征（CRESTsyndrome)(?丐化（calcinosis)、雷諾現(xiàn)象（Raynaud'sphenomenon)、食管運(yùn)動(dòng)功能失常（esophagealdysmotility)、指端硬化（sclerodactyly)和毛細(xì)血管擴(kuò)張癥（telangiectasia))、男性和女性自身免疫性不育(maleandfemaleautoimmuneinfertility)、混合型結(jié)締組織?。╩ixedconnectivetissuedisease)、Chaga病（Chagas'disease)、風(fēng)濕熱（rheumaticfever)、反復(fù)流產(chǎn)（recurrentabortion)、霉塵肺（farmer'slung)、多形紅斑（erythemamultiforme)、心臟切開(kāi)術(shù)后綜合征（post-cardiotomysyndrome)、庫(kù)欣綜合征（Cushing'ssyndrome)、養(yǎng)鳥(niǎo)人肺（bird-faneier'slung)、變應(yīng)性肉芽腫性血管炎（allergicgranulomatousangiitis)、良性淋巴細(xì)胞血管炎（benignlymphocyticangiitis)、Alport綜合征（Alport'ssyndrome)、肺泡炎(alveolitis)，如過(guò)敏性肺泡炎（allergicalveolitis)和纖維化肺泡炎（fibrosingalveolitis)、間質(zhì)性肺病（interstitiallungdisease)、輸血反應(yīng)（transfusionreaction)、麻風(fēng)?。╨eprosy)、癥疾（malaria)、利什曼?。╨eishmaniasis)、kypanosomiasis、血吸蟲(chóng)病（schistosomiasis)、蟲(chóng)回蟲(chóng)病（ascariasis)、曲霉病(aspergillosis)、Sampter綜合征（Sampter'ssyndrome)、Caplan綜合征（Caplan'ssyndrome)、登革熱（dengue)、心內(nèi)膜炎（endocarditis)、心肌內(nèi)膜纖維化(endomyocardialfibrosis)、彌漫性間質(zhì)性肺纖維化(diffuseinterstitialpulmonaryfibrosis)、間質(zhì)性肺纖維化（interstitiallungfibrosis)、特發(fā)性肺纖維化（idiopathicpulmonaryfibrosis)、囊性纖維化(cysticfibrosis)、眼內(nèi)炎(endophthalmitis)、持久性隆起性紅斑（erythemaelevaturnetdiutinum)、胎兒幼紅細(xì)胞增多癥（erythroblastosisfetalis)、嗜酸性細(xì)胞增多性肌膜炎(eosinophilicfaciitis)、Shulman綜合征(Shulman，ssyndrome)、Felty綜合征（Felty'ssyndrome)、絲蟲(chóng)病（flariasis)、睫狀體炎(cyclitis)，如慢性睫狀體炎（chroniccyclitis)、異色性睫狀體炎（heterochroniccyclitis)、虹膜睫狀體炎（iridocyclitis)或Fuch睫狀體炎(Fuch，scyclitis)、Henoch_Schonlein紫療（Henoch-Schonleinpurpura)、人免疫缺陷病毒（HIV)感染（humanimmunodeficiencyvirus(HIV)infection)、艾柯病毒感染（echovirusinfection)、心肌病(cardiomyopathy)、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease)、細(xì)小病毒感染(parvovirusinfection)、風(fēng)疹病毒感染（rubellavirusinfection)、接種后綜合征（post-vaccinationsyndromes)、先天性風(fēng)疫感染（congenitalrubellainfection)、Epstein_Barr病毒感染（Epstein-Barrvirusinfection)、腿腺炎（mumps)、Evan綜合征（Evan'ssyndrome)、自身免疫性性腺衰竭（autoimmunegonadalfailure)、Sydenham舞蹈病(Sydenham'schorea)、鏈球菌感染后腎炎(post-streptococcalnephritis)、閉塞性血檢血管炎（thromboangitisubiterans)、甲狀腺毒癥（thyrotoxicosis)、脊髓癆（tabesdorsalis)、脈絡(luò)膜炎(chorioiditis)、巨細(xì)胞多肌痛(giantcellpolymyalgia)、內(nèi)分泌眼?。╡ndocrineophthamopathy)、慢性超敏性肺炎（chronichypersensitivitypneumonitis)、干燥性角膜結(jié)膜炎（keratoconjunctivitissicca)、流行性角膜結(jié)膜炎(epidemickeratoconjunctivitis)、特發(fā)性腎病綜合征（idiopathicnephriticsyndrome)、微小病變性腎病(minimalchangenephropathy)、良性家族性和缺血-再灌注損傷(benignfamilialandischemia-reperfusioninjury)、視網(wǎng)膜自體免疫（retinalautoimmunity)、關(guān)節(jié)炎癥（jointinflammation)、支氣管炎(bronchitis)、慢性阻塞性氣道疾?。╟hronicobstructiveairwaydisease)、石夕肺?。╯ilicosis)、口瘡（aphthae)、口瘡性口炎（aphthousstomatitis)、動(dòng)脈硬化性疾?。╝rterioscleroticdisorders)、aspermiogenese、自身免疫性溶血（autoimmunehemolysis)、Boeck病（Boeck'sdisease)、冷球蛋白血癥（cryoglobulinemia)、Dupuytren攣縮（Dupuytren'scontracture)、晶狀體蛋白過(guò)敏性眼內(nèi)炎（endophthalmiaphacoanaphylactica)、過(guò)敏性腸炎（enteritisallergica)、麻風(fēng)結(jié)節(jié)性紅斑（erythemanodosumleprosum)、特發(fā)性面擁（idiopathicfacialparalysis)、慢性疲勞綜合征（chronicfatiguesyndrome)、風(fēng)濕熱（febrisrheumatica)、Hamman_Rich病（Hamman-Rich'sdisease)、感覺(jué)神經(jīng)性聽(tīng)力喪失(sensoneuralhearingloss)、陣發(fā)性血紅蛋白尿(haemoglobinuriaparoxysmatica)、性腺功能減退癥（hypogonadism)、局限性回腸炎（ileitisregionalis)、白細(xì)胞減少癥(leucopenia)、傳染性單核細(xì)胞增多癥(mononucleosisinfectiosa)、橫貫性脊髓炎(traversemyelitis)、原發(fā)性特發(fā)性粘液性水腫（primaryidiopathicmyxedema)、腎變病（nephrosis)、交感性眼炎（ophthalmiasymphatica)、肉芽腫性睪丸炎（orchitisgranulomatosa)、胰腺炎（pancreatitis)、急性多發(fā)性神經(jīng)根炎（polyradiculitisacuta)、壞疽性膿皮?。╬yodermagangrenosum)、奎汶氏甲狀腺炎（Quervain'sthyreoiditis)、獲得性脾萎縮(acquiredspenicatrophy)、因抗精子抗體所致的不育、非惡性胸腺腫瘤(non-malignantthymoma)、白癜風(fēng)（vitiligo)、SCID和Epstein-Barr病毒相關(guān)性疾病、獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmunedeficiencysyndrome(AIDS))、寄生蟲(chóng)病(parasiticdiseases)如利什曼原蟲(chóng)(Lesihmania)、中毒性休克綜合征(toxic-shocksyndrome)、食物中毒（foodpoisoning)、涉及T細(xì)胞浸潤(rùn)的病狀（conditionsinvolvinginfiltrationofTcells)、白細(xì)胞黏附性缺陷（leukocyte-adhesiondeficiency)、與細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)（acuteanddelayedhypersensitivity)相關(guān)的免疫應(yīng)答、涉及白細(xì)胞滲出（leukocytediapedesis)的疾病、多器官損傷綜合征(multipleorganinjurysyndrome)、抗原-抗體復(fù)合物-介導(dǎo)的疾病(antigen-antibodycomplex-mediateddiseases)、抗腎小球基底膜病（antiglomerularbasementmembranedisease)、變應(yīng)性神經(jīng)炎(allergicneuritis)、自身免疫性多內(nèi)分泌腺?。╝utoimmunepolyendocrinopathies)、卵巢炎（oophoritis)、原發(fā)性粘液水腫(primarymyxedema)、自身免疫性萎縮性胃炎（autoimmuneatrophicgastritis)、交感性眼炎（sympatheticophthalmia)、風(fēng)濕性疾病(rheumaticdiseases)、混合型結(jié)締組織病(mixedconnectivetissuedisease)、腎病綜合征（nephroticsyndrome)、膜島炎(insulitis)、多內(nèi)分泌腺衰竭（polyendocrinefailure)、外周神經(jīng)病（peripheralneuropathy)、自身免疫性多內(nèi)分泌腺綜合征I型（autoimmunepolyglandularsyndrometypeI)、成年發(fā)作型特發(fā)性甲狀旁腺功能減退癥（adult-onsetidiopathichypoparathyroidism(AOIH))、全秀（alopeciatotalis)、擴(kuò)張型心肌?。╠ilatedcardiomyopathy)、獲得性大皰性表皮松解癥（epidermolisisbullosaacquisita(EBA))、血色素沉著癥（hemochromatosis)、心肌炎（myocarditis)、腎病綜合征（nephroticsyndrome)、原發(fā)性硬化膽管炎(primarysclerosingcholangitis)、化膿性或非化膿性鼻竇炎（purulentornonpurulentsinusitis)、急性或慢性鼻竇炎（acuteorchronicsinusitis)、篩竇炎（ethmoidsinusitis)、額竇炎（frontalsinusitis)、上頒竇炎(maxillarysinusitis)或蝶竇炎（sphenoidsinusitis)、自身免疫性起庖病(autoimmuneblisteringdisease)、嗜酸細(xì)胞相關(guān)病癥(eosinophil-relateddisorder)如嗜酸粒細(xì)胞增多癥（eosinophi1ia)、特發(fā)性嗜酸粒細(xì)胞增多癥（idiopathichypereosinophi1syndrome)、嗜酸細(xì)胞增多性肺浸潤(rùn)(pulmonaryinfiltrationeosinophilia)、嗜酸粒細(xì)胞增多-肌痛綜合征（eosinophilia-myalgiasyndrome)、Loffler綜合征（Loffler'ssyndrome)、慢性嗜酸細(xì)胞性肺炎(chroniceosinophilicpneumonia)、熱帶肺嗜酸粒細(xì)胞增多癥（tropicalpulmonaryeosinophilia)、支氣管肺曲霉病（bronchopneumonicaspergillosis)、曲霉腫（aspergilloma)、或含有嗜酸性細(xì)胞的肉芽腫（granulomascontainingeosinophils)、過(guò)敏反應(yīng)(anaphylaxis)、血清陰性脊椎關(guān)節(jié)炎（seronegativespondyloarthritides)、多內(nèi)分泌腺自身免疫?。╬olyendocrineautoimmunedisease)、硬化膽管炎（sclerosingcholangitis)、鞏膜（sclera)、鞏膜外層（episclera)、慢性粘膜皮膚念珠菌?。╟hronicmucocutaneouscandidiasis)、Bruton綜合征（Bruton'ssyndrome)、嬰兒期暫時(shí)性低丫球蛋白血癥（transienthypogammaglobulinemiaofinfancy)、Wiskott_Aldrich綜合征(Wiskott-Aldrichsyndrome)、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(ataxiatelangiectasia)、與膠原病相關(guān)的自身免疫功能紊亂(autoimmunedisordersassociatedwithcollagendisease)、風(fēng)濕?。╮heumatism)、神經(jīng)學(xué)疾?。╪eurologicaldisease)、缺血性再灌注?。╥schemicre-perfusiondisorder)、血壓下降反應(yīng)(reductioninbloodpressureresponse)、血管功能障石導(dǎo)(vasculardysfunction)、脈管擴(kuò)張（antgiectasis)、組織損傷（tissueinjury)、心血管缺血（cardiovascularischemia)、痛覺(jué)過(guò)敏（hyperalgesia)、腦缺血（cerebralischemia)，和伴血管化疾病(diseaseaccompanyingvascularization)、變應(yīng)性超敏病（allergichypersensitivitydisorders)、腎小球腎炎（glomerulonephritides)、再灌注損傷(reperfusioninjury)、心肌或其他組織的再灌注損傷、具有急性炎癥組分的皮膚病（dermatoseswithacuteinflammatorycomponents)、急性紫療性腦膜炎（acutepurulentmeningitis)或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病、眼和眼眶炎性疾?。╫cularandorbitalinflammatorydisorders)、粒細(xì)胞輸血相關(guān)綜合征（granulocytetransfusion-associatedsyndromes)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中毒（cytokine-inducedtoxicity)、急性嚴(yán)重炎癥(acuteseriousinflammation)、慢性頑固性炎癥（chronicintractableinflammation)、腎盂炎(pyelitis)、肺硬變（pneumonocirrhosis)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabeticretinopathy)、糖尿病性大動(dòng)脈?。╠iabeticlarge-arterydisorder)、動(dòng)脈內(nèi)增生(endarterialhyperplasia)、消化性潰瘍(pepticulcer)、心辦炎(valvulitis)和子宮內(nèi)膜異位（endometriosis)〇[0089]"變應(yīng)性疾病"在本文中是其中個(gè)體對(duì)正常情況下無(wú)免疫原性的物質(zhì)過(guò)度敏感并且發(fā)起針對(duì)這種物質(zhì)的免疫反應(yīng)的疾病或病癥。變應(yīng)性疾病總體上以肥大細(xì)胞被IgE活化為特征，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，所述炎癥反應(yīng)可能產(chǎn)生多種癥狀如良性癥狀如鼻漏直至危及生命的過(guò)敏性休克和死亡。變應(yīng)性疾病的例子包括但不限于哮喘（例如，過(guò)敏性哮喘）、過(guò)敏性鼻炎(例如，干草熱）、過(guò)敏性皮炎(例如，濕疹）、接觸性皮炎、食物過(guò)敏和蕁麻疹。[0090]上文所列并非包括一切，并且技術(shù)人員將理解疾病或病癥可以落于多種分類(lèi)范圍內(nèi)。例如，哮喘既是變應(yīng)性疾病，又是炎性疾病，并且被某些臨床醫(yī)生視為一種自身免疫疾病。[0091]術(shù)語(yǔ)"癌癥"和"癌性的"指或描述哺乳動(dòng)物中一般以失調(diào)的細(xì)胞增殖為特征的生理狀況。這個(gè)定義中包括良性癌和惡性癌。[0092]術(shù)語(yǔ)"癌前期"指一般先于癌或形成癌的狀況或生長(zhǎng)。[0093]如本文所用的術(shù)語(yǔ)"增生性疾病"是與某種程度的異常細(xì)胞增殖相關(guān)的病或病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞增生性疾病是癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥選自乳腺癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、腎癌、前列腺癌、肝癌、頭頸癌、黑素瘤、卵巢癌、間皮瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。[0094]如本文所用的術(shù)語(yǔ)"腫瘤"指全部贅生性細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，無(wú)論為惡性或良性，以及全部癌前細(xì)胞和癌細(xì)胞及組織。[0095]"非轉(zhuǎn)移性"意指，癌為良性的或留在原發(fā)性部位、未穿透入淋巴系統(tǒng)或血管系統(tǒng)或穿透至原發(fā)性部位之外的組織。通常，非轉(zhuǎn)移性癌是處于〇期、I期或II期癌及偶爾地III期癌的任何癌癥。[0096]"受試者"是脊椎動(dòng)物，優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地是人。哺乳動(dòng)物包括，但不限于家畜(如牛）、競(jìng)賽動(dòng)物、寵物(如貓、犬和馬）、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、小鼠和大鼠。[0097]II?雙重特異性抗體的產(chǎn)生[0098]重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)含有顯著更高的序列多樣性并且比輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vl)更經(jīng)常地貢獻(xiàn)抗原識(shí)別決定簇。我們的先前結(jié)果首次證實(shí)，可以改變輕鏈可變結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生具有雙重特異性的單一抗體(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)20080069820和Bostrom等人，Science232:1610-1614(2009)，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用方式完整并入本文）。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)改變Vh中的氨基酸殘基(包括在缺少對(duì)Vl的突變的情況下），從具有對(duì)抗原識(shí)別關(guān)鍵的Vl殘基的抗體，生成雙重特異性抗體。下文詳細(xì)描述這些新的和出乎意料的方法。[0099]我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以在Vl中鑒定特定殘基，這些殘基當(dāng)帶靜電或疏水時(shí)表明該Vl對(duì)抗原識(shí)別是關(guān)鍵的。在這種情況下，可以通過(guò)抗體VH的改變，產(chǎn)生與第一表位和第二表位結(jié)合的雙重特異性抗體。特別地，如果抗體在位置32、50或91(按Kabat編號(hào))處的任一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸殘基帶靜電（例如，酪氨酸)或疏水(例如，色氨酸），則可以在Vh的編碼一個(gè)或多個(gè)溶劑可及性氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)密碼子處，改變編碼該抗體VH的核酸序列。[0100]在多種實(shí)施方案中，可以改變的VH中殘基包括氨基酸33、34、50-58或95-97中的任一者或多者。任選地，除這些重鏈殘基之外，還可以改變輕鏈的氨基酸殘基93-96?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(包括但不限于結(jié)構(gòu)作圖法和丙氨酸掃描誘變法)確定重鏈的溶劑可及性或抗原識(shí)別重要性。[0101]隨后將Vl和改變的Vh表達(dá)(例如，作為文庫(kù))并且選擇與第一表位和第二表位特異性結(jié)合的包含Vl和改變的Vh的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段。除Vh之外，還可以改變或可以不改變初始抗體的Vl。除Vh之外，還可以改變或可以不改變初始抗體的構(gòu)架區(qū)中的氨基酸殘基。[0102]通過(guò)以上選擇方法鑒定的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段可以通過(guò)例如親和力成熟法或本領(lǐng)域其他已知方法進(jìn)一步修飾，以增加對(duì)一種或兩種靶抗原的親和力。親和力成熟選擇法可以包括應(yīng)用大規(guī)模平行測(cè)序方案(例如，深度測(cè)序、超深度測(cè)序或下一代測(cè)序法）以鑒定有助于結(jié)合一種或兩種靶抗原（例如，有助于靶抗原親和力增加）的殘基（例如，溶劑暴露的或非溶劑暴露的殘基）。參見(jiàn)，例如，F(xiàn)owler等人，Nat.Methods.7(9):741-746,2010。也可以修飾雙重特異性抗體以增加穩(wěn)定性或半壽期，或減少免疫原性。這類(lèi)修飾是技術(shù)人員已知的。[0103]III?治療性用途[0104]結(jié)合IL4和IL5(例如，B1、E7和E7親和力成熟變體)或IL4和IL13(例如，F(xiàn)1和F2)的本文所述雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段可以用來(lái)治療、抑制或預(yù)防疾病，如變應(yīng)性、炎性和自身免疫疾?。ɡ纾?；IL4介導(dǎo)的疾?。籌L5介導(dǎo)的疾??；IL13介導(dǎo)的疾?。籌L4/IL5介導(dǎo)的疾病;IL4/IL13介導(dǎo)的疾病;和/或增生性疾病(例如，癌癥）。[0105]上文描述了可以用雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段治療的炎性和自身免疫疾病或病癥的例子。在一些實(shí)施方案中，疾病或病癥包括，但不限于哮喘如支氣管哮喘、支氣管哮喘和自身免疫性哮喘。[0106]哮喘被描述為涉及氣道炎癥、高反應(yīng)性和阻塞的慢性肺病。在生理學(xué)上，將氣道高反應(yīng)性記錄為用乙酰甲膽堿或組胺支氣管激發(fā)后減少的支氣管氣流。激發(fā)氣道阻塞的其他觸發(fā)物包括冷空氣、鍛煉、病毒性上呼吸道感染、吸煙和呼吸道變應(yīng)原。因變應(yīng)原所致的支氣管激發(fā)可以誘導(dǎo)免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的早期支氣管氣流迅速下降，在許多患者中接著是IgE介導(dǎo)的晚期反應(yīng)，其中支氣管氣流下降持續(xù)4-8小時(shí)。早期反應(yīng)由炎性物質(zhì)（如組胺、PGD2、白三烯、類(lèi)胰蛋白酶和血小板激活因子(PAF))的急性釋放引起，而晚期反應(yīng)由從頭合成的促炎細(xì)胞因子(例如TNFa、IL4、IL13)和趨化因子(例如MCP-1和MIP-la)引起(Busse等人，引自：Allergy:PrinciplesandPractice，Middleston編著，1173(1998))。在慢性哮喘患者中，持續(xù)性肺癥狀由提高的Th2細(xì)胞反應(yīng)介導(dǎo)。據(jù)信Th2細(xì)胞因子在疾病中發(fā)揮重要作用（Larche等人，J?A1lergyClin?Immuno1?，111:450(2003))，特別是，如嚙齒類(lèi)動(dòng)物哮喘模型所示，氣道中由具有NK表型的Th2細(xì)胞(NKT)產(chǎn)生的IL13和IL4(Akbari等人，NatureMed.,9:582(2003))。哮喘性氣道的大體病變顯示肺過(guò)度充氣、平滑肌肥大、網(wǎng)狀基底層增厚、粘膜水腫、上皮細(xì)胞脫落、纖毛細(xì)胞破壞和粘液腺過(guò)度分泌。微觀上，哮喘以支氣管組織、支氣管分泌物和粘液中存在增加數(shù)目的嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞為特征。最初，活化的CD4+T-淋巴細(xì)胞將白細(xì)胞從血流召集至氣道。該活化的T-淋巴細(xì)胞還指導(dǎo)炎性介質(zhì)從嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞釋放。此外，Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL4、IL5、IL9和IL13JL4,連同IL13-起，發(fā)送從IgM抗體轉(zhuǎn)換成IgE抗體的信號(hào)。[0107]膜結(jié)合型IgE分子通過(guò)變應(yīng)原交聯(lián)，造成肥大細(xì)胞脫粒，釋放持久化氣道炎癥的組胺、白三烯和其他介質(zhì)。IL5激活嗜酸性粒細(xì)胞的召集和活化?；罨姆蚀蠹?xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞也產(chǎn)生有助于持久化炎癥的細(xì)胞因子。肺中這些重復(fù)的炎癥循環(huán)，加上肺組織損傷和隨后的修復(fù)，可以造成氣道的長(zhǎng)期結(jié)構(gòu)變化（"重塑"）。[0108]中度哮喘目前用每日吸入型抗炎皮質(zhì)類(lèi)固醇或肥大細(xì)胞抑制劑如色甘酸鈉(Cromolynsodium)或奈多羅米(nedocromil)治療，根據(jù)需要外加吸入型02-激動(dòng)劑(每日3-4次）以減輕突現(xiàn)癥狀(breakthroughsymptom)或變應(yīng)原誘導(dǎo)或運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的哮喘。色甘酸鈉和奈多羅米阻斷支氣管痙攣和炎癥，但是通常僅對(duì)與變應(yīng)原或鍛煉相關(guān)的哮喘有效并且一般僅對(duì)青少年哮喘有效。吸入型皮質(zhì)類(lèi)固醇改善炎癥、氣道高反應(yīng)性和阻塞，并且減少急性惡化的次數(shù)。然而，需要至少一個(gè)月才會(huì)有明顯效果，并需要多達(dá)一年才會(huì)出現(xiàn)明顯改善。最頻繁的副作用是嘶啞及口部真菌性感染，即，念珠菌病。已經(jīng)報(bào)道了更嚴(yán)重的副作用，例如，局部腎上腺抑制、生長(zhǎng)抑制和減少的骨形成，但是僅在使用更高劑量下如此。倍氯米松(beclomethasone)，曲安西龍（triamcinolone)和氣尼縮松（flunisolide)可能具有相似的效力；而布地奈德(budesonide)和氟替卡松(fluticasone)更強(qiáng)力并且據(jù)報(bào)道稱具有更少的全身性副作用。[0109]甚至病情輕度的患者也顯示氣道炎癥，包括活化的T細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)粘膜和上皮。T細(xì)胞和肥大細(xì)胞釋放促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞生長(zhǎng)和成熟和IgE抗體產(chǎn)生的細(xì)胞因子，并且這些細(xì)胞因子轉(zhuǎn)而增加微血管通透性、破壞上皮并刺激神經(jīng)反射和粘液分泌腺。結(jié)果是氣道高反應(yīng)性，支氣管收縮和過(guò)度分泌，表現(xiàn)為哮鳴、咳嗽、和呼吸困難。[0110]傳統(tǒng)上，哮喘已經(jīng)用口服和吸入型支氣管擴(kuò)張劑治療。這些藥劑幫助緩解哮喘癥狀，但是對(duì)作為基礎(chǔ)的炎癥無(wú)所作為。在過(guò)去10年期間認(rèn)識(shí)到炎癥在哮喘病因?qū)W中的重要性已經(jīng)導(dǎo)致皮質(zhì)類(lèi)固醇的使用增加，但是許多患者繼續(xù)患有無(wú)法控制的哮喘。[0111]對(duì)IL4、IL5、和/或IL13具有特異性的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段將靶向多個(gè)致病途徑并且可以作為治療藥單獨(dú)或與額外治療藥(例如，本領(lǐng)域已知的或上文描述的那些)組合用于治療哮喘。[0112]在額外的實(shí)施方案中，雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段可以用來(lái)治療癌癥。術(shù)語(yǔ)"癌癥"包括一系列增生性病癥，包括但不限于癌前生長(zhǎng)、良性腫瘤和惡性腫瘤。良性腫瘤保持局限在發(fā)源部位并且不具有浸潤(rùn)、侵襲或轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處部位的能力。惡性腫瘤可以侵入并損傷它們周?chē)钠渌M織。它們還可以獲得突破其起源部位并且擴(kuò)散(轉(zhuǎn)移)至身體其他部位的能力，這通常經(jīng)血流或經(jīng)其中存在淋巴結(jié)的淋巴系統(tǒng)進(jìn)行。原發(fā)腫瘤根據(jù)原發(fā)腫瘤起源的組織類(lèi)型分類(lèi);轉(zhuǎn)移性腫瘤根據(jù)從中衍生該癌細(xì)胞的組織類(lèi)型分類(lèi)。隨時(shí)間推移，惡性腫瘤細(xì)胞變得更為異常并且顯得更不像正常細(xì)胞。癌細(xì)胞外觀的這種變化被稱作腫瘤分級(jí)，可以將癌細(xì)胞描述為充分分化的、中等分化的、不良分化的或未分化的。充分分化的細(xì)胞在外觀上相當(dāng)正常并且與它們所源自的正常細(xì)胞相似。未分化的細(xì)胞是已經(jīng)變得十分異常以致于不再可能確定其起源的細(xì)胞。[0113]IV.劑量和制劑[0114]抗體或抗體片段組合物將以符合良好醫(yī)學(xué)實(shí)踐的方式配制、定劑量和施用。在這種情況下考慮的因素包括正在治療的具體病癥、正在治療的具體哺乳動(dòng)物、個(gè)體患者的臨床狀況、病癥原因、送遞藥物的部位、施用方法、施用計(jì)劃和醫(yī)療執(zhí)業(yè)者已知的其他因素。"待施用的抗體或抗體片段的治療有效量將由此類(lèi)考慮事項(xiàng)決定，并且是為防止、改善或治療變應(yīng)性、炎性、自身免疫性或增生性疾病或病癥或其癥狀必需的最小量。施用本發(fā)明抗體或抗體片段的劑量和時(shí)序?qū)⑷Q于多種臨床因素，包括受試者的總體健康和(例如，變應(yīng)性疾病的)癥狀的嚴(yán)重程度。本發(fā)明包括抗體或抗體片段用于治療、預(yù)防或減少受試者中變應(yīng)性疾病或其癥狀、或出現(xiàn)變應(yīng)性疾病的風(fēng)險(xiǎn)的用途?？贵w或抗體片段可以在任何時(shí)間（例如，在診斷或檢測(cè)到變應(yīng)性疾病或與變應(yīng)性疾病相關(guān)的狀況后)施用，或在確定變應(yīng)性疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)后，在尚未診斷患有變應(yīng)性疾病但面臨發(fā)生這種病癥的風(fēng)險(xiǎn)的受試者(例如，具有受損的免疫系統(tǒng)或正在因受損的免疫系統(tǒng)而治療的受試者）中，用于預(yù)防變應(yīng)性疾病。[0115]可以將本發(fā)明的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段以多種方式配制和施用，例如，已知用于特定適應(yīng)癥的那些途徑，包括但不限于吸入、局部、經(jīng)口、皮下、支氣管注射、靜脈內(nèi)、腦內(nèi)、鼻內(nèi)、透皮、腹腔內(nèi)、肌內(nèi)、肺內(nèi)、陰道、直腸、動(dòng)脈內(nèi)、腦室椎管內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、病灶內(nèi)、腸胃外地、腦室內(nèi)或眼內(nèi)途徑。例如，抗體或抗體片段，可以采取下述形式：丸劑、片劑、膠囊劑、液體劑或口服施用緩釋片劑;或靜脈內(nèi)、皮下施用液體劑;局部施用的聚合物或其他緩釋溶媒;局部施用的油膏劑、乳膏劑、凝膠劑、液體劑或貼劑。[0116]如果廣泛副作用或毒性與IL4、IL5或IL13拮抗作用相關(guān)，則可能特別需要局部施用。離體策略也可以用于治療性應(yīng)用。離體策略包括用編碼雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)從受試者獲得的細(xì)胞。隨后將轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞返回這位受試者。細(xì)胞可以是廣泛類(lèi)型細(xì)胞的任一種，包括而不限于造血細(xì)胞（例如，骨髓細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、T細(xì)胞或B細(xì)胞）、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞或肌肉細(xì)胞。[0117]例如，雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段的連續(xù)全身性輸注或定期注射可以用來(lái)治療或預(yù)防病癥。治療可以繼續(xù)從1天直至受試者終生的一段時(shí)間、更優(yōu)選地1至1〇〇天，并且最優(yōu)選地1至20天，以及最優(yōu)選地，直至變應(yīng)性、炎性、自身免疫性或增生性疾病或病癥或其癥狀減少或移除。劑量根據(jù)化合物和病狀嚴(yán)重程度變動(dòng)。雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段可以通過(guò)使用恒定流量或可編程流量的植入式栗輸注或通過(guò)定期注射，連續(xù)地施用。也可以使用緩釋系統(tǒng)。在某些情況下，半透性、植入式膜裝置也可用作遞送雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段的手段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段局部施用，例如，通過(guò)吸入法，并且可以定期重復(fù)。也可以利用肺施用法，例如，通過(guò)使用吸入器或霧化器和含有霧化劑的制劑?？贵w也可以按干粉組合物的形式施用至患者的肺中（參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,514,496)。[0118]雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段的劑量將取決于其他臨床因素如受試者體重和狀況及化合物的施用途徑。為了治療受試者，可以施用大約0.lmg/kg至500mg/kg體重之間的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段。更優(yōu)選的范圍是lmg/kg至50mg/kg體重，最優(yōu)選的范圍是lmg/kg至25mg/kg體重。取決于抗體或抗體片段在具體受試者中的半壽期，抗體或抗體片段可以每天數(shù)次施用至每周一次施用。本發(fā)明的方法提供單一以及多次施用，同時(shí)或經(jīng)延長(zhǎng)的時(shí)間段給予。[0119]優(yōu)選地，將雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段腸胃外地施用或通過(guò)連續(xù)輸注法靜脈內(nèi)施用或通過(guò)吸入器局部施用。劑量和劑量方案取決于疾病的嚴(yán)重程度和受試者的總體健康。為了腸胃外施用，可以將雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段與可藥用腸胃外溶媒結(jié)合配制在單位劑量可注射形式(溶液劑、懸浮劑、乳劑）中。這類(lèi)溶媒是固有無(wú)毒和無(wú)治療性的。這類(lèi)溶媒的例子是水、鹽水、林格液、右旋糖溶液和5%人血清白蛋白。也可以使用非水性溶媒如非揮發(fā)性油和油酸乙酯。脂質(zhì)體可以作為載體使用。該溶媒可以含有少量添加物，如增強(qiáng)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，例如緩沖劑和防腐劑。雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段一般以約lmg/ml至10mg/ml的濃度配制在這類(lèi)溶媒中。為了通過(guò)吸入施用，雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段可以按任何合適的方法配制以形成本發(fā)明的氣溶膠形式。包含雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物在具有或沒(méi)有可藥用賦形劑的情況下?lián)]發(fā)或霧化，以產(chǎn)生可以凝結(jié)并使用例如吸入器直接吸入肺中的蒸氣?？伤幱觅x形劑可以是揮發(fā)的，并且這類(lèi)賦形劑的類(lèi)別是本領(lǐng)域已知的并且包括，而不限于氣態(tài)、超臨界流體、液體和固態(tài)溶劑。這些類(lèi)別內(nèi)部的示例性載體包括而不限于水、無(wú)菌鹽水、生理緩沖液溶液如磷酸鹽緩沖鹽水、萜類(lèi)、醇類(lèi)、丙二醇、甘油和其他相似醇、干冰、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、超臨界二氧化碳及其混合物。[0120]需要的劑量取決于施用途徑的選擇;制劑的性質(zhì);受試者疾病的性質(zhì);受試者的體格、體重、表面積、年齡和性別;正在施用的其他藥物和主治醫(yī)生的判斷。鑒于可獲得的多肽和片段的多樣性和多種施用途徑的不同效率，可以預(yù)期所需劑量的變化很大。例如，預(yù)計(jì)口服施用需要比通過(guò)靜脈注射施用更高的劑量。如本領(lǐng)域中充分理解，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的經(jīng)驗(yàn)性優(yōu)化途徑，調(diào)整這些劑量水平的變動(dòng)。施用可以是單次或多次(例如，2次、3次、6次、8次、10次、20次、50次、100次、150次或更多次）。將多肽包囊于合適的遞送載具(例如，聚合性微?；蛑踩胧窖b置)中可以增加遞送效率，特別對(duì)于口服遞送而言。[0121]在治療哮喘的一個(gè)實(shí)施方案中，雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段不必，但可選地，隨目前用來(lái)預(yù)防或治療哮喘或哮喘形成風(fēng)險(xiǎn)的一種或多種物質(zhì)一起配制或與之組合(同時(shí)或依次)施用。抗體或其抗原結(jié)合片段可以與例如IgE拮抗劑、支氣管擴(kuò)張藥物(例如，02-腎上腺素激動(dòng)劑、黃嘌呤、膽堿受體拮抗劑）、抗炎藥(例如，色甘酸二鈉(DSCG)、奈多羅米鈉、抗組胺藥如酮替芬(ketotifen)、皮質(zhì)類(lèi)固醇如潑尼松龍(prednisolone))、茶堿、沙丁胺醇、丙酸倍氯米松或本領(lǐng)域已知的其它治療性哮喘藥一起配制。這類(lèi)其他藥物的有效量取決于該制劑中存在的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段的量、疾病類(lèi)型或療法和上文討論的其他因素。[0122]使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)將具有所需純度的活性成分與任選的生理可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，制備治療性制劑(Remington'sPharmaceuticalSciences(第20版）.A.Gennaro,2000，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA)?？山邮艿妮d體，包括鹽水或緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸;抗氧化劑，包括抗壞血酸;低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽;蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸;單糖、二糖和其他糖，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精;螯合劑如EDTA;糖醇如甘露醇或山梨醇;成鹽反離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如TWEEN?、PLURONICS?或PEG。[0123]任選的，但是優(yōu)選地，制劑含有可藥用鹽、優(yōu)選地氯化鈉，并且優(yōu)選地以約生理學(xué)濃度。任選地，本發(fā)明的制劑可以含有可藥用的防腐劑。在一些實(shí)施方案中，防腐劑濃度是從0.1至2.0%，一般按v/v計(jì)。合適的防腐劑包括制藥領(lǐng)域已知的那些。芐醇、苯酚、間甲酚、對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯是示例性防腐劑。任選地，本發(fā)明的制劑可以按0.005%至0.02%的濃度包含可藥用的表面活性劑。[0124]本文中的制劑也可以根據(jù)正在治療的特定適應(yīng)癥按需要而含有多于一種活性化合物，優(yōu)選地是無(wú)不利相互影響并具有互補(bǔ)活性的那些活性化合物。這些分子適宜地以對(duì)預(yù)期目的有效的量組合地存在。[0125]活性成分也可以截留在例如分別通過(guò)凝聚技術(shù)或界面聚合制備的微膠囊(例如，羥甲基纖維素微膠囊或明膠微膠囊和聚（甲基丙烯酸甲酯)微膠囊）、膠態(tài)藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳液、納米粒子和納米膠囊）或粗乳液中。這類(lèi)技術(shù)在上文Remington'sPharmaceuticalSciences中公開(kāi)。[0126]可以制備持續(xù)釋放制品。持續(xù)釋放制品的合適例子包括含有抗體的固態(tài)疏水性聚合物半通透性基質(zhì)，所述基質(zhì)可以為成型制品（例如，薄膜或微膠囊)形式。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚（甲基丙烯酸2-羥乙酯)或聚（乙烯醇）、聚乳酸(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3,773,919)、1^谷氨酸和丫-乙基-1^谷氨酸酯的共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONDEPOT?(由乳酸-乙醇酸共聚物和亮丙瑞林乙酸酯組成的可注射微球體)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。盡管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能夠使分子的釋放持續(xù)超過(guò)100日，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的持續(xù)時(shí)間較短。當(dāng)包囊化的抗體長(zhǎng)時(shí)間留在體內(nèi)時(shí)，它們可能因在37°C暴露于濕氣而變性或聚集，導(dǎo)致生物活性喪失和可能的免疫原性改變?？梢愿鶕?jù)所涉及的機(jī)制，構(gòu)思用于穩(wěn)定的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是通過(guò)巰基-二硫鍵交換所致的分子間S-S鍵形成，則可以通過(guò)修飾硫氫基殘基、從酸性溶液凍干、控制含濕量、使用適宜的添加物、和開(kāi)發(fā)特定聚合物基質(zhì)組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定作用。[0127]在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)病癥允許時(shí)，局部施用雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，例如，通過(guò)直接注射而局部施用，并且注射可以定期重復(fù)，或通過(guò)吸入局部施用。雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段也可以全身性遞送至受試者或直接遞送至患病區(qū)域。[0128]本發(fā)明也提供一種包含雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段及可藥用載體或稀釋劑的組合物。用于治療性用途的這種組合物是無(wú)菌的并且可以凍干。還構(gòu)思本發(fā)明的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段在制造治療本文所述適應(yīng)癥的藥物中的用途。組合物還可以包含第二治療藥，如抗哮喘藥、抗炎藥或抗增生藥物(例如，化療藥、細(xì)胞毒性藥或抗血管生成藥）。[0129]V.制造品和藥盒[0130]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是含有可用于治療疾病或病癥(例如，變應(yīng)性疾病或病癥或哮喘）的材料的制造品。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案是含有可用于治療炎性、自身免疫性和增生性疾病或病癥的材料的制造品。制造品包括容器和在該容器上或與之結(jié)合的標(biāo)簽或包裝插頁(yè)。合適的容器例如包括瓶、小藥瓶、注射器等。容器可以從多種材料如玻璃或塑料形成。容器容納有效治療所述病癥的組合物并且可以具有無(wú)菌進(jìn)口（例如容器可以是靜脈內(nèi)輸液袋或是具有皮下注射針頭可穿透的瓶塞的小藥瓶）。組合物中的至少一種活性物質(zhì)是本發(fā)明的雙重特異性抗體或抗原結(jié)合片段。標(biāo)簽或包裝插頁(yè)說(shuō)明該組合物用于治療特定的病狀。該標(biāo)簽或包裝插頁(yè)可以進(jìn)一步包含用于施用該抗體組合物至患者的說(shuō)明書(shū)。還考慮包含本文所述的組合性治療藥的制造品和藥盒。[0131]包裝插頁(yè)指治療性產(chǎn)品的商業(yè)包裝中習(xí)慣性包含的說(shuō)明書(shū)，所述說(shuō)明書(shū)含有關(guān)于適應(yīng)癥、用法、劑量、施用、禁忌癥和/或涉及此類(lèi)治療產(chǎn)品應(yīng)用之警告的信息。在一個(gè)實(shí)施方案中，包裝插頁(yè)說(shuō)明該組合物用于治療哮喘。[0132]額外地，制造品還可以包含第二容器，所述容器包含可藥用緩沖液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。它可以還包括從商業(yè)和用戶觀點(diǎn)看受歡迎的其他材料，包括其他緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。[0133]還提供可用于多種目的（例如，從細(xì)胞純化或免疫沉淀IL4、IL5或IL13)的藥盒。為了分離和純化IL4、IL5或IL13,藥盒可以含有與珠(例如，瓊脂糖珠)偶聯(lián)的IL4/IL5或IL4/IL13抗體?？梢蕴峁┖锌贵w的藥盒，用于在體外（例如在ELISA或蛋白質(zhì)印跡法中）檢測(cè)和定量IL4、IL5或IL13。與制造品一樣，藥盒包括容器和在該容器上或與之結(jié)合的標(biāo)簽或包裝插頁(yè)。容器容納包含至少一種本發(fā)明雙重特異性或多特異性抗體或抗體片段的組合物?？梢园ê欣缦♂寗┖途彌_液或?qū)φ湛贵w的額外容器。標(biāo)簽或包裝插頁(yè)可以提供有關(guān)組合物的描述以及對(duì)預(yù)期的體外或診斷用途的說(shuō)明。[0134]以下的實(shí)施例僅出于舉例說(shuō)明目的而提供，并不意在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)際上，除了本文顯示和描述的那些修改之外，本發(fā)明的各種修改將因前面的描述而對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的并且落于所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。實(shí)施例[0135]除非另外說(shuō)明，否則下文實(shí)施例中提到的市售試劑根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用。以下實(shí)施例中和整個(gè)說(shuō)明書(shū)中用ATCC保藏號(hào)所標(biāo)識(shí)的那些細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA。除非另外指出，否則本發(fā)明使用重組DNA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法，如上文和以下教科書(shū)中所述的那些方法:Sambrook等人，上引文;Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology(GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y.,1989);Innis等人，PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress，Inc?:N.Y.，1990);Harlow等人，Antibodies:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborPress:ColdSpringHarbor,1988)；Gait,01igonucleotideSynthesis(IRLPress:Oxford,1984)；Freshney,AnimalCellCulture,1987;Coligan等人，CurrentProtocolsinImmunology，1991〇[0136]實(shí)施例1.文庫(kù)設(shè)計(jì)和構(gòu)建[0137]通過(guò)在輕鏈(LC)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)中突變，單特異性抗體可以募集到針對(duì)新抗原的第二結(jié)合特異性，同時(shí)維持其第一抗原特異性。另外，可以通過(guò)親和力成熟，使該雙重結(jié)合作用具有低納摩爾Kd。工程化雙重特異性的該途徑十分適用于主要利用重鏈(HC)CDR結(jié)合其第一抗原的抗體。在此描述:結(jié)合能量倚重于LCCDR的小鼠雜交瘤衍生的抗白介素4抗體，及該抗體通過(guò)僅在HCCDR中的突變或通過(guò)在LCCDR中的進(jìn)一步突變而向雙重特異性的演化。同時(shí)針對(duì)白介素4(IL4)和白介素5(IL5)的這樣一種雙重特異性變體經(jīng)成熟而具有低納摩爾Kd的高雙重親和力。該結(jié)果進(jìn)一步凸顯了抗體演化雙重特異性的能力并且證實(shí)了在任何抗體中演化雙重特異性的一般適用性工程化途徑，其中使用突變掃描策略鑒定抗原結(jié)合位點(diǎn)中可以忍受突變并允許演化第二結(jié)合特異性的區(qū)域。[0138]我們著手向結(jié)合IL4并阻斷它與IL4受體a結(jié)合的人源化抗體19Cll(hul9Cll，在種系VH1和kI的主鏈中人源化）引入第二抗原特異性。如所述（Lee等人，J.Mol.Biol.340:1073-93，2004)，我們首先將其Fab克隆入"噬菌粒"構(gòu)建體(pVO115)，以共表達(dá)LC和（以雙順?lè)醋臃绞?C端與M13小外殼蛋白p3融合的HC的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域1(CH1)。具有氨基酸序列KTHTC的一部分IgG鉸鏈區(qū)被包括在CH1和M13p3之間以允許雙價(jià)Fab展示(Lee等人，J.Mol.Biol.340:1073-93,2004)，從而增加與固定在固態(tài)表面支持物上的抗原的結(jié)合效率。我們首先驗(yàn)證了，展示Fab的噬菌體良好地結(jié)合針對(duì)表達(dá)標(biāo)簽(gD)(C端融合于LC)的抗體，并以高親和力（噬菌體EC50=lnM)結(jié)合IL4,所述親和力類(lèi)似于該抗體作為IgG的實(shí)測(cè)親和力。[0139]為了確定將第二結(jié)合特異性募集至hu19C11的工程化策略，我們首先通過(guò)將每個(gè)LC⑶R的兩個(gè)或三個(gè)殘基突變成丙氨酸，檢驗(yàn)了抗體的三個(gè)LC⑶R對(duì)于結(jié)合IL4的重要性。選擇這些LCCDR位置，原因在于：先前已經(jīng)鑒定到，在從第一抗原結(jié)合作用非常依賴于HCCDR的抗體選擇雙重特異性克隆的LC文庫(kù)方案中，這些位置是組合誘變的關(guān)鍵位置(Bostrom等人，PLoSOne?6:el7887，2011)。將展示hul9Cl1野生型、丙氨酸突變體LI(I30A/N31A/D32A)、L2(Y50A/H53A/R54A)或L3(D91A/Y92A)的噬菌體固定至抗gD抗體（圖1A)或IL4(圖1B)，并且使用ELISA測(cè)定結(jié)合。我們發(fā)現(xiàn)LCCDR看起來(lái)在能量上是重要的。展示在三個(gè)LCCDR的任一個(gè)中具有丙氨酸突變的Fab的噬菌體未顯示可檢測(cè)的IL4結(jié)合，但與抗gD抗體結(jié)合，這表明這些突變體確實(shí)展示在噬菌體上（盡管水平低于野生型Fab)，但是它們與IL4的結(jié)合嚴(yán)重受損（圖1A和圖1B)。因此，產(chǎn)生隨機(jī)化LCCDR文庫(kù)的方案將不可能產(chǎn)生雙重特異性抗體，原因在于可用于演化第二抗原結(jié)合作用的氨基酸殘基的數(shù)目相當(dāng)有限。接下來(lái)，我們?nèi)缦惹八鐾蛔兞薒CCDR的各個(gè)關(guān)鍵殘基以及表面可及性HCCDR(Sidhu等人，JMolBiol?338:299-310，2004;Lee等人，JMolBiol?340:1073-1093，2004)，并且通過(guò)與野生型hul9Cll相比確定這些丙氨酸突變體的相對(duì)結(jié)合親和力，評(píng)價(jià)了它們?cè)贗L4結(jié)合中的作用。結(jié)果驗(yàn)證了這些關(guān)鍵LC⑶R殘基對(duì)IL4結(jié)合的重要性。然而，全部測(cè)試的⑶RH2位置和半數(shù)CDRH1和H3位置看起來(lái)耐受突變(圖1C)。[0140]通過(guò)在作為模型的曲妥珠單抗Fab(H)B:lFDV)結(jié)構(gòu)上作圖定位對(duì)IL4結(jié)合作用非常重要的殘基(LC殘基30、31、32、50、53、54、91，92;11(：殘基31、32、98、99(按1^匕3七編號(hào)）），我們鑒定了以CDRH2為中心的耐受突變并且可能適合演化第二特異性的區(qū)域(圖2A)。我們隨后在CDR111(33,34)、112(50-58)、113(95-97)和13(93-96)中選擇了耐受丙氨酸突變的一組殘基用于該突變方案中進(jìn)行以CDRH2為中心的隨機(jī)化;并且使用一組合成寡核苷酸根據(jù)Kunkel等人(Kunkel等人，MethodsEnzymol?154:367-82，1987)的誘變方法在這四個(gè)CDR之每一個(gè)處定向地隨機(jī)化這些選定的殘基。在CDRH2和CDRL3的氨基酸組成和長(zhǎng)度變異性方面，該隨機(jī)化方案受天然抗體中多樣性的引導(dǎo)（圖2B)。誘變用模板僅在CDRH2中含有終止密碼子，這確保了Fab展示文庫(kù)中該CDR的突變。我們生成了10個(gè)噬菌體展示文庫(kù)，每個(gè)具有1〇8_1〇9的大小。通過(guò)10個(gè)HC文庫(kù)（2144-1至2144-10)與非阻斷性抗IL4抗體捕獲的固定化IL4(Pepr〇TeCh)的結(jié)合和hul9Cl1的噬菌體滴定進(jìn)行評(píng)估，每個(gè)文庫(kù)作為匯集物顯示了某種低水平的IL4結(jié)合作用，所述結(jié)合作用與模板抗體hul9Cll相比通常低得多，指示平均地不同水平的IL4結(jié)合破壞（圖3)。[0141]我們選擇IL5和IL13作為第二抗原。盡管這兩種白介素如IL4一樣屬于4-螺旋束細(xì)胞因子家族，但是它們?cè)诎被嵝蛄泻徒Y(jié)構(gòu)組織層面相當(dāng)趨異(LaPorte等人，Cell.132:259-272，2008;Patino等人，Structure.19:1864-1875,2011;Finkelman等人，JImmunol.184:1663-1674,2010)。IL4和IL13之間的序列同一性是12%，而IL4和IL5之間的序列同一性是11%。在結(jié)構(gòu)上，IL5形成獨(dú)特的絞纏的同二聚體，其中來(lái)自一條鏈的一個(gè)a-螺旋與來(lái)自另一條鏈的三個(gè)a-螺旋形成4-螺旋束(Milburn等人，Nature.363:172-176，1993;Patino等人，Structure.19:1864-1875,2011);IL4和IL13均是單體。然而，這三個(gè)細(xì)胞因子在它們的生物學(xué)功能上相關(guān)并且結(jié)合并阻斷這些細(xì)胞因子中兩種的雙重特異性抗體可以具有作為變應(yīng)性疾病如哮喘治療藥的潛力實(shí)用性9(Finkelman等人，JImmunol.l84:1663-1674,2010;Haldar等人，NEnglJMed.360:973-984,2009)。[0142]如先所述(Bostrom等人，Science?323:1610-1614,2009)，我們自構(gòu)建的菌體展示文庫(kù)進(jìn)行了保留IL4結(jié)合作用的IL5或IL13結(jié)合性克隆的幾輪淘洗和富集。通過(guò)各篩選大約100個(gè)克隆，我們找到分別顯示出與IL5/IL4或IL13/IL4雙重結(jié)合的3至8個(gè)克隆。并且從測(cè)序中，鑒定了兩個(gè)結(jié)合IL4/IL5的獨(dú)特克隆(B1、E7)和兩個(gè)結(jié)合IL4/IL13的獨(dú)特克隆(FI、F2)(圖2B)。我們還分離到與IL5唯一結(jié)合的克隆（例如，克隆5A)。除克隆B1之外，與它們的單特異性親本模板相比，其余全部克隆均僅在HCCDR中含有突變（圖4A-4C)。這顯示，突變單特異性抗體的HCCDR可以賦予雙重特異性。我們使用噬菌體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法，將克隆親和力評(píng)估為抑制50%Fab展示菌體與固定化白介素結(jié)合所需的白介素濃度(IC5Q)。我們發(fā)現(xiàn)，與第二抗原的結(jié)合作用弱，IC5Q在微摩爾范圍中，而IL4結(jié)合作用維持在低納摩爾范圍。[0143]實(shí)施例2.文庫(kù)性能的評(píng)價(jià)[0144]為了驗(yàn)證雙重結(jié)合特異性，將克隆B1、E7、F2和5A表達(dá)為IgG形式，驗(yàn)證了所得到的IgG與預(yù)期抗原結(jié)合，但不與幾種其他蛋白質(zhì)結(jié)合（圖5)。通過(guò)用流式細(xì)胞術(shù)顯示IgG與不表達(dá)IL4、IL5和IL13的人上皮腎細(xì)胞系293細(xì)胞極少結(jié)合，以及用ELISA(Hotzel等人，MAbs.4:753-760，2012)顯示IgG與從昆蟲(chóng)細(xì)胞系生成的桿狀病毒(BV)顆粒極少結(jié)合，我們進(jìn)一步檢驗(yàn)了結(jié)合特異性。另外，證實(shí)IL4/IL5雙重特異性抗體B1和E7和單特異性IL5結(jié)合抗體可以阻斷IL5結(jié)合IL5受體a，提示IL5上的結(jié)合表位與IL5受體的結(jié)合位點(diǎn)重疊（圖6)。通過(guò)表面等離子體共振(SPR)測(cè)量，IL4/IL5雙重特異性克隆E7對(duì)IL5具有低親和力(KD=905nM)，但是維持其親本抗體hul9Cl1的高親和力IL4結(jié)合作用(Kd=3.4nM)，如通過(guò)所表面等離子體共振法(SPR)測(cè)量的（圖7A和圖7B)。[0145]實(shí)施例3.雙重特異性抗原結(jié)合片段的親和力成熟[0146]為了改善E7的雙重親和力，我們通過(guò)位點(diǎn)定向誘變法隨機(jī)化E7⑶R，并且將變體展示在噬菌體上以便選擇結(jié)合作用。生成了靶向⑶RH2和⑶RL3殘基(H2/L3文庫(kù)）、⑶RH1、H2和H3殘基(H1/H2/H3文庫(kù)）、或CDRH2殘基和HC構(gòu)架區(qū)3(FR3)中的選定位點(diǎn)（H2/FR3文庫(kù)）的三個(gè)文庫(kù)，以如所述隨機(jī)化(Lee等人，JMolBiol.340:1073-1093,2004;Bostrom等人，MethodsMolBiol.525:1-24,2009;Lee等人，Blood.108:3103-3111,2006)(圖7A)。由于克隆E7維持高的IL4結(jié)合親和力，所以我們將文庫(kù)的選擇聚焦于IL5結(jié)合作用的改善上。從HI/H2/H3文庫(kù)中，我們找到對(duì)IL5的親和力改善、但對(duì)IL4的親和力大幅度減低的多個(gè)克隆，而來(lái)自H2/L3文庫(kù)和H2/FR3文庫(kù)的克隆顯示出改善的IL5結(jié)合作用而不喪失IL4-結(jié)合親和力(圖4A)。選擇的克隆純化為IgG并且與E7比較。來(lái)自H2/L3文庫(kù)的許多變體以IgG形式顯示出更高的雙重結(jié)合作用，且與一組非靶蛋白質(zhì)的結(jié)合作用不增長(zhǎng)（圖8A)。如上使用BV結(jié)合和293細(xì)胞FACS，我們還證實(shí)了低的脫靶結(jié)合作用，并且證實(shí)了這些改善型克隆仍然阻斷IL5與其受體結(jié)合（圖8B)。通過(guò)SPR測(cè)量Fab與固定化IL4或IL5的結(jié)合作用，確定了兩種改善型變體1C36和1C60的單價(jià)結(jié)合親和力（圖7C和7D)。兩種變體均維持高的IL4親和力（Kd=3-4nM)和改善的IL5親和力，分別達(dá)37倍和20倍（1C36的&=24.1碰，1060的1^=44.411]\〇(圖7B)。[0147]總之，我們證實(shí)，在單特異性抗體的HCCDR中的突變可以募集第二結(jié)合特異性，并且我們將分離的雙重特異性抗體之一改善成了針對(duì)兩種抗原的低nM親和力。先前，我們證實(shí)，曲妥珠單抗Fab通過(guò)LCCDR中的突變可以演化出雙重特異性;此后，使用相同的LC方案，已經(jīng)生成了其他雙重特異性抗體。連同本研究的結(jié)果，我們指明了抗體結(jié)合特異性的可演化性。我們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在不只是輕鏈側(cè)還有重鏈側(cè)的CDR中的有限突變，抗體可以增加另一種結(jié)合特異性。在自然界中，抗體總是通過(guò)基因改組和體細(xì)胞突變?cè)谶M(jìn)行重塑。已經(jīng)顯示，抗體可以被"重利用"，通過(guò)體細(xì)胞突變而變成具有不同結(jié)合特性、因此具有不同功能的抗體?？贵w可能具有一種對(duì)于通過(guò)有限突變而進(jìn)化出結(jié)合特異性而言理想的折疊和結(jié)構(gòu)，這應(yīng)在天然免疫反應(yīng)識(shí)別基本上無(wú)限變化的外來(lái)抗原的龐大能力中發(fā)揮作用。另外，本工作首次給出了一種可以從任何單特異性抗體演化雙重特異性抗體的通用工程化途徑，總結(jié)如下。通過(guò)誘變分析(例如，丙氨酸掃描法），可以首先鑒定出能夠忍受突變而不嚴(yán)重破壞第一抗原結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域。[0148]其他實(shí)施例[0149]本說(shuō)明書(shū)中援引或參考的全部專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利申請(qǐng)公布和其他出版物通過(guò)引用方式并入此，其并入程度就如同專(zhuān)門(mén)且逐個(gè)地指出通過(guò)引用的方式并入了每份單獨(dú)的專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利申請(qǐng)公布和出版物?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.制備包含可變重鏈結(jié)構(gòu)域(Vh)和可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(Vl)的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，其中雙重特異性抗體的VH和I配對(duì)在一起形成與第一表位和第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述方法包括步驟：(a)提供包含VH和I的抗體，其中VH和I配對(duì)在一起形成與第一表位結(jié)合但不與第二表位結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且其中所述抗體在VL的位置32、50或91包含至少一個(gè)帶靜電或疏水的氨基酸；(b)改變編碼步驟(a)的抗體的VH的核酸序列，其中改變一個(gè)或多個(gè)溶劑可及性氨基酸殘基；(c)表達(dá)VL和步驟(b)的改變的VH;和(d)選擇包含步驟(c)的該I和改變的VH的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該VH和VL配對(duì)在一起形成與第一表位和第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在位置32、50或91處的至少兩個(gè)氨基酸是帶靜電或疏水的。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在位置32、50和91處的全部三個(gè)氨基酸是帶靜電或疏水的。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中帶靜電殘基是酪氨酸。5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中疏水性殘基是色氨酸。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中基于多個(gè)天然存在的重鏈氨基酸序列的多樣性，改變編碼Vh的核酸序列。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中溶劑暴露殘基的位置是選自VH的位置33、34、50-58和95-97的氨基酸殘基位置。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，還包括改變編碼步驟(a)的抗體的I的核酸序列，其中改變一個(gè)或多個(gè)溶劑可及性氨基酸殘基。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中溶劑暴露殘基的位置是選自VH的氨基酸93-96的氨基酸殘基位置。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(d)的選擇過(guò)程中，改變的Vh與Vl展示在菌體上。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)的抗體包含:包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDNO:9)的輕鏈可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)CDRL1、包含氨基酸序列YTSHRYT(SEQIDN0:10)的CDRL2和包含氨基酸序列QQDYTSPWTF(SEQIDN0:11)的CDRL3。12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)的抗體包含:包含氨基酸序列DYSMH(SEQIDNO:13)的重鏈可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)CDRH1、包含氨基酸序列VWINTETGEPTYADDFK(SEQIDNO:17)的CDRH2、和包含氨基酸序列GGIFYGMDY(SEQIDNO:20)的CDRH3〇13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(d)的雙重特異性抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)互斥地結(jié)合第一表位和第二表位。14.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(d)的雙重特異性抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)結(jié)合第一表位和第二表位。15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中第一表位來(lái)自一種生物分子并且第二表位來(lái)自相同的生物分子。16.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中第一表位來(lái)自第一生物分子并且第二表位來(lái)自第二生物分子。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中第一生物分子和第二生物分子選自IL4/IL5、IL4/IL13。18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中第一生物分子和第二生物分子是細(xì)胞因子。19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中第一或第二生物分子是在體內(nèi)與抗體結(jié)合時(shí)可以增加雙重特異性抗體半壽期的分子。20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中第一或第二生物分子是血清白蛋白或新生兒Fc受體(FcRn)。21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中第一或第二生物分子是在體內(nèi)與抗體結(jié)合時(shí)可以增加雙重特異性抗體的效應(yīng)子功能的分子。22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中第一或第二生物分子與天然殺傷細(xì)胞或巨噬細(xì)胞上的細(xì)胞表面蛋白結(jié)合。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述細(xì)胞表面蛋白是Fc受體或Clq。24.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中雙重特異性抗體的VH和I配對(duì)在一起，形成以10-6或更低的KD與第一表位或第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中雙重特異性抗體的VH和VL配對(duì)在一起，形成以10-9或更低的Kd與第一表位或第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中雙重特異性抗體的VH和VL配對(duì)在一起，形成以101或更低的Kd與第一表位或第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)。27.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中雙重特異性抗體的VH和I配對(duì)在一起，形成以10-6或更低的KD與第一表位和第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中雙重特異性抗體的VH和I配對(duì)在一起，形成以10-9或更低的Kd與第一表位和第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中雙重特異性抗體的VH和VL配對(duì)在一起，形成以101或更低的Kd與第一表位和第二表位特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)。30.根據(jù)權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的方法，其中第一生物分子和第二生物分子在結(jié)構(gòu)上不相似。31.根據(jù)權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(d)的選擇包括深度測(cè)序。32.通過(guò)權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的分離的雙重特異性抗體，其中雙重特異性抗體是單克隆抗體。34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的分離的雙重特異性抗體，其中片段是Fab或scFv。35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的分離的雙重特異性抗體，其中雙重特異性抗體是IgG。36.分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含圖4六、48、4(：、74、7(：或70的任一種抗體的氨基酸序列。37.分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，包含以下六個(gè)CDR:(i)包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDNO:9)的CDRL1;(ii)包含氨基酸序列YTSHRYT(SEQID勵(lì)：10)的〇)此2;(iii)包含氨基酸序列QQDYTSPWTF(SEQID勵(lì)：11)的0)此3;(iv)包含氨基酸序列DYDIH(SEQIDN0:14)的CDRHl;(v)包含氨基酸序列VWINTETGEPTYADDFK(SEQIDN0:17)的CDRH2;和(vi)包含氨基酸序列EILFYGMDY(SEQIDN0:21)的CDRH3。38.分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，包含以下六個(gè)CDR:(i)包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDN0:9)的CDRL1;(ii)包含氨基酸序列YTSHRYT(SEQID勵(lì)：10)的〇)此2;(iii)包含氨基酸序列QQDYTSPWTF(SEQID勵(lì)：11)的0)此3;(iv)包含氨基酸序列DYFIH(SEQIDN0:15)的CDRHl;(v)包含氨基酸序列AGIVYDATGFTTYADDFK(SEQIDN0:18)的CDRH2;和(vi)包含氨基酸序列GGIFYGMDY(SEQIDN0:20)的CDRH3。39.分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，包含以下六個(gè)CDR:(i)包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDN0:9)的CDRL1;(ii)包含氨基酸序列YTSHRYT(SEQID勵(lì)：10)的〇)此2;(iii)包含氨基酸序列QQDYTPFPLTF(SEQID勵(lì)：12)的0)虬3;(iv)包含氨基酸序列DYLMH(SEQIDN0:16)的CDRHl;(v)包含氨基酸序列AVIVSITGRTYYADDFK(SEQIDN0:19)的CDRH2;和(vi)包含氨基酸序列GGIFYGMDY(SEQIDN0:20)的CDRH3。40.分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，包含以下六個(gè)CDR:(i)包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDNO:9)的CDRL1;(ii)包含氨基酸序列YTSHRYT(SEQID勵(lì)：10)的〇)此2;(iii)包含氨基酸序列QQDYTSPWTF(SEQID勵(lì)：11)的0)此3;(iv)包含氨基酸序列DYSMH(SEQIDNO:13)的CDRHl;(v)包含氨基酸序列GVIFQSGATYYADDFK(SEQIDNO:22)的CDRH2;和(vi)包含氨基酸序列GGIFYGMDY(SEQIDN0:20)的CDRH3。41.分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，包含以下六個(gè)CDR:(i)包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDNO:9)的CDRL1;(ii)包含氨基酸序列YTSHRYT(SEQID勵(lì)：10)的〇)此2;(iii)包含氨基酸序列QQDYTSPWTF(SEQID勵(lì)：11)的0)此3;(iv)包含氨基酸序列DYSMH(SEQIDNO:13)的CDRHl;(v)包含氨基酸序列GIIFYTGHTYYADDFK(SEQIDNO:23)的CDRH2;和(vi)包含氨基酸序列GGIFYGMDY(SEQIDN0:20)的CDRH3。42.分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，包含以下六個(gè)CDR:(i)包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDNO:9)的CDRL1;(ii)包含氨基酸序列YTSHRYT(SEQID勵(lì)：10)的〇)此2;(iii)包含氨基酸序列QQDYX1X2PWTF(SEQIDNO:24)的CDRL3，其中Χι是Thr、11e、Leu或Lys，并且X2是Ser或His;(iv)包含氨基酸序列DYFIH(SEQIDN0:15)的CDRHl;(V)包含氨基酸序列X1GIVYDATGFTX2YAX3X4FK(SEQIDN0:25)的CDRH2,其中其中Χι是八1&或617，父2是1'111'、116、\%1或厶1&，父3是厶8卩、￥&1或6111，并且父4是厶8卩、6111、厶811、361'、116、Leu、Thr、AlaSPhejPI(vi)包含氨基酸序列GGIFYGMDY(SEQIDN0:20)的CDRH3。43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，包含以下六個(gè)CDR：(i)包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDN0:9)的CDRL1;(ii)包含氨基酸序列YTSHRYT(SEQID勵(lì)：10)的〇)此2;(iii)包含氨基酸序列QQDYTHPWTF(SEQID勵(lì):27)的0)此3;(iv)包含氨基酸序列DYFIH(SEQIDN0:15)的CDRHl;(v)包含氨基酸序列GGIVYDATGFTTYAEEFK(SEQIDN0:28)的CDRH2;和(vi)包含氨基酸序列GGIFYGMDY(SEQIDN0:20)的CDRH3。44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，包含以下六個(gè)CDR：(i)包含氨基酸序列KASQSVINDAA(SEQIDN0:9)的CDRL1;(ii)包含氨基酸序列YTSHRYT(SEQID勵(lì)：10)的〇)此2;(iii)包含氨基酸序列QQDYKHPWTF(SEQIDN0:31)的CDRL3;(iv)包含氨基酸序列DYFIH(SEQIDN0:15)的CDRHl;(v)包含氨基酸序列AGIVYDATGFTVYADDFK(SEQIDN0:32)的CDRH2;和(vi)包含氨基酸序列GGIFYGMDY(SEQIDN0:20)的CDRH3。45.根據(jù)權(quán)利要求42-44中任一項(xiàng)所述的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，還包含構(gòu)架區(qū)3(FR3)，所述構(gòu)架區(qū)3包含氨基酸序列GRX1TITX2DX3STSTX4(SEQIDN0:26)，其中Χι是Val或Phe，X2是Arg或Ile，X3是Thr、Phe、Met或Pro,并且X4是Ala或Val。46.分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，包含選自SEQIDNO:1、5、29或33的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和選自SEQIDN0:2、3、4、6、7、8、30或34的重鏈可變區(qū)。47.根據(jù)權(quán)利要求38、39和42-46中任一項(xiàng)所述的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段以500nM或更低的Kd結(jié)合IL4并且以約900nM或更低的Kd結(jié)合IL5。48.根據(jù)權(quán)利要求38、39和42-46中任一項(xiàng)所述的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體以ΙΟΟηΜ或更低的Kd結(jié)合IL4并且以約ΙΟΟηΜ或更低的Kd結(jié)合IL5。49.根據(jù)權(quán)利要求38、39和42-46中任一項(xiàng)所述的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體以1〇ηΜ或更低的Kd結(jié)合IL4并且以約50nM或更低的Kd結(jié)合IL5。50.根據(jù)權(quán)利要求40、41和46中任一項(xiàng)所述的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體以500nM或更低的Kd結(jié)合IL4并且以約900nM或更低的Kd結(jié)合IL13。51.根據(jù)權(quán)利要求40、41和46中任一項(xiàng)所述的分離的雙重特異性抗體，其中所述抗體以ΙΟΟηΜ或更低的Kd結(jié)合IL4并且以約ΙΟΟηΜ或更低的Kd結(jié)合IL13。52.根據(jù)權(quán)利要求36-51中任一項(xiàng)所述的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體抑制或阻斷IL4、IL5或IL13與其受體的結(jié)合。53.根據(jù)權(quán)利要求36-51中任一項(xiàng)所述的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是單克隆抗體。54.根據(jù)權(quán)利要求36-51中任一項(xiàng)所述的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是IgG抗體。55.根據(jù)權(quán)利要求36-51中任一項(xiàng)所述的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述片段是Fab片段或單鏈可變片段(scFv)。56.根據(jù)權(quán)利要求36-51中任一項(xiàng)所述的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其中構(gòu)架序列的至少一部分是人共有構(gòu)架序列。57.根據(jù)權(quán)利要求32-51中任一項(xiàng)所述的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其中抗體是嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。58.藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求32-57任一項(xiàng)所述的抗體。59.多核苷酸，編碼根據(jù)權(quán)利要求32-57中任一項(xiàng)所述的分離的雙重特異性抗體或其抗原結(jié)合片段。60.載體，包含根據(jù)權(quán)利要求59所述的多核苷酸。61.宿主細(xì)胞，包含根據(jù)權(quán)利要求60所述的載體。62.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求32-57中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段方法，所述方法包括培養(yǎng)包含根據(jù)權(quán)利要求60所述的載體的宿主細(xì)胞以及回收所述抗體。63.治療受試者中哮喘的方法，所述方法包括向所述受試者施用根據(jù)權(quán)利要求32-57中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段，其中所述施用按足以治療或預(yù)防所述受試者中所述哮喘的量和持續(xù)時(shí)間進(jìn)行。64.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述方法還包括施用選自以下的至少一種額外的哮喘治療藥：IgE拮抗劑、抗組胺藥、茶堿、沙丁胺醇、丙酸倍氯米松、色甘酸鈉、類(lèi)固醇和抗炎藥。65.根據(jù)權(quán)利要求63或64所述的方法，其中哮喘是過(guò)敏性哮喘。66.治療受試者中增生性疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用根據(jù)權(quán)利要求32-57中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗體片段，其中所述施用按足以治療所述受試者中所述增生性疾病的量和持續(xù)時(shí)間進(jìn)行。67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述增生性疾病是癌癥。68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，還包括向所述受試者施用選自化療藥、細(xì)胞毒藥物和抗血管生成藥的額外抗增生藥?！疚臋n編號(hào)】A61K39/395GK105849124SQ201480067934【公開(kāi)日】2016年8月10日【申請(qǐng)日】2014年12月18日【發(fā)明人】G·弗,C·V·李,P·凱尼格【申請(qǐng)人】豪夫邁·羅氏有限公司