新的產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種由多能干細(xì)胞制造產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞的方法，包括：(i)在含有選自由BMP抑制劑、TGFβ抑制劑、SHH信號(hào)激活劑、FGF8和GSK3β抑制劑組成的組的試劑的培養(yǎng)液中，將多能干細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)的工序；(ii)使用結(jié)合于Corin的物質(zhì)和/或結(jié)合于Lrtm1的物質(zhì)從上述工序(i)中得到的細(xì)胞收集Corin和/或Lrtm1陽(yáng)性細(xì)胞的工序；以及(iii)將上述工序(ii)中得到的細(xì)胞在含有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的工序。
【專利說(shuō)明】
新的產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞的制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 帕金森病是由于中腦黑質(zhì)中產(chǎn)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的脫落而發(fā)生的神經(jīng)退行性疾病， 目前，世界上大約有400萬(wàn)人的患者。作為帕金森病的治療，進(jìn)行利用L-D0PA或多巴胺激動(dòng) 劑進(jìn)行的藥物治療、利用定位腦手術(shù)進(jìn)行的凝固術(shù)或深部電刺激治療和胎兒中腦移植等。
[0003] 胎兒中腦移植在其供給源的組織存在倫理問(wèn)題的同時(shí)感染的危險(xiǎn)性也高。因此， 提出了使用由胚性干細(xì)胞(ES細(xì)胞）、人工多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞)等多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)而 得的神經(jīng)細(xì)胞的治療方法(非專利文獻(xiàn)1)。然而，卻被指出在移植分化誘導(dǎo)而得的神經(jīng)細(xì)胞 時(shí)形成良性腫瘤的可能性和運(yùn)動(dòng)障礙，運(yùn)動(dòng)障礙的原因被認(rèn)為是除了作為目的的產(chǎn)多巴胺 神經(jīng)細(xì)胞以外的細(xì)胞，從而需要選擇植活并且安全的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行移植。
[0004] 因此，提出利用成為產(chǎn)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞或產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)記的基因?qū)?適合移植的細(xì)胞進(jìn)行篩選(專利文獻(xiàn)1~4)，但標(biāo)記的選擇尚有改善的余地。此外，這些文獻(xiàn) 中，并未對(duì)是否適合用篩選之后的細(xì)胞進(jìn)行給藥、或者是否可以用由該中間體細(xì)胞誘導(dǎo)而 得的細(xì)胞進(jìn)行給藥進(jìn)行研究。
[0005] 進(jìn)而認(rèn)為，為了抑制含有生物來(lái)源成分所導(dǎo)致的個(gè)體差異的影響、價(jià)格的大幅上 漲，產(chǎn)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的制造方法是有改善的余地的。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn) 1:W02005/052190
[0009] 專利文獻(xiàn) 2:W02006/009241
[0010] 專利文獻(xiàn) 3:W02007/119759
[0011] 專利文獻(xiàn) 4:W02013/015457 [0012]非專利文獻(xiàn)
[0013] 非專利文獻(xiàn)l:Wernig M，et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2008,105:5856-5861

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的是，制造適合作為帕金森病治療劑的產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞。因此， 本發(fā)明的課題是，提供產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞的制造工序或制造中所需的試劑盒。
[0015] 為了解決上述課題，本發(fā)明人等著眼于被認(rèn)為是產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)記基 因的細(xì)胞表面膜蛋白Cor in和/或Lrtml，發(fā)現(xiàn)，通過(guò)以之為指標(biāo)提取細(xì)胞、進(jìn)一步繼續(xù)培養(yǎng) 后再進(jìn)行移植，即使在移植后，產(chǎn)多巴胺細(xì)胞也會(huì)植活，確認(rèn)了通過(guò)本制造工序可獲得作為 帕金森病治療劑的產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞，從而完成了本發(fā)明。
[0016] 即，本發(fā)明如下。
[0017] [1] 一種由多能干細(xì)胞制造產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞的方法，包括下面的工序：
[0018] 工序（i)，在含有選自由BMP抑制劑、TG邱抑制劑、SHH信號(hào)激活劑、FGF8和GSK30抑 制劑組成的組的試劑的培養(yǎng)液中，將多能干細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；
[0019] 工序（i i)，從上述工序（i)中得到的細(xì)胞收集Cor in和/或Lrtml陽(yáng)性細(xì)胞；
[0020] 工序（iii)，將上述工序（ii)中得到的細(xì)胞在含有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的培養(yǎng)液中進(jìn)行 懸浮培養(yǎng)。
[0021] [2]根據(jù)[1]所述的方法，細(xì)胞外基質(zhì)為層粘連蛋白511或其片段。
[0022] [3]根據(jù)[2]所述的方法，層粘連蛋白511片段為層粘連蛋白511E8。
[0023] [4]根據(jù)[1]~[3]中任一項(xiàng)所述的方法，上述工序(i)包括下面的工序：
[0024]工序(a)，在含有BMP抑制劑和TGFP抑制劑的培養(yǎng)液中，將多能干細(xì)胞在細(xì)胞外基 質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；
[0025] 工序(b)，在含有BMP抑制劑、TGFP抑制劑、SHH信號(hào)激活劑和FGF8的培養(yǎng)液中，將上 述工序(a)中得到的細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；
[0026] 工序（c)，在含有BMP抑制劑、TG邱抑制劑、SHH信號(hào)激活劑、FGF8和GSK30抑制劑的 培養(yǎng)液中，將上述工序(b)中得到的細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；
[0027] 工序(d)，在含有BMP抑制劑和GSK3P抑制劑的培養(yǎng)液中，將上述工序(c)中得到的 細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
[0028] [ 5 ]根據(jù)[1 ]至[4 ]中任一項(xiàng)所述的方法，BMP抑制劑為L(zhǎng)DN193189。
[0029] [ 6 ]根據(jù)[1 ]至[4 ]中任一項(xiàng)所述的方法，TGFI3抑制劑為A8 3-01。
[0030] [7]根據(jù)[1]至[4]中任一項(xiàng)所述的方法，SHH信號(hào)激活劑為嘌嗎啡胺 (Purmorphamine)〇
[0031] [ 8 ]根據(jù)[1 ]至[4]中任一項(xiàng)所述的方法，GSK30抑制劑為CHIR99021。
[0032] [9]根據(jù)[1]至[8]中任一項(xiàng)所述的方法，上述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為BDNF和⑶NF。
[0033] [10]根據(jù)[1]至[9]中任一項(xiàng)所述的方法，上述工序（iii)的工序中使用的培養(yǎng)液 進(jìn)一步含有B27添加劑(Supplement )、抗壞血酸和二丁酰環(huán)磷酸腺苷。
[0034] [11]根據(jù)[1]至[10]中任一項(xiàng)所述的方法，上述(i)和/或（iii)的工序中使用的培 養(yǎng)液進(jìn)一步含有ROCK抑制劑。
[0035] [ 12 ]根據(jù)[11 ]所述的方法，ROCK抑制劑為Y-27 6 3 2。
[0036] [13]根據(jù)[1]至[12]中任一項(xiàng)所述的方法，上述工序（i)進(jìn)行至少10天。
[0037] [14]根據(jù)[1]至[13]中任一項(xiàng)所述的方法，上述工序（i)進(jìn)行12天至21天。
[0038] [15]根據(jù)[1]至[13]中任一項(xiàng)所述的方法，上述工序（i)進(jìn)行12天至14天。
[0039] [16]根據(jù)[1]至[15]中任一項(xiàng)所述的方法，上述工序（iii)進(jìn)行至少7天。
[0040] [17]根據(jù)[1]至[16]中任一項(xiàng)所述的方法，上述工序（iii)進(jìn)行14天至30天。
[0041] [18]根據(jù)[1]至[17]中任一項(xiàng)所述的方法，上述工序（iii)進(jìn)行14天至16天。
[0042] [19]根據(jù)[1]至[18]中任一項(xiàng)所述的方法，結(jié)合于Corin的物質(zhì)或結(jié)合于Lrtml的 物質(zhì)為結(jié)合于Corin或Lrtml的抗體或適配體。
[0043] [20]-種產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞，其為通過(guò)[1]至[19]中任一項(xiàng)所述的方法得到 的。
[0044] [21]-種帕金森病治療劑，其含有通過(guò)[1]至[19]中任一項(xiàng)所述的方法得到的產(chǎn) 多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞。
[0045] [22]-種用于由多能干細(xì)胞制作產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞的試劑盒，其含有BMP抑 制劑、TGFP抑制劑、SHH信號(hào)激活劑、FGF8、GSK3P抑制劑、細(xì)胞外基質(zhì)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
[0046] [23]根據(jù)[22]所述的試劑盒，其進(jìn)一步含有抗Corin抗體和/或抗Lrtml抗體。
[0047] [24]根據(jù)[22]或[23]所述的試劑盒，細(xì)胞外基質(zhì)為層粘連蛋白511E8。
[0048] [25]根據(jù)[22]至[24]中任一項(xiàng)所述的試劑盒，BMP抑制劑為L(zhǎng)DN193189。
[0049] [ 26 ]根據(jù)[22 ]至[25 ]中任一項(xiàng)所述的試劑盒，TGFP抑制劑為A83-01。
[0050] [27]根據(jù)[22]至[26]中任一項(xiàng)所述的試劑盒，SHH信號(hào)激活劑為嘌嗎啡胺。
[0051 ] [28]根據(jù)[22]至[27]中任一項(xiàng)所述的試劑盒，GSK30抑制劑為CHIR99021。
[0052] [ 29 ]根據(jù)[22 ]至[28 ]中任一項(xiàng)所述的試劑盒，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為BDNF和⑶NF。
[0053]發(fā)明的效果
[0054]根據(jù)本發(fā)明，能夠有效地獲得對(duì)帕金森病治療劑等有用的、適合于移植的、植活率 高的產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞。
【附圖說(shuō)明】
[0055]圖1中顯示的是產(chǎn)多巴胺細(xì)胞的制造方案的一例。圖中，"Y"表示Y-27632，"AA"表 示抗壞血酸。
[0056] 圖2是表示使用MG(基質(zhì)膠）、CS(CELLStart)、LMlll (層粘連蛋白111E8)或LM511 (層粘連蛋白511E8)作為包被劑來(lái)分化誘導(dǎo)時(shí)第12天的Tra-1-60陽(yáng)性細(xì)胞的含有率、PSA-NCAM陽(yáng)性細(xì)胞的含有率和Corin陽(yáng)性細(xì)胞的含有率的圖表。
[0057]圖3顯示的是人iPS細(xì)胞(836B3)和分化誘導(dǎo)工序的細(xì)胞的相位差圖像（照片）。圖 像分別顯示分化誘導(dǎo)前（左圖）、分化誘導(dǎo)之后（第〇天，dayO)(中央圖）和誘導(dǎo)后第12天 (dayl2)(右圖）。
[0058] 圖4顯示的是分化誘導(dǎo)工序中Corin(〇）、PSA_NCAM(0)和Tra-1-60( A )陽(yáng)性細(xì)胞 數(shù)的含有率的變化。顯示的是第12天以后未進(jìn)行分選的條件下的結(jié)果。
[0059 ]圖5顯不的是未分化標(biāo)記和分化標(biāo)記的表達(dá)量的變化。值用以第0天的值為1時(shí)的 相對(duì)值來(lái)表示。圖5A中的第12天顯示了 Soxl、1163(]、3(?17、13抑(3115〇^、似11〇8和0(^4的值。圖 5B 中的第 42 天顯不了 1^11^1&、1'11、？(《&2、他1'1'1、]\&口2&13、￡111和0(^4的值。
[0060]圖6顯示的是在多聚-L-鳥氨酸/層粘連蛋白/纖維連接蛋白被膜上培養(yǎng)的第42天 的細(xì)胞的免疫染色圖像(照片）。
[0061 ] 圖7顯示的是第12天(dayl2)使用抗Corin抗體分選時(shí)的Corin陽(yáng)性、Corin陰性或 未分選的細(xì)胞的基因表達(dá)分析結(jié)果。圖7A顯示的是各細(xì)胞中Lmxla、Enl、Foxa2、0tx2、Gbx2 和Six3的表達(dá)量。表達(dá)量用以未分選(unsorted)為1時(shí)的相對(duì)值來(lái)表示。圖7B顯示的是第12 天利用微陣列對(duì)于未分選的(unsorted)細(xì)胞和Corin陽(yáng)性細(xì)胞(Corin+)的表達(dá)進(jìn)行比較而 得到的分析結(jié)果。
[0062] 圖8表示的是第12天使用抗Cor in抗體分選的Cor in陽(yáng)性細(xì)胞(Cor in+)或Cor in陰 性細(xì)胞(Corin-)、或未分選的細(xì)胞(Unsorted)的基因表達(dá)分析結(jié)果。圖8A顯示的是各細(xì)胞 中Foxa2/Lmxla(上圖）和0tx2/Lmxla/DAPI (下圖）的三重染色圖像(照片）。圖8B顯示的是各 細(xì)胞中Foxa2陽(yáng)性和Lmxla陽(yáng)性的細(xì)胞含有率。圖8C顯示的是各細(xì)胞中0tx2陽(yáng)性和Lmxla陰 性的細(xì)胞含有率。圖8D顯示的是各細(xì)胞和分化誘導(dǎo)前的細(xì)胞中0ct4和Nanog的表達(dá)量。 [0063] 圖9顯示的是第21天使用抗Cor in抗體分選的Cor in陽(yáng)性細(xì)胞(Cor in+)或Cor in陰 性細(xì)胞(Corin-)、或未分選的細(xì)胞(Unsorted)的基因表達(dá)分析結(jié)果。圖9A顯示的是各細(xì)胞 中1^1^13、￡111、？(《32、(^12、6匕12、和3113的表達(dá)量。表達(dá)量用以未分選的（11118〇1^6(1)為1時(shí) 的相對(duì)值來(lái)表示。圖9B顯示的是各細(xì)胞中Corin/Lmxla(上圖）和Foxa2/Lmxla(下圖）的雙重 染色圖像(照片）。圖9C顯示的是各細(xì)胞中Foxa2陽(yáng)性和Lmx 1 a陽(yáng)性的細(xì)胞含有率。
[0064]圖10顯示的是分化誘導(dǎo)第28天（day28)和第42天（day42)球體（sphere)的大小的 分析結(jié)果。圖10A顯示的是各細(xì)胞團(tuán)的相位差圖像（照片）。圖10B顯示的是各細(xì)胞團(tuán)的直徑 的值的圖表。
[0065]圖11顯示的是分化誘導(dǎo)第28天(day28)和第42天(day42)的基因表達(dá)分析結(jié)果。圖 11A顯示的是針對(duì)Foxa2/DAPI和Nurrl/TH(酪氨酸羥化酶）的免疫染色圖像(照片）。圖11B顯 示的是第28天(左圖）和第42天(右圖）Nurrl陽(yáng)性細(xì)胞、Foxa2陽(yáng)性細(xì)胞和TH陽(yáng)性細(xì)胞的含有 率。圖11C顯示的是由Corin+和未分選的、1X10 6個(gè)第42天的細(xì)胞釋放的多巴胺(DA)、3,4-二羥基苯乙酸(D0PAC)和血清素(5-HT)的量。
[0066]圖12顯示的是將對(duì)通過(guò)分選(第12天)而采取到的Corin陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得到 的細(xì)胞(Corin+)或未進(jìn)行分選而誘導(dǎo)的細(xì)胞(Unsorted)在分化誘導(dǎo)第28天移植至大鼠（6-羥基多巴胺(6-OHDA)給藥)腦內(nèi)后第16周的移植片的情形。圖12A顯示的是移植片的GFAP、 Ki67和人核的免疫染色圖像（照片）。對(duì)圖中框內(nèi)的放大圖像另外進(jìn)行顯示。圖12B、C和D分 別顯示描繪移植了第28天、第42天和第19天的細(xì)胞時(shí)移植片的大小的圖表。圖12E顯示的是 移植了第28天的細(xì)胞時(shí)移植片中的Ki67陽(yáng)性細(xì)胞含有率。
[0067]圖13顯示的是將對(duì)通過(guò)分選(第12天)而采取到的Corin陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得到 的細(xì)胞(Corin+)、未進(jìn)行分選而誘導(dǎo)的細(xì)胞(Unsorted)或陰性對(duì)照(Medium，培養(yǎng)基)在分 化誘導(dǎo)第28天((^728)和第42天((^742)移植至大鼠（6-0冊(cè)4給藥)腦內(nèi)的結(jié)果。圖13六顯示 的是用第28天的細(xì)胞給藥時(shí)移植后的各時(shí)期每單位時(shí)間的回巢行動(dòng)數(shù)（日文：旋回行動(dòng) 數(shù)）。圖13B顯示的是對(duì)用第28天的細(xì)胞給藥時(shí)每個(gè)移植片的TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行描繪的圖 表。圖13C顯示的是用第28天的細(xì)胞給藥時(shí)腦的TH(紅色)和人核(綠色）的染色圖像(照片）。 圖13D顯示的是用第42天的細(xì)胞給藥時(shí)移植后的各時(shí)期每單位時(shí)間的回巢行動(dòng)數(shù)。圖13E顯 示的是對(duì)用第42天的細(xì)胞給藥時(shí)每個(gè)移植片的TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行描繪的圖表。圖13F顯示 的是用第42天的細(xì)胞給藥時(shí)腦的TH(紅色)和人核(綠色）的染色圖像(照片）。
[0068]圖14顯示的是移植了第28天的細(xì)胞時(shí)移植片的分析結(jié)果。圖14A顯示的是對(duì)單位 神經(jīng)細(xì)胞(NeuN+)的TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行描繪的圖表。圖14B顯示的是對(duì)單位供體細(xì)胞(人nuc + )的TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行描繪的圖表。圖14C顯示的是針對(duì)移植片的Foxa2/TH、Pitx3/TH、 Nurrl/TH和Girk2/TH的雙重染色圖像(照片）。
[0069]圖15顯示的是將對(duì)通過(guò)分選(第12天)而采取到的Corin陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得到 的細(xì)胞(Corin+)或未進(jìn)行分選而誘導(dǎo)的細(xì)胞(Unsorted)在分化誘導(dǎo)第28天移植至大鼠（6-OHDA給藥)腦內(nèi)的結(jié)果。圖15A顯示的是各細(xì)胞中第16周的移植片中的血清素（綠)/TH(紅） 的雙重染色圖像（照片）。圖15B顯示的是各細(xì)胞中第16周單位生存細(xì)胞(NeuN陽(yáng)性細(xì)胞）的 血清素陽(yáng)性細(xì)胞的含有率。
[0070]圖16顯示的是第28天的細(xì)胞、第42天的細(xì)胞和胎兒腹側(cè)中腦細(xì)胞的基因表達(dá)分析 的結(jié)果。圖16A顯示的是使用微陣列對(duì)在第12天以Corin陽(yáng)性細(xì)胞分選的細(xì)胞(d28Corin+) 和未分選的細(xì)胞(d28Unsorted)的表達(dá)進(jìn)行比較的結(jié)果(左圖）、以及以Corin陽(yáng)性細(xì)胞分選 的誘導(dǎo)第28天的細(xì)胞(d28Corin+)和誘導(dǎo)第42天的細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行比較的結(jié)果（右圖）。圖 16B顯示的是，對(duì)于第28天的細(xì)胞(d28Corin+)、第42天的細(xì)胞(d42Corin+)和胎兒腹側(cè)中腦 細(xì)胞(VM)，使用PCR測(cè)定0?預(yù)、11?^小(^2、冊(cè)1^1、1'辟叮?112的結(jié)果。用以胎兒腹側(cè)中腦細(xì) 胞(VM)的值為1進(jìn)行比較時(shí)的數(shù)值來(lái)表示。圖16C顯示的是，對(duì)以Corin陽(yáng)性細(xì)胞分選的第28 天的細(xì)胞（d28Corin+)、未分選的第28天的細(xì)胞（d28Unsorted)、分選的第42天的細(xì)胞 (d42C 〇rin+)、未分選的第42天的細(xì)胞(d42Uns〇rted)和胎兒腹側(cè)中腦細(xì)胞(VM)的微陣列進(jìn) 行聚類分析的結(jié)果。
[0071]圖17顯示的是對(duì)通過(guò)分選(第14天)而采取到的Lrtml陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得到的 細(xì)胞的染色圖像。圖17A顯示的是分選后第7天使用Foxa2、Lmxla和DAPI的染色圖像(照片）。 圖中的數(shù)字表示各陽(yáng)性細(xì)胞的含有率，雙重染色時(shí)表示雙重陽(yáng)性細(xì)胞的含有率。圖17B顯示 的是將對(duì)Lrtml陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分選的細(xì)胞(Lrtml + )和未分選的細(xì)胞(Unsort)培養(yǎng)21天后各 標(biāo)記(Foxa2、Nurr 1和TH)的染色圖像(照片）。圖中的數(shù)字表示各陽(yáng)性細(xì)胞的含有率，雙重染 色時(shí)表示雙重陽(yáng)性細(xì)胞的含有率。
[0072]圖18顯示的是將對(duì)通過(guò)分選(第14天)而采取到的Lrtml陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行1天培養(yǎng)而 得到的細(xì)胞移植至10周齡SD大鼠后移植片中的各標(biāo)記(Foxa2、TH和Nurrl)的免疫染色圖像 (照片）。
[0073]圖19-1:圖19顯示的是對(duì)于通過(guò)對(duì)Lrtml陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分選而采取到的細(xì)胞進(jìn)一 步進(jìn)行培養(yǎng)后染色的圖像(從左側(cè)開始，顯示的是Foxa2/DAPI、Nurrl/DAPI、TH/DAPI、Foxa2 +TH+/DAPI、Nurrl+TH+/DAPI和Foxa2+Nurrl+TH+/DAPI)。圖中的數(shù)字表示染色圖像的陽(yáng)性 細(xì)胞率。圖19A顯示的是在分化誘導(dǎo)第14天進(jìn)行分選并培養(yǎng)7天后的染色圖像。
[0074]圖19-2:圖19顯示的是對(duì)于通過(guò)對(duì)Lrtml陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分選而采取到的細(xì)胞進(jìn)一 步進(jìn)行培養(yǎng)后染色的圖像(從左側(cè)開始，顯示的是Foxa2/DAPI、Nurrl/DAPI、TH/DAPI、Foxa2 +TH+/DAPI、Nurrl+TH+/DAPI和Foxa2+Nurrl+TH+/DAPI)。圖中的數(shù)字表示染色圖像的陽(yáng)性 細(xì)胞率。圖19B顯示的是在分化誘導(dǎo)第14天進(jìn)行分選并培養(yǎng)14天后的染色圖像。
[0075]圖19-3:圖19顯示的是對(duì)于通過(guò)對(duì)Lrtml陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分選而采取到的細(xì)胞進(jìn)一 步進(jìn)行培養(yǎng)后染色的圖像(從左側(cè)開始，顯示的是Foxa2/DAPI、Nurrl/DAPI、TH/DAPI、Foxa2 +TH+/DAPI、Nurrl+TH+/DAPI和Foxa2+Nurrl+TH+/DAPI)。圖中的數(shù)字表示染色圖像的陽(yáng)性 細(xì)胞率。圖19C顯示的是在分化誘導(dǎo)第21天進(jìn)行分選并培養(yǎng)7天后的染色圖像。
【具體實(shí)施方式】
[0076]本發(fā)明提供一種由多能干細(xì)胞制造產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞的方法，其包括下面的 工序：
[0077] 工序（i)，在含有選自由BMP抑制劑、TG邱抑制劑、SHH信號(hào)激活劑、FGF8和GSK30抑 制劑組成的組的試劑的培養(yǎng)液中，將多能干細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；
[0078] 工序（i i)，從上述工序（i)中得到的細(xì)胞收集Cor in和/或Lrtml陽(yáng)性細(xì)胞；
[0079]工序（iii)，將上述工序（ii)中得到的細(xì)胞在含有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的培養(yǎng)液中進(jìn)行 懸浮培養(yǎng)。
[0080] <多能干細(xì)胞>
[0081] 本發(fā)明中可使用的多能干細(xì)胞是具有能夠分化為存在于活體中的全部細(xì)胞的多 能性并且還具有增殖能力的干細(xì)胞，對(duì)其并無(wú)特殊限定，包括例如胚性干(ES)細(xì)胞、來(lái)自通 過(guò)核移植得到的克隆胚胎的胚性干(ntES)細(xì)胞、精子干細(xì)胞（"GS細(xì)胞"）、胚性生殖細(xì)胞 ("EG細(xì)胞"）、人工多能性干(iPS)細(xì)胞、來(lái)自培養(yǎng)成纖維細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞的多能細(xì)胞(Muse 細(xì)胞)等。優(yōu)選的多能干細(xì)胞是ES細(xì)胞、ntES細(xì)胞和iPS細(xì)胞。
[0082] (A)胚性干細(xì)胞
[0083] ES細(xì)胞是由人、小鼠等哺乳動(dòng)物的早期胚胎(例如胚泡）的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)建立的、具 有多能性和自我復(fù)制所帶來(lái)的增殖能力的干細(xì)胞。
[0084] ES細(xì)胞是來(lái)自受精卵的8細(xì)胞期、作為桑椹胚后的胚的胚泡的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)的胚來(lái) 源的干細(xì)胞，具有分化為構(gòu)成成體的所有細(xì)胞的能力即所謂分化多能性、以及自我復(fù)制所 帶來(lái)的增殖能力。ES細(xì)胞在小鼠中于1981年被發(fā)現(xiàn)(M.J.Evans and M.H.Kaufman(1981)， Nature 292:154-156)，之后，利用人、猴子等靈長(zhǎng)類也建立了ES細(xì)胞系（J.A.Thomson et al . (1998) ,Science282: 1145-1147；J.A.Thomson et al.(1995), Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:7844-7848；J.A.Thomson et al.(1996),Biol.Reprod.,55: 254-259;J.A.Thomson and V.S.Marshall(1998)，Curr.Top.Dev.Biol?，38:133-165)〇
[0085] ES細(xì)胞可以通過(guò)下述方法來(lái)建立：從對(duì)象動(dòng)物的受精卵的胚泡將內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)取 出，將內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)在成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)。此外，通過(guò)繼代培養(yǎng)進(jìn)行的細(xì)胞維持可 以使用添加有白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor(LIF))、堿性成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor(bFGF))等物質(zhì)的培養(yǎng)液來(lái)進(jìn)行。關(guān)于人和猴子 的ES細(xì)胞的建立和維持方法，例如在USP5，843，780 ; Thomson JA，et al ? (1995)，Proc Natl.Acad.Sci.U S A.92:7844-7848；Thomson JA,et al.(1998),Science.282:1145-1147；H.Suemori et al.(2006),Bi〇chem.Biophys.Res.Commun345:926-932；M.Ueno et al.(2006),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:9554-9559；H.Suemori et al.(2001), Dev.Dyn.,222:273-279；H.Kawasaki et al.(2002),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:1580-1585;Klimanskaya I,et al.(2006)，Nature.444:481_485等中有記載。
[0086] 使用例如補(bǔ)充有O.lmM 2-巰基乙醇、O.lmM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酸、20%KSR 和4ng/ml bFGF的DMEM/F-12培養(yǎng)液作為用于制作ES細(xì)胞的培養(yǎng)液，在37°C、2%⑶2/98%空 氣的濕潤(rùn)氣氛下，能夠維持人ES細(xì)胞（0 .Fumitaka et al ? (2008)，Nat ? Biotechnol ?，26: 215-224)。此外，ES細(xì)胞需要每3~4天進(jìn)行繼代，此時(shí)，繼代可以使用例如含有ImM CaCl2和 20 %KSR的PBS中的0.25 %胰蛋白酶和0. lmg/ml膠原酶IV來(lái)進(jìn)行。
[0087] ES細(xì)胞的選擇一般可以以堿性磷酸酶、0ct-3/4、Nanog等基因標(biāo)記的表達(dá)為指標(biāo) 通過(guò)實(shí)時(shí)（Real-Time)PCR法來(lái)進(jìn)行。尤其在人ES細(xì)胞的選擇中，可以以0CT-3/4、NAN0G、 ECAD等基因標(biāo)記的表達(dá)為指標(biāo)(E.Kroon et al ? (2008)，Nat.Biotechnol ? ,26:443-452)。
[0088]人ES細(xì)胞株、例如WA01(H1)和WA09(H9)可以從WiCell Reserch Institute獲得、 KhES-1、KhES-2和KhES-3可以從京都大學(xué)再生醫(yī)科學(xué)研究所(京都、日本)獲得。
[0089] (B)精子干細(xì)胞
[0090]精子干細(xì)胞是精巢來(lái)源的多能干細(xì)胞，是用于形成精子的作為起源的細(xì)胞。該細(xì) 胞與ES細(xì)胞同樣地能夠分化誘導(dǎo)為各種系的細(xì)胞，例如，具有如果移植至小鼠胚泡則能夠 形成嵌合體小鼠等性質(zhì)（M.Kanatsu-Shinohara et al ? (2003)Biol .Reprod. ,69:612-616; K.Shinohara et al. (2004)，Cell ,119:1001-1012)。利用含有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng) 因子（glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF))的培養(yǎng)液能夠自我復(fù)制， 此外，通過(guò)反復(fù)在與ES細(xì)胞同樣的培養(yǎng)條件下繼代，能夠獲得精子干細(xì)胞（竹林正則等 (2008)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)，26卷，5號(hào)(增刊），41~46頁(yè)，羊土社(東京、日本））。
[0091] (C)胚性生殖細(xì)胞
[0092]胚性生殖細(xì)胞是由胚胎期的原始生殖細(xì)胞建立的、與ES細(xì)胞同樣具有多能性的細(xì) 胞，可以通過(guò)在LIF、bFGF、干細(xì)胞因子(stem cell factor)等物質(zhì)的存在下對(duì)原始生殖細(xì) 胞進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)建立（￥.]\^^81116七31.(1992)，〇611，70:841-847 ;1丄.1^811化1^6七&1. (1992).Nature,359:550-551)〇 [0093] (D)人工多能干細(xì)胞
[0094]人工多能性干（iPS)細(xì)胞是可以通過(guò)將特定的重編程因子以DNA或蛋白質(zhì)的形態(tài) 導(dǎo)入至體細(xì)胞來(lái)制作的、具有與ES細(xì)胞大體同等的特性、例如分化多能性和自我復(fù)制所帶 來(lái)的增殖能力的、體細(xì)胞來(lái)源的人工干細(xì)胞(K. Takahashi and S. Yamanaka(2006)Cell, 126:663-676；K.Takahashi et al.(2007),Cel1,131:861-872；J.Yu et al.(2007), Science,318:1917-1920;Nakagawa,M?等，Nat.Biotechnol.26:101-106(2008);國(guó)際公開 TO2007/069666)。重編程因子可以由ES細(xì)胞特異表達(dá)的基因、其基因產(chǎn)物或非編碼RNA或?qū)?維持ES細(xì)胞的未分化起到重要作用的基因、其基因產(chǎn)物或非編碼RNA、或低分子化合物構(gòu) 成。作為重編程因子中包括的基因，可例示例如0ct3/4、Sox2、Soxl、Sox3、Soxl5、Soxl7、 Klf4、Klf2、c_Myc、N_Myc、L_Myc、Nanog、Lin28、Fbxl5、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Salll、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3 或 Glisl等，這些重編程因子可以單獨(dú)使 用，也可以組合使用。作為重編程因子的組合，可例示如下文獻(xiàn)中記載的組合:W02007/ 069666、TO2008/118820、TO2009/007852、TO2009/032194、TO2009/058413、TO2009/057831、 TO2009/075119、TO2009/079007、TO2009/091659、TO2009/101084、W02009/101407、TO2009/ 102983、TO2009/114949、TO2009/117439、TO2009/126250、TO2009/126251、W02009/126655、 TO2009/157593、TO2010/009015、TO2010/033906、TO2010/033920、W02010/042800、TO2010/ 050626、W0 2010/056831、W02010/068955、W02010/098419、W02010/102267、W0 2010/ 111409、TO2010/111422、TO2010/115050、TO2010/124290、TO2010/147395、TO2010/147612、 Huangfu D，et al.(2008)，Nat.Biotechnol.，26:795_797、Shi Y，et al.(2008)，Cell Stem Cell，2:525_528、Eminli S，et al.(2008)，Stem Cells.26:2467_2474、Huangfu D， et al.(2008),Nat Biotechnol.26:1269-1275^Shi Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,3, 568-574^Zhao Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,3:475-479^Marson A,(2008),Cell Stem Cell，3，132_135、Feng B，et al.(2009),Nat Cell Biol.ll:197_203、R.L.Judson et al(2009) ,Nat.Biotech27 :459-46KLyssiotis CA,et al. (2009) ,Proc Natl Acad Sci U S A.106:8912-8917、Kim JB,et al.(2009),Nature.461:649-643、Ichida JK,et al.(2009),Cell Stem Cel 1.5:491-503^Heng JC,et al.(2010),Cell Stem Cell.6:167_74、Han J,et al.(2010)，Nature.463:1096_100、Mali P,et al.(2010),Stem Cells.28:713_720、Maekawa M,et al.(2011)，Nature.474:225_9。
[0095] 上述重編程因子中還包括以提高組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑[例如丙戊酸 (VPA)、曲古抑菌素 A、丁酸鈉 、MC 1293、M344等低分子抑制劑、針對(duì)HDAC的siRNA和shRNA(例 如HDAClsiRNA Smartpool(Millipore)、針對(duì)HDAC1 的HuSH 29mer shRNA構(gòu)建體（OriGene) 等）等核酸性表達(dá)抑制劑等]、MEK抑制劑（例如PD184352、PD98059、U0126、SL327和 PD0325901)、糖原合酶激酶-3抑制劑（例如Bio和CHIR99021)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（例如 5_氮雜胞苷）、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（例如BIX-01294等低分子抑制劑、針對(duì)Suv39hl、 Suv39h2、SetDBl和G9a的siRNA和shRNA等核酸性表達(dá)抑制劑等）、L-鈣通道激動(dòng)劑（例如 Bayk8644)、丁酸、TG邱抑制劑或ALK5抑制劑（例如LY364947、SB431542、616453和A83-01)、 P53抑制劑（例如針對(duì)p53的siRNA和shRNA)、ARID3A抑制劑（例如針對(duì)ARID3A的siRNA和 shRNA)、miR-29l-3p、miR-294、miR-295和mir-302等miRNA、Wnt信號(hào)（例如可溶性Wnt3a)、神 經(jīng)肽Y、前列腺素類（例如前列腺素 E2和前列腺素 J2)、hTERT、SV40LT、UTFl、IRX6、GLISl、 PITX2、DMRTB1等的建立效率為目的而使用的因子，本說(shuō)明書中，對(duì)于出于改善它們的建立 效率的目的而使用的因子也未與重編程因子進(jìn)行特別的區(qū)別。
[0096]重編程因子在為蛋白質(zhì)形態(tài)的情況下，例如可以通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、與細(xì)胞膜透過(guò) 性肽(例如HIV來(lái)源的TAT和聚精氨酸）的融合、顯微注射等方法導(dǎo)入至體細(xì)胞內(nèi)。
[0097]另一方面，在為DNA形態(tài)的情況下，可以通過(guò)例如病毒、質(zhì)粒、人工染色體等載體、 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體、顯微注射等方法導(dǎo)入至體細(xì)胞內(nèi)。作為病毒載體，可例示逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體、慢病毒載體（以上，Cell，126,pp. 663-676,2006; Cell，131，pp. 861-872,2007; Science ,318，pp. 1917-1920,2007)、腺病毒載體（Science ,322,945-949,2008)、腺病毒伴 隨病毒載體、仙臺(tái)病毒載體(W02010/008054)等。此外，作為人工染色體載體，包括例如人人 工染色體(HAC)、酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC、PAC)等。作為質(zhì)粒，可使用哺 乳動(dòng)物細(xì)胞用質(zhì)粒(Science ,322:949-953,2008)。載體中，可以以核重編程物質(zhì)能夠表達(dá) 的方式包含啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合序列、終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn)等調(diào)控序列，進(jìn)一步 根據(jù)需要可以含有試劑抗性基因（例如卡那霉素抗性基因、氨芐西林抗性基因、嘌呤霉素抗 性基因等）、胸昔激酶基因、白喉毒素基因等篩選標(biāo)記序列、綠色焚光蛋白質(zhì)(GFP)匍甸糖 醛酸酶(GUS)、FLAG等報(bào)告基因序列等。此外，上述載體中，為了在導(dǎo)入體細(xì)胞后將編碼重編 程因子的基因或啟動(dòng)子和編碼與之結(jié)合的重編程因子的基因一起切除，在它們的前后可以 具有LoxP序列。
[0098]此外，在為RNA形態(tài)的情況下，可以通過(guò)例如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、顯微注射等方法導(dǎo)入至 體細(xì)胞內(nèi)，為了抑制分解，可以使用引入5-甲基胞苷和假尿苷(TriLink Biotechnologies) 的RNA(Warren L，（2010)Cell Stem Cell.7:618-630)。
[0099] 作為用于進(jìn)行iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的培養(yǎng)液，包括例如含有10~15%FBS的DMEM、DMEM/ F12或DME培養(yǎng)液(這些培養(yǎng)液中可以進(jìn)一步適當(dāng)含有LIF、青霉素/鏈霉素、嘌呤霉素、L-谷 氨酰胺、非必需氨基酸類、2-巰基乙醇等。）或市售的培養(yǎng)液[例如小鼠 ES細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)液 (TX-WES培養(yǎng)液、Thromb-X公司）、靈長(zhǎng)類ES細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)液（靈長(zhǎng)類ES/iPS細(xì)胞用培養(yǎng) 液、ReproCELL公司）、無(wú)血清培養(yǎng)基(mTeSR、Stemcell Technology公司）]等。
[0100]作為培養(yǎng)方法的例子，例如在37°C、5%⑶2存在下，使體細(xì)胞和重編程因子在含有 10 %FBS的DMEM或DMEM/F12培養(yǎng)液上接觸，并培養(yǎng)約4~7天，之后，將細(xì)胞重新播種于飼養(yǎng) 細(xì)胞（例如絲裂霉素 C處理的ST0細(xì)胞、SNL細(xì)胞等）上，在體細(xì)胞與重編程因子接觸約10天 后，用含有bFGF的靈長(zhǎng)類ES細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)液培養(yǎng)，該接觸約30~約45天或其以上后，能夠 生成iPS樣集落。
[0101] 或者，在37°C、5%⑶2存在下，在飼養(yǎng)細(xì)胞（例如絲裂霉素 C處理的ST0細(xì)胞、SNL細(xì) 胞等)上用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液(其中可以進(jìn)一步適當(dāng)含有LIF、青霉素/鏈霉素、嘌呤 霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸類、2-巰基乙醇等。）培養(yǎng)，約25~約30天或其以上后，能夠 生成ES樣集落?？蓛?yōu)選例示使用經(jīng)重編程的體細(xì)胞本身(Takahashi K，et al.(2009)，PLoS 01^.4:68067或冊(cè)2010/137746)或使用細(xì)胞外基質(zhì)（例如層粘連蛋白-5(102009/123349)和 基質(zhì)膠(BD公司））來(lái)代替飼養(yǎng)細(xì)胞的方法。
[0102] 此外，還可例示使用不含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的方法（Sun N，et al. (2009)， Proc Natl Acad Sci USA. 106:15720-15725)。進(jìn)而，為了提高建立效率，可以利用低氧條 件(0.1% 以上、15% 以下的氧濃度)來(lái)建立 iPS 細(xì)胞(Yoshida Y，et al.(2009)，Cell Stem Cell?5:237-241或W02010/013845)。
[0103] 上述培養(yǎng)期間，培養(yǎng)開始第2天以后，與新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)液進(jìn)行替換，每天1次。 此外，核重編程中使用的體細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)沒有限定，為每l〇〇cm 2培養(yǎng)盤約5 X103~約5 X106 細(xì)胞的范圍。
[0104] iPS細(xì)胞可以通過(guò)所形成的集落的形狀進(jìn)行選擇。另一方面，導(dǎo)入與體細(xì)胞經(jīng)重編 程時(shí)所表達(dá)的基因（例如0ct3/4、Nanog)相關(guān)聯(lián)而表達(dá)的試劑抗性基因作為標(biāo)記基因時(shí)，可 以對(duì)通過(guò)利用含有相應(yīng)試劑的培養(yǎng)液(選擇培養(yǎng)液)進(jìn)行培養(yǎng)而建立的iPS細(xì)胞進(jìn)行選擇。 此外，標(biāo)記基因?yàn)闊晒獾鞍踪|(zhì)基因時(shí)通過(guò)利用熒光顯微鏡的觀察、在為熒光素酶基因時(shí)通 過(guò)加入發(fā)光基質(zhì)、此外在為顯色酶基因時(shí)通過(guò)加入發(fā)色基質(zhì)，能夠?qū)PS細(xì)胞進(jìn)行選擇。
[0105] 本說(shuō)明書中使用的"體細(xì)胞"用語(yǔ)是指除了卵子、卵母細(xì)胞、ES細(xì)胞等生殖系細(xì)胞 或分化全能性細(xì)胞以外的所有動(dòng)物細(xì)胞(優(yōu)選為包括人的哺乳動(dòng)物細(xì)胞）。體細(xì)胞中，非限 定性地包括胎兒(幼仔）的體細(xì)胞、新生兒(幼仔）的體細(xì)胞、和成熟健全的或疾患性的體細(xì) 胞中的任一種，此外，還包括原代培養(yǎng)細(xì)胞、繼代細(xì)胞和株化細(xì)胞中的任一種。具體而言，體 細(xì)胞可例示例如（1)神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞等組織干細(xì)胞(體 性干細(xì)胞）、（2)組織前體細(xì)胞、（3)淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、成纖維細(xì)胞 (皮膚細(xì)胞等）、毛細(xì)胞、肝細(xì)胞、胃粘膜細(xì)胞、腸細(xì)胞、脾細(xì)胞、胰細(xì)胞(胰外分泌細(xì)胞等）、腦 細(xì)胞、肺細(xì)胞、腎細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等已分化的細(xì)胞等。
[0106] 此外，從在將iPS細(xì)胞用作移植用細(xì)胞的材料時(shí)不發(fā)生排斥反應(yīng)的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選 使用移植前的個(gè)體的HLA基因型為相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的體細(xì)胞。這里，"實(shí)質(zhì)上相同"是指利 用免疫抑制劑能夠抑制針對(duì)所移植的細(xì)胞的免疫反應(yīng)的程度的、HLA基因型一致，例如具有 HLA-A、HLA-B和HLA-DR 3基因座或加上HLA-C的4基因座一致的HLA型的體細(xì)胞。
[0107] (E)通過(guò)核移植得到的克隆胚胎來(lái)源的ES細(xì)胞
[0108] nt ES細(xì)胞是通過(guò)核移植技術(shù)制作的克隆胚胎來(lái)源的ES細(xì)胞，具有與受精卵來(lái)源 的ES細(xì)胞大體相同的特性（T .Wakayama et al ? (2001 )，Science，292:740-743; S .Wakayama et al.(2005),Bi〇l?Reprod72:932-936；J.Byrne et al.(2007),Nature,450:497-502)。即，由通過(guò)將未受精卵的核與體細(xì)胞的核置換得到的克隆胚胎來(lái)源的胚泡的內(nèi)部細(xì) 胞團(tuán)建立的ES細(xì)胞為nt ES(nuclear transfer ES)細(xì)胞。為了制作nt ES細(xì)胞，利用核移植 技術(shù)（J.B.Cibelli et al.(1998),Nature Biotechnol.，16:642-646)與ES細(xì)胞制作技術(shù) (上述）的組合(若山清香等(2008)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)，26卷，5號(hào)(增刊），47~52頁(yè)）。核移植中，可以 通過(guò)在哺乳動(dòng)物的去掉核的未受精卵中注入體細(xì)胞的核并培養(yǎng)數(shù)小時(shí)來(lái)進(jìn)行重編程。
[0109] (F)多系分化持續(xù)應(yīng)激細(xì)胞（Multilineage-differentiating Stress Enduring cells，Muse 細(xì)胞）
[0110] Muse細(xì)胞是通過(guò)W02011/007900中記載的方法制造的多能干細(xì)胞，詳細(xì)而言，是通 過(guò)長(zhǎng)時(shí)間用胰蛋白酶對(duì)成纖維細(xì)胞或骨髓間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行處理、優(yōu)選進(jìn)行8小時(shí)或16小時(shí)胰 蛋白酶處理后，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而得到的具有多能性的細(xì)胞，SSEA-3和CD105為陽(yáng)性。 <產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞>
[0112]本發(fā)明中，除非特殊指明，否則，產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞包括產(chǎn)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞或 多巴胺能神經(jīng)元等。此外，產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞可以是包含他種細(xì)胞的細(xì)胞集團(tuán)，優(yōu)選為 不含血清素神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞集團(tuán)。產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞優(yōu)選為含有Foxa2Nurrl和/或TH 陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞集團(tuán)。本發(fā)明中，作為人Foxa2,可列舉NCBI登錄號(hào)NM_021784或NM_153675 所示的多聚核苷酸和它們編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，作為人Nurrl，可列舉NCBI登錄號(hào)NM_ 006186所示的多聚核苷酸和它們編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，作為人TH，可列舉NCBI登錄號(hào) NM_000360、NM_199292或NM_199293所示的多聚核苷酸和它們編碼的蛋白質(zhì)。
[0113] <細(xì)胞外基質(zhì)〉
[0114] 本發(fā)明中，細(xì)胞外基質(zhì)是存在于細(xì)胞外的超分子結(jié)構(gòu)體，可以為天然來(lái)源，也可以 為人工物質(zhì)（重組體）。可列舉例如膠原蛋白、蛋白多糖、纖維粘連蛋白、透明質(zhì)酸、肌腱蛋 白、巢蛋白、彈性蛋白、原纖維蛋白和層粘連蛋白等物質(zhì)或它們的片段。這些細(xì)胞外基質(zhì)可 以組合使用，例如可以為BD基質(zhì)膠(BD Matrige 1，商標(biāo))等來(lái)自細(xì)胞的制備物。優(yōu)選為層粘 連蛋白或其片段。本發(fā)明中，層粘連蛋白是具有a鏈、齡連、Y鏈各有1條的異源三聚體結(jié)構(gòu)的 蛋白質(zhì)，沒有特別限定，例如 (1鏈為(11、〇2、(13、(14或(15，0鏈為01、02或03，并且丫鏈可例示丫 1、Y 2或y 3,更優(yōu)選為由a5、m和y 1構(gòu)成的層粘連蛋白511。本發(fā)明中，層粘連蛋白可以為 片段，只要是具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性的片段就沒有特別限定，例如可以為作為用彈性蛋白 酶消化而得到的片段的E8片段。因此，本發(fā)明中，可例示W(wǎng)02011/043405中記載的層粘連蛋 白511E8(優(yōu)選人層粘連蛋白511E8)。
[0115] <BMP抑制劑 >
[0116] 本發(fā)明中，BMP抑制劑可例示Chordin、Noggin、卵泡抑素(Follistatin)等蛋白質(zhì) 性抑制劑、0<^8〇111〇印11；[11(即6-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基）苯基]-3-吡啶-4-基-吡唑并[1， 5-a]嘧啶）、其衍生物（？.8.丫116七31.(2007)，(：化。111&衍〇11，116:11_60;?.8.￥116七&1. (2008)，Nat.Chem.Biol.，4:33-41;J.Hao et al.(2008)，PLoS 0NE，3(8):e2904)和 LDN193189(即 4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基）吡唑并[l，5-a]嘧啶-3-基）喹啉 hDorsomorphin 和LDN193189已有市售，可分別從Sigma-Aldrich公司和Stemgent公司獲得。本發(fā)明中使用 的BMP抑制劑可優(yōu)選為L(zhǎng)DN193189。
[0117] 培養(yǎng)液中LDN193189的濃度只要是阻礙BMP的濃度就沒有特別限定，例如為InM、 1 OnM、50nM、1 OOnM、50 OnM、7 5 OnM、1 處、2處、3uM、4處、5處、6處、7處、8虛、9處、10處、15處、20ii 1、25虛、30虛、40虛、50虛，但不限于此。優(yōu)選為10011]\1。
[0118] <TGF0 抑制劑 >
[0119] 本發(fā)明中，TGFI3抑制劑是阻礙從TGFI3與受體的結(jié)合至繼續(xù)向SMAD傳遞信號(hào)的物 質(zhì)，可列舉阻礙與作為受體的ALK家族結(jié)合的物質(zhì)、或阻礙由ALK家族導(dǎo)致的SMAD的磷酸化 的物質(zhì)，可例示例如Lefty-1 (作為NCBI Accession No.，可例示小鼠：NM_010094、人:NM_ 020997)、SB431542、SB202190(以上，R.K.Lindemann et al.，Mol .Cancer ,2003,2:20)、 SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、 LY364947、LY580276(Lilly Research Laboratories)、A83-01 (TO 2009146408)和它們的 衍生物等。本發(fā)明中使用的TGFP抑制劑可優(yōu)選為A83-01。
[0120] 培養(yǎng)液中A83-01的濃度只要是阻礙ALK5的濃度就沒有特別限定，例如為1 nM、 1 OnM、50nM、1 OOnM、50 OnM、7 5 OnM、1 處、2處、3uM、4處、5處、6處、7處、8虛、9處、10處、15處、20ii 1、25虛、30虛、40虛、50虛，但不限于此。優(yōu)選為50011]\1至5虛，更優(yōu)選為50011]\1。
[0121] <SHH信號(hào)激活劑>
[0122]本發(fā)明中，SHH(Sonic hedgehog)信號(hào)激活劑定義為，引起SHH結(jié)合于作為受體的 卩3七〇116(1(?丨〇111)而導(dǎo)致的31]10〇1：116116(1(31]10)的脫抑制和進(jìn)一步引起6112的活化的物質(zhì)，可 例示例如SHH、Hh-Agl.5(Li,X.，e t al.，Nature Biotechnology，23,215~221(2005).)、 Smoothened激動(dòng)劑，SAG(N-甲基-N'-(3-吡啶基芐基)-N'-(3-氯苯并[b]噻吩-2-羰基)-1， 4_二氨基環(huán)己烷）、20a-羥基膽固醇、嘌嗎啡胺和它們的衍生物等（Stanton BZ，Peng LF.， Mol Biosyst. 6:44-54，2010)。本發(fā)明中使用的SHH信號(hào)激活劑可優(yōu)選為嘌嗎啡胺。
[0123] 培養(yǎng)液中嘌嗎啡胺的濃度只要是使Gli2活化的濃度就沒有特別限定，例如為InM、 1 OnM、50nM、100nM、50 OnM、7 5 OnM、1 處、2處、3uM、4處、5處、6處、7處、8虛、9處、10處、15處、20ii 1、25虛、30虛、40虛、50虛，但不限于此。優(yōu)選為2虛。
[0124] <GSK30 抑制劑 >
[0125] 本發(fā)明中，GSK3P抑制劑定義為阻礙GSK-3P蛋白質(zhì)的激酶活性(例如對(duì)0索烴素的 磷酸化能力）的物質(zhì)，已知多種物質(zhì)，可列舉例如作為靛玉紅衍生物的BI0(別名GSK-3P抑制 劑IX;6-溴靛玉紅3'-肟）、作為馬來(lái)酰亞胺衍生物的SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1_甲 基-1H-吲哚-3-基)-lH-吡咯_2,5_二酮）、作為苯基a溴甲酮化合物的GSK-3P抑制劑VII(4-二溴苯乙酮）、作為細(xì)胞膜透過(guò)型磷酸化肽的L803-mts (別名GSK-30肽抑制劑；Myr-N-GKEAPPAPPQpSP-NH2(序列號(hào) 1))和具有高選擇性的 CHIR99021(6-[2-[4-(2,4-二氯苯基）- 5-(4_甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈）。這些化合物已由例如 Calbiochem公司、Biomol公司等市售，可以容易地利用，也可以由其他途徑獲得，或者也可 以自行制作。本發(fā)明中使用的GSK-3P抑制劑可優(yōu)選為CHIR99021。
[0126] 培養(yǎng)液中 CHIR99021 的濃度例如為 lnM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、lyM、2yM、 3虛、4虛、5虛、6虛、7處、8處、9虛、10虛、15虛、20虛、25處、30虛、40虛、50處，但不限于此。優(yōu) 選為luM。
[0127] <FGF8>
[0128] 本發(fā)明中，F(xiàn)GF8沒有特別限定，為人FGF8的情況下，可例示FGF8a、FGF8b、FGF8e或 FGF8f 4種剪切形式，本發(fā)明中更優(yōu)選為FGF8KFGF8已由例如和光公司、R&D systems公司 等市售，可以容易地利用，也可以通過(guò)利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法在細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá) 來(lái)獲得。
[0129]培養(yǎng)液中 FGF8 的濃度例如為 lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/ mL、200ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL，但不限于此。優(yōu)選為 100ng/mL 〇
[0130] <對(duì)細(xì)胞進(jìn)行選擇的方法>
[0131] 本發(fā)明中，為了從細(xì)胞集團(tuán)選擇Cor in陽(yáng)性細(xì)胞和/或Lrtml陽(yáng)性細(xì)胞，可以使用與 Corin或Lrtml特異性結(jié)合的物質(zhì)。結(jié)合于Corin或Lrtml的物質(zhì)可以使用抗體、適配體，優(yōu)選 為抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0132] 本發(fā)明中，抗體可以為多克隆或單克隆抗體。這些抗體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員 公知的技術(shù)制成（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987)Publish.John Wiley and Sons.Section 11.12_11.13)。具體而言，抗體為多克隆 抗體時(shí)，根據(jù)常規(guī)方法對(duì)在大腸菌或哺乳類細(xì)胞系等中表達(dá)并純化的編碼Corin或Lrtml的 蛋白質(zhì)、具有部分氨基酸序列的寡肽或糖脂質(zhì)進(jìn)行純化，對(duì)家兔等非人動(dòng)物進(jìn)行免疫，可以 根據(jù)常規(guī)方法從該免疫動(dòng)物的血清獲得。另一方面，為單克隆抗體時(shí)，可以從由使經(jīng)上述免 疫的非人動(dòng)物得到的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合而制備的雜交瘤細(xì)胞中獲得 (Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley and Sons . Sectionll .4-11.11)。作為抗體的抗原結(jié)合片段，可例示抗體的一部分 (例如Fab片段)或合成抗體片段(例如單鏈Fv片段"ScFV'hFab和F(ab) 2片段等抗體片段也 可以通過(guò)基因工程上公知的方法來(lái)制作。例如針對(duì)Corin的抗體可以通過(guò)W02004/065599、 TO2006/009241所述的制作方法獲得，針對(duì)Lrtml的抗體可以通過(guò)W02013/015457所述的制 作方法獲得。
[0133] 人Corin可由NCBI登錄號(hào)NM_006587獲得其序列。同樣地，人Lrtml可由NM_020678 獲得其序列。
[0134] 以對(duì)表達(dá)Corin或Lrtml的細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別或分離為目的，該結(jié)合的物質(zhì)可以與例如 熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、酶、生物素或鏈霉親和素等能夠檢測(cè)的物質(zhì)或蛋白 質(zhì)A、蛋白質(zhì)G珠或磁珠等使得能夠分離提取的物質(zhì)結(jié)合或接合。
[0135] 該結(jié)合的物質(zhì)還可以間接標(biāo)記?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方法進(jìn)行，可 列舉例如使用特異性結(jié)合于該抗體的預(yù)先經(jīng)標(biāo)記的抗體(第二抗體)的方法。
[0136] 作為對(duì)產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括使用流式細(xì)胞儀或蛋白質(zhì)芯 片等。
[0137] 提取產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞的方法可例示使粒子接合于該結(jié)合的物質(zhì)并沉降的 方法、使用磁珠利用磁性對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選的方法(例如MACS)、使用熒光標(biāo)記并使用細(xì)胞分 選儀的方法、或使用固定有抗體等的載體(例如細(xì)胞濃縮柱)的方法等。
[0138] 本發(fā)明中，特異性結(jié)合于Corin或Lrtml的適配體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的 技術(shù)制成（SELEX(systematic evolution of ligand by exponential enrichment，指數(shù) 富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)）法：￡11;[叫1:011，4.0.&3208七31<:，]\￥.(1990)他1：11代，346,818- 822.,Tuerk,C.&Gold,L.(1990)Science,249,505-510.〇)
[0139] <神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子>
[0140] 本發(fā)明中，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生存和功能維持中發(fā)揮重要功能的膜 受體的配體，可列舉例如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve Growth Factor，NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (Brain-derived Neurotrophic Factor，BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(Neurotrophin 3，NT_3)、 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子_4/5(Neurotrophin 4/5，NT_4/5)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-6(Neurotrophin 6，NT_ 6)、喊性FGF(basic FGF)、酸性FGF(acidic FGF)、FGF_5、表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor，EGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)、膜島素（Insulin)、膜島 素樣生長(zhǎng)因子l(Insulin Like Growth Factor 1，IGF 1)、膜島素樣生長(zhǎng)因子2(Insulin Like Growth Factor 2, IGF 2)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Glia cell line-derived Neurotrophic Factor，GDNF)、TGF_b2、TGF_b3、白細(xì)胞介素-6(Interleukin 6，IL-6)、睫狀 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Ciliary Neurotrophic Factor，CNTF)和LIF等。本發(fā)明中優(yōu)選的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng) 因子為選自由GDNF和BDNF組成的組的因子。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子已由例如和光公司、R&D systems 公司等市售，可以容易地利用，也可以通過(guò)利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法在細(xì)胞中強(qiáng)制 表達(dá)而獲得。
[0141 ]培養(yǎng)液中GDNF1 的濃度例如為0 ? lng/mL、0 ? 5ng/mL、Ing/mL、5ng/mL、10ng/mL、 15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、1OOng/mL、200ng/mL、500ng/mL，但 不限于此。優(yōu)選為1 Ong/mL。
[0142] 培養(yǎng)液中BDNF 1 的濃度例如為0 ? lng/mL、0 ? 5ng/mL、Ing/mL、5ng/mL、1 Ong/mL、 15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、1OOng/mL、200ng/mL、500ng/mL，但 不限于此。優(yōu)選為20ng/mL。
[0143] < 工序（i)>
[0144] 本發(fā)明中，上述工序(i)優(yōu)選通過(guò)下面的多階段工序來(lái)進(jìn)行：
[0145] (a)工序，在含有BMP抑制劑和TGFP抑制劑的培養(yǎng)液中，將多能干細(xì)胞在細(xì)胞外基 質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；
[0146] (b)工序，在含有BMP抑制劑、TGFP抑制劑、SHH信號(hào)激活劑和FGF8的培養(yǎng)液中，將上 述工序(a)中得到的細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；
[0147] (c)工序，在含有BMP抑制劑、TGFI3抑制劑、SHH信號(hào)激活劑、FGF8和GSK30抑制劑的 培養(yǎng)液中，將上述工序(b)中得到的細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；
[0148] (d)工序，在含有BMP抑制劑和GSK3P抑制劑的培養(yǎng)液中，將上述工序(c)中得到的 細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
[0149] 本發(fā)明中，工序（i)中使用的培養(yǎng)液可以以動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)中所使用的培養(yǎng)基為 基礎(chǔ)培養(yǎng)基來(lái)制備。作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，包括例如格拉斯哥最低必需培養(yǎng)基（Glasgow's Minimal Essential Medium，GMEM)培養(yǎng)基、頂DM培養(yǎng)基、Medium 199培養(yǎng)基、伊格爾最低必 需培養(yǎng)基(Eagle's Minimum Essential Medium，EMEM)培養(yǎng)基、aMEM培養(yǎng)基、達(dá)爾伯克氏改 良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's Medium，DMEM)培養(yǎng)基、Ham's F12培養(yǎng) 基、RPMI 1640培養(yǎng)基、Fischer's培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基（Life Technologies)和它們 的混合培養(yǎng)基等。優(yōu)選為GMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中可以含有血清，或者也可以無(wú)血清。根據(jù)需 要，培養(yǎng)基既可以含有例如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、敲除型血清替代物（Knockout Serum Replacement，KSR)(培養(yǎng)ES細(xì)胞時(shí)的FBS的血清替代物）、N2添加劑（Invitrogen)、B27添加 劑(Invitrogen)、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前體、微量元素、2-疏基乙醇、3 ' -疏基甘油等一 種以上的血清替代物，也可以含有脂質(zhì)、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax( Invitrogen)、非必 需氨基酸、維生素、增殖因子、低分子化合物、抗生物質(zhì)、抗氧化劑、丙酮酸、緩沖劑、無(wú)機(jī)鹽 類等一種以上的物質(zhì)。優(yōu)選的培養(yǎng)液為含有KSR、2-巰基乙醇、非必需氨基酸和丙酮酸的 GMEM培養(yǎng)基。可以在該培養(yǎng)液中適當(dāng)加入選自由BMP抑制劑、TGFI3抑制劑、SHH信號(hào)激活劑、 FGF8和GSK30抑制劑組成的組的試劑而培養(yǎng)。
[0150] 工序（i)中，在細(xì)胞外基質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)可以通過(guò)使用以細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行了包 被處理的培養(yǎng)容器來(lái)培養(yǎng)而進(jìn)行。包被處理可以通過(guò)在將含有細(xì)胞外基質(zhì)的溶液放入培養(yǎng) 容器后再將該溶液適當(dāng)除去來(lái)進(jìn)行。
[0151] 關(guān)于培養(yǎng)條件，培養(yǎng)溫度沒有特別限定，約為30~40 °C，優(yōu)選約為37 °C，在含有C02 的空氣氣氛下進(jìn)行培養(yǎng)，C02濃度優(yōu)選約為2~5%。
[0152] 培養(yǎng)時(shí)間只要是Corin和/或Lrtml陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)間就沒有特別限定，工序(i) 優(yōu)選進(jìn)行至少10天。更優(yōu)選為12天至21天，進(jìn)一步優(yōu)選為12天至14天。
[0153] 此外，對(duì)于工序（i)中的工序(a)，可列舉1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天 以上、6天以上、7天以上或其以上的天數(shù)。優(yōu)選為1天。同樣地，對(duì)于工序(b)，可列舉1天以 上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以上或其以上的天數(shù)。優(yōu)選為2天。同 樣地，對(duì)于工序(c)，可列舉1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以 上或其以上的天數(shù)。優(yōu)選為4天。同樣地，對(duì)于工序(d)，可列舉1天以上、2天以上、3天以上、4 天以上、5天以上、6天以上、7天以上或其以上的天數(shù)。優(yōu)選為5天以上。
[0154] 多能干細(xì)胞可以使細(xì)胞解離而使用，作為使細(xì)胞解離的方法，可列舉例如力學(xué)解 離的方法、使用具有蛋白酶活性和膠原酶活性的解離溶液(例如Accutase (商標(biāo))和Accumax (商標(biāo))等)或僅具有膠原酶活性的解離溶液的解離方法。優(yōu)選使用下述方法:使用胰蛋白酶 或其替代物(可例示TrypLE CTS(Life Technologies))使人多能干細(xì)胞解離。使細(xì)胞解離 時(shí)，優(yōu)選在解離后適當(dāng)添加 ROCK抑制劑而培養(yǎng)。添加 ROCK抑制劑時(shí)，可以添加并培養(yǎng)至少1 天，更優(yōu)選為1天。
[0155] <R〇CK抑制劑 >
[0156] 本發(fā)明中，ROCK抑制劑只要是能夠抑制Rho激酶(ROCK)的功能的物質(zhì)就沒有特別 限定，可列舉例如Y-27632(例如參照Ishizaki et al ?，Mol .Pharmacol .57,976-983 (2000) ;Narumiya et al.，Methods Enzymol. 325,273-284(2000) )、Fasudil/HA1077(例如 參照Uenata et al.，Nature 389: 990-994(1997) )、H-1152(例如參照Sasaki et al.， Pharmacol .Ther.93:225-232(2002))、Wf-536(例如參照Nakajima et al ?，Cancer Chemother Pharmacol .52(4): 319-324(2003))和它們的衍生物、以及針對(duì)ROCK的反義核 酸、RNA干擾誘導(dǎo)性核酸(例如s iRNA)、顯性負(fù)突變體和它們的表達(dá)載體。此外，作為ROCK抑 制劑，已知還有其他低分子化合物，因而，本發(fā)明中也可以使用這樣的化合物或它們的衍生 物(例如參照美國(guó)專利申請(qǐng)公開第20050209261號(hào)、美國(guó)專利申請(qǐng)公開第20050192304號(hào)、美 國(guó)專利申請(qǐng)公開第20040014755號(hào)、美國(guó)專利申請(qǐng)公開第20040002508號(hào)、美國(guó)專利申請(qǐng)公 開第20040002507號(hào)、美國(guó)專利申請(qǐng)公開第20030125344號(hào)、美國(guó)專利申請(qǐng)公開第 20030087919號(hào)和國(guó)際公開第2003/062227號(hào)、國(guó)際公開第2003/059913號(hào)、國(guó)際公開第 2003/062225號(hào)、國(guó)際公開第2002/076976號(hào)、國(guó)際公開第2004/039796號(hào)）。本發(fā)明中，可使 用1種或2種以上的ROCK抑制劑。本發(fā)明中使用的ROCK抑制劑可優(yōu)選為Y-27632。
[0157] Y-27632 的濃度例如為 100nM、500nM、750nM、lyM、2yM、3yM、4yM、5yM、6yM、7yM、8yM、 9虛、10虛、15虛、20虛、25虛、30虛、40虛、50虛，但不限于此。優(yōu)選為10虛。
[0158] < 工序（ii)>
[0159] (ii)的收集Corin和/或Lrtml陽(yáng)性細(xì)胞的工序可以基于上述< 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行選擇的 方法 >來(lái)進(jìn)行。
[0160] < 工序（iii)>
[0161] 工序(i i i)中使用的培養(yǎng)液可以以動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)中所使用的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng) 基來(lái)制備。作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，包括例如格拉斯哥最低必需培養(yǎng)基(GMEM)培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng) 基、Medium 199培養(yǎng)基、伊格爾最低必需培養(yǎng)基(EMEM)培養(yǎng)基、aMEM培養(yǎng)基、達(dá)爾伯克氏改 良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基、Ham's F12培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、Fischer's培養(yǎng)基、 Neurobasal Medium(Life Technologies)和它們的混合培養(yǎng)基等。優(yōu)選為Neurobasal培養(yǎng) 基。培養(yǎng)基中可以含有血清，或者也可以無(wú)血清。根據(jù)需要，培養(yǎng)基既可以含有例如白蛋白、 轉(zhuǎn)鐵蛋白、敲除型血清替代物（KSR)(培養(yǎng)ES細(xì)胞時(shí)的FBS的血清替代物）、N2添加劑 (1]1￥；[1：1'(^611)、827添加劑（111￥；[1：1'(^611)、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前體、微量元素、2-疏基 乙醇、3'-巰基甘油等一種以上的血清替代物，也可以含有脂質(zhì)、氨基酸、L-谷氨酰胺、 Glutamax(Invitrogen)、非必需氨基酸、維生素、增殖因子、低分子化合物、抗生物質(zhì)、抗氧 化劑、丙酮酸、緩沖劑、無(wú)機(jī)鹽類、核酸(例如二丁酰環(huán)磷酸腺苷(dbcAMP))等一種以上的物 質(zhì)。優(yōu)選的培養(yǎng)液為含有B27添加劑、抗壞血酸和dbcAMP的Neurobasal培養(yǎng)基。可以在該培 養(yǎng)液中加入適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)營(yíng)養(yǎng)因子而培養(yǎng)。
[0162] 工序（iii)中的懸浮培養(yǎng)是將細(xì)胞在不附著于培養(yǎng)容器的狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)，沒有 特別限定，出于提高與細(xì)胞的附著性的目的，可以使用如下培養(yǎng)容器來(lái)進(jìn)行:未經(jīng)人工處理 (例如以細(xì)胞外基質(zhì)等進(jìn)行的包被處理）的培養(yǎng)容器、或者經(jīng)人工抑制附著的處理（例如聚 羥乙基甲基丙烯酸(poly-HEMA)、以非離子性表面活性多元醇(普朗尼克(Plur 〇niC)F-127 等)或磷脂質(zhì)類似結(jié)構(gòu)物(例如以2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿為組成單元的水溶性聚 合物(Lipidure))包被處理的培養(yǎng)容器。
[0163] 關(guān)于培養(yǎng)條件，培養(yǎng)溫度沒有特別限定，約為30~40 °C，優(yōu)選約為37 °C，在含有C02 的空氣氣氛下進(jìn)行培養(yǎng)，C02濃度優(yōu)選約為2~5%。
[0164] 培養(yǎng)時(shí)間只要是Nurr 1或Foxa2陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)間就沒有特別限定，工序（i i i) 優(yōu)選進(jìn)行至少7天。更優(yōu)選為7天至30天，進(jìn)一步優(yōu)選為14天至21天或14天至16天，最優(yōu)選為 16天。
[0165] 接著工序（ii)進(jìn)行工序（iii)時(shí)，優(yōu)選適當(dāng)添加ROCK抑制劑而培養(yǎng)。添加ROCK抑制 劑時(shí)，可以添加并培養(yǎng)至少1天，更優(yōu)選為1天。
[0166] <帕金森病治療劑>
[0167] 本發(fā)明中得到的產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞能夠作為制劑對(duì)帕金森病患者進(jìn)行給藥。 通過(guò)將得到的產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞懸浮于生理鹽水等并移植至患者的紋狀體區(qū)域來(lái)進(jìn) 行。因此，本發(fā)明中，提供一種包含通過(guò)上述方法由多能干細(xì)胞得到的產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì) 胞的帕金森病治療劑。
[0168] 本發(fā)明中，帕金森病治療劑中包含的產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)只要是移植 片在給藥后能夠植活就沒有特別限定，例如可含有15X10 4個(gè)以上。此外，也可以根據(jù)癥狀、 體軀的大小適當(dāng)增減而制備。
[0169] 產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞向患病部位的移植可以通過(guò)例如Nature Neuroscience, 2,1137(1999)或N Engl J Med. ;344:710-9(2001)中記載的那樣的方法來(lái)進(jìn)行。
[0170] <試劑盒>
[0171]本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，包括由多能干細(xì)胞制作產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞的試劑 盒。該試劑盒中包含上述制作產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞的各工序中使用的培養(yǎng)液、添加劑或 培養(yǎng)容器等。例如可列舉選自由抗Cor in抗體、抗Lrtml抗體、BMP抑制劑、TGFI3抑制劑、SHH信 號(hào)激活劑、FGF8、GSK3P抑制劑、細(xì)胞外基質(zhì)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子組成的組的試劑。本試劑盒中還 可以進(jìn)一步包含記載有制造工序的步驟的文字、說(shuō)明書。
[0172] 以下列舉實(shí)施例進(jìn)一步具體地對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，但顯而易見地，本發(fā)明不限于 這些實(shí)施例。
[0173] 實(shí)施例
[0174] 實(shí)施例1
[0175] 細(xì)胞和培養(yǎng)
[0176] 人ES細(xì)胞（KhES-1)由京都大學(xué)再生醫(yī)科學(xué)研究所惠贈(zèng) （Suemori H，et al.Biochem Biophys Res Commun.345:926-32,2006)。作為人iPS細(xì)胞的404C2和836B3是， 作為利用游離載體(Episomal Vector)將0(^3/4、3(?2、1(1€4、1-]^(：、1預(yù)28和口5381^祖導(dǎo)入 至人成纖維細(xì)胞而得到的細(xì)胞由京都大學(xué)的山中教授等惠贈(zèng)（0kita，et al，Nat Methods.8:409-412,2011)。
[0177] ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞按照基于Miyazaki T et al ?，Nat Commun.3:1236,2012中記載 的方法來(lái)培養(yǎng)。簡(jiǎn)言之，利用以層粘連蛋白511E8包被的6孔板來(lái)培養(yǎng)。
[0178] 將以這種方式得到的ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞用TrypLE CTS(Life Technologies)解離， 以每一個(gè)孔4X104個(gè)移入另外準(zhǔn)備的以層粘連蛋白511E8(iMatrix-511、Nippi)包被的6孔 板，用上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)4天后，確認(rèn)已經(jīng)鋪滿，將培養(yǎng)基替換為含有10yM Y-27632(和光）、 O.lyM LDN193189(STEMGENT)和 0.5yM A83-01(和光）的基本培養(yǎng)基 A(8%KSR (Invitrogen)、含有ImM丙酮酸鈉 （Sodium pyruvate，Invitrogen)、0? ImM MEM非必需氨基 酸（MEM non essential amino acid，Invitrogen)和 O.lmM 2-疏基乙醇（2-Mercaptoethanol，和光）的GMEM(Invitrogen))。次日（第1天），將培養(yǎng)基替換為含有0 ? lyM LDN193189、0.5yM A83-01、2yM嘌嗎啡胺（和光）和100ng/mL FGF8(和光）的基本培養(yǎng)基八。2 天后(第3天），將培養(yǎng)基替換為含有0. lyM LDN193189、0.5yM A83-01、2yM嘌嗎啡胺、100ng/ mL FGF8和3yM CHIR99021(和光）的基本培養(yǎng)基A3天后(第7天），將培養(yǎng)基替換為含有O.ly M LDN193189和3yM CHIR99021的基本培養(yǎng)基A。以后每天進(jìn)行一次培養(yǎng)基替換。此外，將上 述作為包被劑的層粘連蛋白511E8置換為基質(zhì)膠(BD)、CELLstart( Invitrogen)或?qū)诱尺B蛋 白111E8并進(jìn)行12天同樣的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果，雖然使用任一包被劑進(jìn)行均得到了 PSA-NCAM陽(yáng)性細(xì) 胞和Cor in陽(yáng)性細(xì)胞，但是，使用了層粘連蛋白511E8時(shí)，未分化細(xì)胞(Tra-1 -60陽(yáng)性細(xì)胞）的 殘留少，Corin陽(yáng)性細(xì)胞的含有率最尚（圖2)。確認(rèn)到，通過(guò)利用層粘連蛋白511E8包被進(jìn)行 貼壁培養(yǎng)，能夠一次性操作比進(jìn)行懸浮培養(yǎng)更多的細(xì)胞，期望的細(xì)胞的含有率也變高。以下 使用層粘連蛋白511E8作為包被劑。
[0179] 抗Cor in抗體通過(guò)以下的方法來(lái)制作。首先，將長(zhǎng)尾獼猴Corin基因中編碼一部分 (79-453氨基酸)胞外區(qū)域的基因序列導(dǎo)入至293E細(xì)胞，表達(dá)Corin蛋白質(zhì)的胞外區(qū)域片段 并收集。用收集的蛋白質(zhì)對(duì)小鼠進(jìn)行免疫后，取出淋巴細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞融合。從經(jīng)融合 的細(xì)胞集團(tuán)選擇與Corin具有反應(yīng)性的克隆。使用該克隆的培養(yǎng)上清作為抗Corin單克隆抗 體。
[0180] 在含有〇.1虛LDN193189和3虛CHIR99021的基本培養(yǎng)基A中培養(yǎng)5天后（第12天）， 使用TrypLE CTS使細(xì)胞解離，懸浮于含有2%FBS、10yM Y-27632(和光）、20mM D-glucose (D-葡萄糖）和50μg/ml青霉素/鏈霉素的、不含Ca2+Mg2+的HBSS(Ca 2+Mg2+-free HBSS， Invitrogen)。添加上述抗0〇1'；[11抗體，在4<€溫育20分鐘，使用?40341^311030)進(jìn)行分選，收 集Corin陽(yáng)性細(xì)胞。
[0181 ] 將收集的0〇1'；[11陽(yáng)性細(xì)胞移入包被1^口1(11^6的96孔板(1^口1(111代-(303七96￥611 plate，N0F公司），20000個(gè)/孔，使用基本培養(yǎng)基B(添加了不含維生素 A的B27添加劑 (B27Supplement without vitamin A，Invitrogen)、20ng/mL BDNF、10ng/mL GDNF、200mM 抗壞血酸和0 ? 4mM dbcAMP(Sigma)的Neurobasal培養(yǎng)基（Invitrogen))進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。此 時(shí)，最初的培養(yǎng)基使用添加有30yM的Y-27632的培養(yǎng)基，在3天一次每次半量替換時(shí)，使用未 添加 Y-27632的培養(yǎng)基。進(jìn)行了分選開始16天后(第28天）、或、進(jìn)一步繼續(xù)懸浮培養(yǎng)14天(第 42天）的細(xì)胞是否適合于移植的研究。此時(shí)，對(duì)于培養(yǎng)基，3天一次每次半量替換。將以上的 培養(yǎng)方法的計(jì)劃示于圖1。
[0182]另一方面，作為對(duì)照，第12天未以Corin進(jìn)行分選，同樣地進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。
[0183] 分選天數(shù)的研究
[0184] 將通過(guò)上述方法由iPS細(xì)胞(836B3)得到的各分化誘導(dǎo)時(shí)期的細(xì)胞的情形示于圖 3。此外，將在第12天未進(jìn)行分選的、第28天得到的細(xì)胞團(tuán)移入包被有多聚-L-鳥氨酸、纖維 連接蛋白和層粘連蛋白的盤，將用基本培養(yǎng)基B持續(xù)培養(yǎng)14天時(shí)(第42天）的Corin、聚唾液 酸化(PSA)-NCAM和Tra-1-60各陽(yáng)性細(xì)胞的含有率示于圖4。本分化誘導(dǎo)方法中，從第7天開 始，作為神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記的PSA-NCAM陽(yáng)性細(xì)胞的含有率增加，在第12天左右占大多數(shù)。作為底 板標(biāo)記的Corin陽(yáng)性細(xì)胞在第10天出現(xiàn)，第21天至第28達(dá)到峰值。該傾向在使用404C2時(shí)也 同樣。因此，提示為了分選獲得Corin陽(yáng)性細(xì)胞，在第10天以后進(jìn)行是優(yōu)選的。
[0185] 接下來(lái)，利用定量PCR對(duì)至第 12天之前的0ct4、Nanog、Soxl、Soxl7、Brachyury、 hGSC等的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，將經(jīng)時(shí)變化示于圖5A。確認(rèn)到S0X1從早期開始表達(dá)，以后其維持表 達(dá)。確認(rèn)到作為未分化標(biāo)記的0ct4、Nanog的表達(dá)減少。作為中胚層標(biāo)記的Brachyury在短暫 性表達(dá)增加后減少。作為內(nèi)胚層標(biāo)記的S0X17-直為低表達(dá)。另一方面，將在第12天未進(jìn)行 分選的、第28天得到的細(xì)胞團(tuán)移入包被有多聚-L-鳥氨酸、纖維連接蛋白和層粘連蛋白的 盤，對(duì)用基本培養(yǎng)基13繼續(xù)培養(yǎng)14天時(shí)（第42天)0(^4、]\^卩2&13、1^]1?1&、￡111、1'1111'1'1、1'11和?(《&2 的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，將經(jīng)時(shí)變化示于圖5B。確認(rèn)到上述標(biāo)記中除了 TH以外的標(biāo)記在第12天其 表達(dá)量大體達(dá)到平穩(wěn)期。該傾向在使用404C2時(shí)也同樣。
[0186] 將未分選時(shí)的第42天的細(xì)胞針對(duì)TH(產(chǎn)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記）、Foxa2和Nurrl (均 為中腦標(biāo)記)進(jìn)行免疫染色，結(jié)果，40%為TH陽(yáng)性，與Foxa2和Nurrl共表達(dá)。此外還確認(rèn)到， TH陽(yáng)性細(xì)胞還共表達(dá)了作為其他產(chǎn)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記的AADC、Pitx3和Girk2(圖6)。 [0187] 以Corin為指標(biāo)的分選的效果
[0188] 如上所述，通過(guò)PCR對(duì)第12天的分選之后的細(xì)胞中各標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定（圖 7A)。其結(jié)果確認(rèn)到，第12天-Corin陽(yáng)性細(xì)胞中，與未分選的細(xì)胞相比，Corin當(dāng)然高，中腦標(biāo) 記Lmxla和Enl、以及底板標(biāo)記Foxa2高。另一方面，確認(rèn)到后腦標(biāo)記Gbx2和前腦標(biāo)記Six3與 未分選的細(xì)胞相比低。關(guān)于404C2也確認(rèn)到同樣的傾向。通過(guò)包羅性表達(dá)分析對(duì)第12天進(jìn)行 分選的情況和未分選的情況進(jìn)行比較，結(jié)果確認(rèn)到，吻側(cè)標(biāo)記Pax6、尾側(cè)標(biāo)記Foxa2、早期神 經(jīng)標(biāo)記Neurog2、終止分裂的神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記NEFM(圖中未顯示）和非神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記DLK1和 CYP1B1在未分選細(xì)胞中表達(dá)高（圖7B)。進(jìn)而，進(jìn)行免疫染色時(shí)確認(rèn)到，Corin陽(yáng)性細(xì)胞中， Lmxla和 Foxa2 共陽(yáng)性細(xì)胞的含有率變高（圖 8A和B:75.52±8.255%vs.47.37±6.624%)。 另一方面，確認(rèn)到在中腦/后腦邊界的吻側(cè)表達(dá)的0tx2陽(yáng)性和Lmxla陰性細(xì)胞在經(jīng)分選的細(xì) 胞中減少（圖8C)。關(guān)于0ct4和Nanog未分化標(biāo)記，未發(fā)現(xiàn)大的差異（圖8D)。
[0189] 接下來(lái)，在第21天分選之后的細(xì)胞中進(jìn)行同樣的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第21天分選則 Corin陽(yáng)性細(xì)胞的含有率高(45.47±47.61% (第21天)vs.18.97±15.49% (第12天）），未發(fā) 現(xiàn)Lmxla和Foxa2的表達(dá)量因?yàn)榈?1天的分選而變化（圖9A)。同樣地，在免疫染色中，第21天 的分選導(dǎo)致的Corin陽(yáng)性細(xì)胞中的Lmxla和Foxa2共陽(yáng)性細(xì)胞的含有率與未分選的細(xì)胞組相 比未發(fā)現(xiàn)顯著差異（圖9B和C)。
[0190] 由上述確認(rèn)到，與第21天相比，第12天的分選是優(yōu)選的。
[0191] 關(guān)于分選后的培養(yǎng)時(shí)間
[0192] 對(duì)于使用上述培養(yǎng)方法誘導(dǎo)的第28天和第42天的細(xì)胞，對(duì)第12天Corin陽(yáng)性細(xì)胞 的分選的有無(wú)所導(dǎo)致的產(chǎn)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的成熟化程度進(jìn)行研究。確認(rèn)到Corin陽(yáng)性細(xì)胞 與未分選的細(xì)胞相比，球體的大小在第28天和第42天小（圖10A和B)。在第28天和第42天進(jìn) 行免疫染色，結(jié)果任一情況下，第12天分選后Foxa2陽(yáng)性細(xì)胞均為70至75%的含有率，與未 分選的情況相比高（圖11A和B)。在第28天，Nurrl陽(yáng)性細(xì)胞和TH陽(yáng)性細(xì)胞分別為27.34土 5.511 %和2.098± 1.243%，在第42天，為 19.91 ±6.966%和42.04±4.481 %，TH陽(yáng)性細(xì)胞 的含有率在第42天時(shí)比第21天變高。進(jìn)而，在第42天，使用HPLC對(duì)由于高氯化鉀刺激而釋放 至培養(yǎng)基的多巴胺(DA)、3,4-二羥基苯乙酸(D0PAC)和血清素（5-HT)進(jìn)行定量，結(jié)果確認(rèn) 到，與未進(jìn)行Corin分選的情況相比，進(jìn)行了Corin分選的細(xì)胞中DA和D0PAC的釋放量明顯多 (圖 11C)。
[0193] 接下來(lái)，對(duì)在第12天進(jìn)行了 Corin分選的細(xì)胞或未進(jìn)行分選的細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)， 在第28天或第42天分別將4X105個(gè)懸浮于2iU(生理鹽水），使用22號(hào)（gauge)的注射針給藥 至帕金森病模型大鼠（6-OHDA給藥大鼠）大腦的紋狀體，觀察16周后移植片的情形（圖12A)。 首先，對(duì)使用了第28天細(xì)胞時(shí)移植片的大小進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果確認(rèn)到，進(jìn)行了Corin陽(yáng)性細(xì)胞 的分選的細(xì)胞時(shí)，移植片的大小大體一定(8.5~1.5mm 3)(圖12B)，未進(jìn)行Corin分選時(shí)，為 88.4~0.5mm3，偏差大，平均值為34.96 ± 37.52mm3(無(wú)分選)和3.45 ± 2.932mm3(有分選），發(fā) 現(xiàn)有顯著差異（圖12B)。進(jìn)而，對(duì)在第12天進(jìn)行了 Corin分選的細(xì)胞或未進(jìn)行分選的細(xì)胞進(jìn) 行懸浮培養(yǎng)7天后(第19天），同樣地對(duì)帕金森病模型大鼠給藥，結(jié)果，分選組中移植片的大 小顯著?。▓D12D)。此外，對(duì)移植片中Ki67陽(yáng)性細(xì)胞的比例進(jìn)行定量，結(jié)果確認(rèn)到，不管有無(wú) 分選，均為低至1%以下的值，但在進(jìn)行了Corin分選的細(xì)胞中比例明顯低（圖12E)。另一方 面，第42天時(shí)，不管有無(wú)分選，移植片的大小均為1mm 3以下（圖12C)，未確認(rèn)到Ki67陽(yáng)性細(xì) 胞。
[0194] 接下來(lái)，對(duì)由于因左右多巴胺濃度的不均衡引起的苯異丙胺誘導(dǎo)導(dǎo)致的回巢進(jìn)行 研究，結(jié)果，用在第12天對(duì)Corin陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分選的細(xì)胞(第28天)和未分選的細(xì)胞(第28 天)給藥的組與未用細(xì)胞給藥的組(僅介質(zhì)）相比，回巢數(shù)均顯著減少。此外，細(xì)胞給藥后第 16周時(shí)，因分選的有無(wú)導(dǎo)致的行動(dòng)的變化沒有差別（圖13A)。這里，對(duì)移植片中TH陽(yáng)性細(xì)胞 進(jìn)行觀察，結(jié)果確認(rèn)到，移植了經(jīng)Corin分選的細(xì)胞時(shí)，TH陽(yáng)性細(xì)胞顯著殘留（圖13B和C、 6747±2341細(xì)胞/移植片（cells/graft)(有分選)vs.3436±2384細(xì)胞/移植片（無(wú)分選））。 此時(shí)單位NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(全神經(jīng)細(xì)胞）的TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、或單位hNc陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(全部存活 細(xì)胞）的TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也同樣地，在進(jìn)行了分選時(shí)顯著高（圖14A或B)。進(jìn)而，確認(rèn)到其他產(chǎn) 多巴胺細(xì)胞標(biāo)記(F〇Xa2、N Urrl和Pitx3)也共表達(dá)。作為黑質(zhì)致密部的A9產(chǎn)多巴胺細(xì)胞標(biāo)記 的Girk2也有約半數(shù)為共陽(yáng)性（圖14C)。此外，對(duì)血清素細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行觀察，結(jié)果，任一情 況下含有率均低（圖15A和B)。
[0195] 另一方面，同樣用在第12天對(duì)Corin陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行了分選的和未分選的細(xì)胞(第42 天)給藥，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)因分選的有無(wú)導(dǎo)致的對(duì)于異?；爻驳母纳频娘@著差異（圖13D)。進(jìn)而， 移植片中TH陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和濃度也同樣未發(fā)現(xiàn)顯著差異（圖13E和F)。與這些結(jié)果相關(guān) 聯(lián)，相對(duì)于在第28天移植中為6747 ± 2341細(xì)胞/移植片（圖13B)，生存的TH陽(yáng)性細(xì)胞的平均 值在第42天移植中為1431 ± 753.7細(xì)胞/移植片（圖13E )，發(fā)現(xiàn)了第28天時(shí)植活細(xì)胞數(shù)多的 傾向。
[0196] 接下來(lái)，通過(guò)微陣列分析，分別對(duì)在第12天進(jìn)行分選的第28天的細(xì)胞與未進(jìn)行分 選的第28天的細(xì)胞、以及在第12天進(jìn)行分選的第28天的細(xì)胞與在第12天進(jìn)行分選的第42天 的細(xì)胞進(jìn)行比較(圖16A)。確認(rèn)到，第28天的細(xì)胞中，未進(jìn)行分選時(shí)，作為前腦標(biāo)記的PAX6的 表達(dá)高。另一方面，確認(rèn)到，在進(jìn)行了分選時(shí)ALCAM的表達(dá)高。接下來(lái)，第28天與第42天的細(xì) 胞的比較中，確認(rèn)到第28天的細(xì)胞中SHH、WNT5A和C0RIN的表達(dá)高。另一方面，確認(rèn)到TH在第 42天的細(xì)胞中表達(dá)高。
[0197] 進(jìn)而，對(duì)于迄今為止針對(duì)帕金森病臨床使用的胎兒腹側(cè)中腦細(xì)胞（7周齡）與對(duì) Corin陽(yáng)性細(xì)胞在第12天進(jìn)行了分選的第28天和第42天的細(xì)胞進(jìn)行比較。與第28天的細(xì)胞 相比，作為產(chǎn)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記的TH和PITX3(圖中未顯示)在胎兒腹側(cè)中腦細(xì)胞高表 達(dá)。作為血清素能神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記的TPH2也在胎兒腹側(cè)中腦細(xì)胞中高表達(dá)（圖16B)。進(jìn)行階 梯聚類分析時(shí)，確認(rèn)到胎兒中腦細(xì)胞與第42天的細(xì)胞近似（圖16C)。第28天的細(xì)胞中，軸突 誘導(dǎo)相關(guān)基因（SP0N1和SLIT2)表達(dá)，因而提示其為發(fā)生階段比胎兒腹側(cè)中腦細(xì)胞更早的細(xì) 胞。
[0198] 根據(jù)以上結(jié)果，提示:通過(guò)使用對(duì)Corin陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行選擇后懸浮培養(yǎng)16天的細(xì)胞 (第28天），能夠增加移植片的增殖、產(chǎn)多巴胺細(xì)胞的植活，適合作為用于治療帕金森病的細(xì) 胞。
[0199] 實(shí)施例2
[0200] 細(xì)胞培養(yǎng)
[0201]使用TrypLE CTS(Life Technologies)將ES細(xì)胞(Kh-ESl)解離，全部移入另外準(zhǔn) 備的以層粘連蛋白511E8包被的6孔板，用含有10yM Y-27632、0.1yM LDN193189、0.5yM A83-01的基本培養(yǎng)基A(含有8%KSR、lmM丙酮酸鈉、0.1 mM MEM非必須氨基酸和0.1 mM 2-巰 基乙醇的GMEM)培養(yǎng)。培養(yǎng)開始1天后(第1天），將培養(yǎng)基替換為含有O.lyM LDN193189、0.5y M A83-01、2yM嘌嗎啡胺和100ng/mL FGF8的基本培養(yǎng)基A。培養(yǎng)開始3天后(第3天），將培養(yǎng) 基替換為含有O.lyM LDN193189、0.5yM A83-01、2yM嘌嗎啡胺、100ng/mL FGF8和3yM CHIR99021的基本培養(yǎng)基A。培養(yǎng)開始7天后(第7天），將培養(yǎng)基替換為含有O.lyM LDN193189 和3yM CHIR99021的基本培養(yǎng)基A。第12天(培養(yǎng)開始12天后），將培養(yǎng)基替換為添加有不含 維生素 A的B27添加劑、2mM L-谷氨酰胺、20ng/mL重組人(rh) BDNF、10ng/mL rh⑶NF、400yM dbcAMP(西格碼)和200iiM抗壞血酸的Neurobasal培養(yǎng)基（Invitrogen)。除非指定，否則培養(yǎng) 基替換按前一天的組成每天進(jìn)行。
[0202] dayl4(培養(yǎng)開始14天后），使用TrypLE CTS使細(xì)胞解離，使用抗Lrtml抗體 (W02013/015457)以FACS進(jìn)行分選，收集Lrtml陽(yáng)性細(xì)胞。
[0203] 將收集的Lrtml 陽(yáng)性細(xì)胞移入Lipidure-coat 96孔板(Thermo)，20000個(gè)/well，使 用添加有30yM Y-27632、不含維生素 A的B27添加劑、2mM L-谷氨酰胺、20ng/mL重組人(rh) BDNF、1 Ong/mL rh⑶NF、400處 dbcAMP、1 %KSR、青霉素/鏈霉素(Gibco)和200yM抗壞血酸的 Neurobasal培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。之后，將培養(yǎng)基替換為不含Y-27632的培養(yǎng)基，3天一次、 每次半量。分選后7天后(第21天)或21天后(第35天）用于各種實(shí)驗(yàn)。
[0204] 以Lrtml為指標(biāo)的分選的效果(免疫染色)
[0205] 通過(guò)免疫染色對(duì)第21天時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行研究，結(jié)果，F(xiàn)oxa2陽(yáng)性細(xì)胞為87.4%，Lmxla 陽(yáng)性細(xì)胞為87.5%，F(xiàn)oxa2和Lmxla陽(yáng)性細(xì)胞為82.7% (圖17A)。另一方面，根據(jù)第35天時(shí)的 分選的有無(wú)進(jìn)行比較，結(jié)果，F(xiàn)oxa2、Nurrl和TH陽(yáng)性細(xì)胞由于以Lrtml進(jìn)行分選而其含有率 變高（圖17B)。
[0206] 以Lrtml為指標(biāo)的分選的效果(細(xì)胞移植)
[0207]以Lrtml分選的次日（第15天），對(duì)10周齡SD大鼠腦內(nèi)給藥10~15 X 104細(xì)胞/束 (cells/tract)，在4周后進(jìn)行觀察。確認(rèn)到移植細(xì)胞來(lái)源(人來(lái)源）的？(《32、1'11、1'1111'1'1陽(yáng)性 細(xì)胞的植活(圖18)。
[0208] 實(shí)施例3
[0209] 細(xì)胞培養(yǎng)
[0210] 使用TrypLE CTS(Life Technologies)將ES細(xì)胞(Kh-ESl)解離，將4X105個(gè)移入 另外準(zhǔn)備的以層粘連蛋白511E8包被的6孔板，用含有10yM Y-27632的StemFit培養(yǎng)基(味之 素)培養(yǎng)。4天后，將培養(yǎng)基替換為含有O.lyM LDN193189、0.5yM A83-01的上述基本培養(yǎng)基A (第〇天）。培養(yǎng)開始1天后(第1天），將培養(yǎng)基替換為含有O.lyM LDN193189、0.5yM A83-01、2 yM嘌嗎啡胺和100ng/mL FGF8的基本培養(yǎng)基A。培養(yǎng)開始3天后(第3天），將培養(yǎng)基替換為含 有0.1處 LDN193189、0.5yM A83-0U2處嘌嗎啡胺、100ng/mL FGF8和3處 CHIR99021 的基本 培養(yǎng)基A。培養(yǎng)開始7天后(第7天），將培養(yǎng)基替換為含有O.lyM LDN193189和3yM CHIR99021 的基本培養(yǎng)基A。第14天(培養(yǎng)開始14天后）分選或?qū)⑴囵B(yǎng)基替換為添加有不含維生素 A的 B27添加劑、2mM L-谷氨酰胺、20ng/mL重組人（rh)BDNF、10ng/mL rhGDNF、400yM dbcAMP (Sigma)和200iiM抗壞血酸的Neurobasal培養(yǎng)基（Invitrogen)。除非指定，否則培養(yǎng)基替換 按前一天的組成每天進(jìn)行。
[0211] 鍾
[0212] 用上述方法培養(yǎng)，在第14天(培養(yǎng)開始14天后)或第21天(培養(yǎng)開始21天后），使用 TrypLE CTS將細(xì)胞解離，使用抗Lrtml抗體(W02013/015457)以FACS進(jìn)行分選，收集Lrtml陽(yáng) 性細(xì)胞。
[0213] 將收集的Lrtml陽(yáng)性細(xì)胞移入包被Lipidure的96孔板（Thermo)，2X104個(gè)/孔，使 用添加有30yM Y-27632、不含維生素 A的B27添加劑、2mM L-谷氨酰胺、20ng/mL重組人(rh) BDNF、10ng/mL rh⑶NF、400處 dbcAMP、1 %KSR、青霉素/鏈霉素(Gibco)和200yM抗壞血酸的 Neurobasal培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。之后，培養(yǎng)基替換為不含Y-27632的培養(yǎng)基，3天一次、每 次半量。分選后7天后或14天后用于各種實(shí)驗(yàn)。
[0214] 以Lrtml為指標(biāo)的分選的效果(免疫染色)
[0215] 第14天-7天(第14天分選、培養(yǎng)7天）、第14天-14天(第14天分選、培養(yǎng)14天)和第21 天-7天(第21天分選、培養(yǎng)7天)時(shí)利用免疫染色(F 〇Xa2、Nurrl、TH)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行研究，結(jié)果確 認(rèn)到，F(xiàn)oxa2陽(yáng)性細(xì)胞的含有率在任一條件下均為90 %以上，Nurr 1和TH陽(yáng)性細(xì)胞含有率在 第14天-7天、第14天-14天和第21天-7天分別為13.1 %、24.0%和10.2% (圖19)。因此，第14 天-14天時(shí)Foxa2、Nurrl和TH陽(yáng)性細(xì)胞的含有率最高。
[0216] 以上結(jié)果表明，關(guān)于分選的時(shí)期，與分化誘導(dǎo)開始第21天相比，第14天較好，關(guān)于 分選后的培養(yǎng)時(shí)間，與7天相比，14天較好。
[0217] 產(chǎn)業(yè)可利用性
[0218]本發(fā)明對(duì)再生醫(yī)療、尤其是帕金森病的治療是有用的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種由多能干細(xì)胞制造產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞的方法，包括下面的工序： 工序⑴，在含有選自由BMP抑制劑、TGF0抑制劑、SHH信號(hào)激活劑、FGF8和GSK30抑制劑 組成的組的試劑的培養(yǎng)液中，將多能干細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)； 工序（ii)，使用結(jié)合于Corin的物質(zhì)和/或結(jié)合于Lrtml的物質(zhì)從所述工序（i)中得到的 細(xì)胞收集Corin和/或Lrtml陽(yáng)性細(xì)胞；以及 工序（iii)，將所述工序（ii)中得到的細(xì)胞在含有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮 培養(yǎng)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述工序(i)包括下面的工序： 工序(a)，在含有BMP抑制劑和TGF0抑制劑的培養(yǎng)液中，將多能干細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上 進(jìn)行貼壁培養(yǎng)； 工序(b)，在含有BMP抑制劑、TGF0抑制劑、SHH信號(hào)激活劑和FGF8的培養(yǎng)液中，將所述工 序(a)中得到的細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)； 工序(c)，在含有BMP抑制劑、TGF0抑制劑、SHH信號(hào)激活劑、FGF8和GSK30抑制劑的培養(yǎng) 液中，將所述工序(b)中得到的細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng);以及 工序(d)，在含有BMP抑制劑和GSK30抑制劑的培養(yǎng)液中，將所述工序(c)中得到的細(xì)胞 在細(xì)胞外基質(zhì)上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為K)NF和⑶NF。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的方法，所述工序（iii)中使用的培養(yǎng)液進(jìn)一步含 有B27添加劑、抗壞血酸和二丁酰環(huán)磷酸腺苷。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的方法，所述工序(i)進(jìn)行至少10天。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的方法，所述工序(i)進(jìn)行12天至21天。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的方法，所述工序(iii)進(jìn)行至少7天。8. 根據(jù)權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的方法，所述工序(iii)進(jìn)行14天至30天。9. 根據(jù)權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的方法，所述細(xì)胞外基質(zhì)為層粘連蛋白或其片段。10. 根據(jù)權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的方法，所述細(xì)胞外基質(zhì)為層粘連蛋白511E8。11. 根據(jù)權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的方法，結(jié)合于Cor in的物質(zhì)或結(jié)合于Lrtml的物 質(zhì)為結(jié)合于Corin或Lrtml的抗體或適配體。12. -種產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞，其為通過(guò)權(quán)利要求1~11中任一項(xiàng)所述的方法得到 的。13. -種帕金森病治療劑，其含有通過(guò)權(quán)利要求1~11中任一項(xiàng)所述的方法得到的產(chǎn)多 巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞。14. 一種用于由多能干細(xì)胞制作產(chǎn)多巴胺神經(jīng)前體細(xì)胞的試劑盒，其包含BMP抑制劑、 TGFI3抑制劑、SHH信號(hào)激活劑、FGF8、GSK3樹φ制劑、細(xì)胞外基質(zhì)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其進(jìn)一步包含抗Corin抗體和/或抗Lrtml抗體。16. 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的試劑盒，BMP抑制劑為L(zhǎng)DN193189，TGF0抑制劑為A83-01，SHH信號(hào)激活劑為嘌嗎啡胺，GSK30抑制劑為CHIR99021，細(xì)胞外基質(zhì)為層粘連蛋白 511E8，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為BDNF和⑶NF。
【文檔編號(hào)】A61P25/16GK105849255SQ201480059803
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2014年9月4日
【發(fā)明人】高橋淳, 土井大輔, 佐俁文平, 關(guān)口清俊, 尾野雄, 尾野雄一
【申請(qǐng)人】國(guó)立大學(xué)法人京都大學(xué), 衛(wèi)材R&D管理有限公司