附加有果糖的糖質的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供能夠利用β?呋喃果糖苷酶高效且簡便地制造附加有果糖的糖質的制造方法。一種附加有果糖的糖質的制造方法，具有以下工序：使在末端含有果糖殘基的糖質及受體底物與以1個多肽形式表達用于使蛋白在細胞表面表達的錨定蛋白和β?呋喃果糖苷酶的大腸桿菌、含有進行該表達的大腸桿菌的死菌的組合物或由進行該表達的大腸桿菌獲得且含有β?呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的多肽接觸。
【專利說明】
附加有果糖的糖質的制造方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及附加有果糖的糖質的制造方法，尤其涉及:可利用呋喃果糖苷酶高 效地制造附加有果糖的糖質的制造方法，可用于該制造方法的大腸桿菌、組合物及多肽，以 及利用該制造方法制造的附加有果糖的糖質。
【背景技術】
[0002] 呋喃果糖苷酶是識別在末端含有果糖殘基的糖質中的果糖并將其水解的酶。0-呋喃果糖苷酶中，還存在具有將因水解而生成的果糖轉移給受體底物的活性的類型。即，利 用具有該活性的呋喃果糖苷酶，能夠通過將果糖轉移給糖質、糖質以外的物質來制造附 加有果糖的糖質。
[0003] 作為利用呋喃果糖苷酶進行的、制造附加有果糖的糖質的方法，迄今為止已經 公開了 ：例如，使糖底物與固定有保有呋喃果糖苷酶的曲霉菌菌絲的載體接觸的方法(專 利文獻1)，使用來自運動發(fā)酵單胞菌的果聚糖蔗糖酶或菌體外轉化酶的方法(專利文獻2)。
[0004] 現(xiàn)有技術文獻
[0005] 專利文獻
[0006] 專利文獻1:日本特開2013-252056號公報 [0007] 專利文獻2:日本特開2006-67958號公報

【發(fā)明內容】

[0008] 發(fā)明要解決的課題
[0009] 但是，專利文獻1所述的方法是將原本具有呋喃果糖苷酶的曲霉菌的菌絲固定 于娃藻土、珠光體這樣的載體來制造寡糖的方法，使用外源的0-咲喃果糖苷酶簡便且高效 地制造寡糖并非易事。這是由于，利用該方法的情況下，在導入外源的呋喃果糖苷酶而制 造寡糖時，為了準確地進行評價必須預先去除曲霉菌的內源性呋喃果糖苷酶活性，從而 缺乏操作容易性。專利文獻2所述的方法也是使用來自運動發(fā)酵單胞菌的e-呋喃果糖苷酶 制造果糖糖苷的方法，并不是能夠不受呋喃果糖苷酶的來源限制地制造果糖糖苷的方 法。
[0010] 本發(fā)明是為了解決這樣的問題而作出的，目的在于，通過在由于原本不具有呋 喃果糖苷酶因而導入的呋喃果糖苷酶的活性評價容易、且轉化和培養(yǎng)操作也容易的大腸 桿菌中表達外源的呋喃果糖苷酶，從而提供:能夠不受呋喃果糖苷酶的來源限制地高 效且簡便地制造附加有果糖的糖質的制造方法，可用于該制造方法的大腸桿菌、組合物及 多肽，以及利用該制造方法制造的附加有果糖的糖質。
[0011] 用于解決課題的方法
[0012] 本發(fā)明人等進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)，通過使用以1個多肽形式表達用于使蛋白 在細胞表面表達的錨定蛋白和呋喃果糖苷酶的大腸桿菌，從而能夠高效且簡便地制造附 加有果糖的糖質，并完成了下述的各發(fā)明。
[0013] (1)本發(fā)明的附加有果糖的糖質的制造方法具有以下工序:使在末端含有果糖殘 基的糖質及受體底物與以1個多肽形式表達下述(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌、含有進行 該表達的大腸桿菌的死菌的組合物、或由進行該表達的大腸桿菌獲得且含有下述(b)核酸 所編碼的氨基酸序列的多肽接觸；（a)編碼如下氨基酸序列的核酸：與序列號6所示的PgsA 蛋白的氨基酸序列或序列號34所示的CapA蛋白的氨基酸序列中的任一者具有45 %以上的 同源性的氨基酸序列，（b)編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的核酸。
[0014] (2)本發(fā)明的大腸桿菌為按照能夠以1個多肽形式表達下述(a)核酸及(b)核酸的 方式含有(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌或以1個多肽形式表達下述(a)核酸及(b)核酸的大 腸桿菌；（a)編碼如下氨基酸序列的核酸:與序列號6所示的PgsA蛋白的氨基酸序列或序列 號34所示的CapA蛋白的氨基酸序列中的任一者具有45%以上的同源性的氨基酸序列，（b) 編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的核酸。
[0015] (3)本發(fā)明的組合物為含有以1個多肽形式表達下述(a)核酸及(b)核酸的大腸桿 菌的死菌的組合物；（a)編碼如下氨基酸序列的核酸:與序列號6所示的PgsA蛋白的氨基酸 序列或序列號34所示的CapA蛋白的氨基酸序列中的任一者具有45%以上的同源性的氨基 酸序列，（b)編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的核酸。
[0016] (4)本發(fā)明的多肽為由以1個多肽形式表達下述(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌獲 得且含有下述(b)核酸所編碼的氨基酸序列的多肽；（a)編碼如下氨基酸序列的核酸:與序 列號6所示的PgsA蛋白的氨基酸序列或序列號34所示的CapA蛋白的氨基酸序列中的任一者 具有45%以上的同源性的氨基酸序列，（b)編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的核酸。
[0017] (5)本發(fā)明的附加有果糖的糖質為利用（1)所述的制造方法制造的附加有果糖的 糖質。
[0018]發(fā)明的效果
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的附加有果糖的糖質的制造方法或可用于該制造方法的大腸桿菌、組 合物或多肽，能夠使用來自各種生物的呋喃果糖苷酶簡便且高效地制造附加有果糖的糖 質。
【附圖說明】
[0020] 圖1是示意性示出本發(fā)明的"以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌" 的一個實施方式的圖。
[0021] 圖2是示出使重組枯草芽孢桿菌與45%蔗糖溶液接觸而獲得的反應液中的糖組成 的HPLC譜圖，所述重組枯草芽孢桿菌是利用pHT43-pg SA-indica重組載體或pHT43質粒轉化 而得的。
[0022] 圖3是示出使重組巨大芽孢桿菌與45%蔗糖溶液接觸而獲得的反應液中的糖組成 的HPLC譜圖，所述重組巨大芽孢桿菌是利用pWH1520-capA_opti-indica重組載體或 PWH1520質粒轉化而得的。
[0023] 圖4是示出使重組大腸桿菌與作為受體底物的氫醌、作為供體底物的蔗糖接觸而 獲得的反應液(樣品反應液)及各種對照反應液(對照反應液No. 1~3)中的物質組成的HPLC 譜圖，所述重組大腸桿菌是利用P⑶F-pgsA-indica重組載體轉化而得的。
【具體實施方式】
[0024] 以下對本發(fā)明的附加有果糖的糖質的制造方法、可用于該制造方法的大腸桿菌、 組合物及多肽、以及利用該制造方法制造的附加有果糖的糖質進行詳細說明。
[0025] 在本發(fā)明中，"糖質"除了Cn(H20)m*示的化合物以外還包括多元醇的醛、酮衍生 物、與它們類似的衍生物、縮合物。即，本發(fā)明的"糖質"中除了單糖、寡糖、多糖以外，還包括 它們與蛋白質、脂質等進行共價結合而得的復合脂質，單糖、寡糖的還原基團與醇、酚、皂 甙、色素等配基結合而成的糖苷(巖波生物學事典第4版;巖波書店發(fā)行，2005年）。此外，本 發(fā)明的"糖質"有時可以與"糖"、"碳水化合物"互換使用。
[0026] 在本發(fā)明中，"附加有果糖的糖質"是指含有1個以上的果糖殘基作為構成物質的 化合物。作為本發(fā)明的"附加有果糖的糖質"，具體可以列舉例如果糖與果糖以外的單糖結 合而成的二糖、蔗果四糖或蔗果三糖等含有果糖殘基的寡糖、含有果糖殘基的多糖以及含 有果糖殘基的糖醇、果糖與糖以外的物質(配基)結合而成的糖苷等。
[0027]需要說明的是，在本發(fā)明中，寡糖是指3~十幾個程度的單糖結合而成的糖，可以 與"低聚糖"、"寡聚糖"互換使用。此外，糖苷一般是指糖與糖以外的物質(配基)結合而成的 有機化合物（百科事典My Pedia;hitachi solutions business公司，2010年5月），具體而 言，是指糖的半縮醛性羥基或半縮酮性羥基被糖以外物質的原子或反應基團取代而成的化 合物(生化學事典第4版;東京化學同人公司發(fā)行，2007年12月）。本發(fā)明的糖苷既可以是天 然存在的也可以是人工合成的，除了〇-苷以外還包括N-苷、S-苷、C-苷。
[0028] 本發(fā)明的附加有果糖的糖質的制造方法具有使在末端含有果糖殘基的糖質及受 體底物與以下A)~C)中的任一者接觸的工序，
[0029] A)以1個多肽形式表達下述(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌、
[0030] (a)編碼以下氨基酸序列（以下有時稱為"規(guī)定的氨基酸序列"。）的核酸:與序列號 6所示的PgsA蛋白的氨基酸序列或序列號34所示的CapA蛋白的氨基酸序列中的任一者具有 45%以上的同源性的氨基酸序列、
[0031] (b)編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的核酸、
[0032] B)含有上述以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌的死菌的組合物、
[0033] C)由上述以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌獲得且含有上述(b) 核酸所編碼的氨基酸序列的多肽。
[0034] 在此，將A)的"以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌"的一個實施方 式示意性示于圖1。本發(fā)明人等認為，如圖1所示，以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的 大腸桿菌的一個實施方式中，（a)核酸所編碼的、含有預定的氨基酸序列的蛋白質部分與大 腸桿菌的細胞膜結合，從而(b)核酸所編碼的呋喃果糖苷酶部分在大腸桿菌的細胞表面 表達。
[0035]需要說明的是，在本發(fā)明中，"核酸"是指多個核苷酸通過磷酸二酯鍵結合而成的 化合物，可以是脫氧核糖核酸(DNA)也可以是核糖核酸(RNA)。此外，在本發(fā)明中，"多肽"是 指多個氨基酸通過肽鍵結合而成的化合物，對其序列長度沒有限制，有時可以與蛋白質互 換使用。
[0036]在本發(fā)明中，"以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸"是指使上述(a)核酸所編碼 的氨基酸序列和上述(b)核酸所編碼的氨基酸序列表達為1條多肽。在此，對該1條多肽中 (a)核酸所編碼的氨基酸序列和(b)核酸所編碼的氨基酸序列的順序沒有限制，任一者可以 為氨基末端側，任一者可以為羧基末端側。此外，該1條多肽既可以僅含有(a)核酸所編碼的 氨基酸序列及(b)核酸所編碼的氨基酸序列，也可以在(a)核酸所編碼的氨基酸序列和(b) 核酸所編碼的氨基酸序列之間、這些氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端插入或附加1個 或多個其它氨基酸。
[0037] (a)的"與序列號6所示的PgsA蛋白的氨基酸序列或序列號34所示的CapA蛋白的氨 基酸序列中的任一者具有45%以上的同源性的氨基酸序列(預定的氨基酸序列)"是用于使 含有(b)核酸所編碼的氨基酸序列的呋喃果糖苷酶在大腸桿菌的細胞表面表達的錨定蛋 白（以下有時簡稱為"錨定蛋白"。）的氨基酸序列。在此，"序列號6所示的PgsA蛋白"是來自 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)的錨定蛋白，"序列號34所示的CapA蛋白"是來自巨大 芽胞桿菌(Bacillus megaterium)DSM319株的錨定蛋白。在本發(fā)明中，如后述實施例4所示， 可以將含有預定的氨基酸序列的蛋白質作為用于使呋喃果糖苷酶在大腸桿菌的細胞表 面表達的錨定蛋白來使用。
[0038] 在本發(fā)明中，預定的氨基酸序列和其以外的氨基酸序列的同源性可以按照常規(guī)方 法來確認，例如，可以使用?4514〇11^://?_.861101]16.開/1：0〇18/^8七3/)、基本局部比對搜 索工具（Basic local alignment search tool(BLAST) ；http：// www? ncbi .nlm.nih? gov ?)、位點特異性迭代BLAST(Position_Specific Iterated BLAST (PSI-BLAST) ;http://www.ncbi .nlm.nih.gov.)等程序來確認。需要說明的是，"同源性"是 指一致性，可以與"identity"互換使用。
[0039] 預定的氨基酸序列可以通過在序列號6或序列號34的氨基酸序列中在與序列號6 或序列號34的氨基酸序列的同源性不小于45%的范圍內缺失、置換、插入或附加1個或多個 氨基酸而獲得。此外，可以按照常規(guī)方法根據(jù)蛋白質信息資源（Pr〇te in Inf ormat ion Resource(PIR))、SWISS_PR0T、TrEMBL、蛋白質研究基金會（Protein Research Foundation (卩1^))、661^叩以叱81蛋白質數(shù)據(jù)庫）等氨基酸序列數(shù)據(jù)庫，使用？4514(11以？：// www.genome.JP/tools/fasta/)、基本局部比對搜索工具（BLAST ;http:// www.ncbi.nlm.nih.gov.)、位點特異性迭代BLAST(PSI-BLAST ;http:// www.ncbi .nlm.nih. gov.)等程序進行序列號6或序列號34的氨基酸序列的同源檢索而獲 得。
[0040] 在此，在本發(fā)明中，"在序列號6或序列號34的氨基酸序列中，在與序列號6或序列 號34的氨基酸序列的同源性不小于45%的范圍內缺失、置換、插入或附加 1個或多個氨基 酸"時的缺失、置換、插入或附加的氨基酸的個數(shù)可以列舉例如1~200個、1~180個、1~160 個、1~140個、1~120個、1~100個、1~80個，優(yōu)選1~60個、更優(yōu)選1~50個、進一步優(yōu)選1~ 40個、更進一步優(yōu)選1~30個。
[0041] 預定的氨基酸序列可以來自細菌、酵母、霉菌、植物等任意生物。在預定的氨基酸 序列中，作為與序列號6所示的PgsA蛋白的氨基酸序列具有45%以上的同源性的氨基酸序 列，可以列舉例如來自Bacillus tequiensis的錨定蛋白的氨基酸序列(美國國家生物技術 信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI)WP_024714260.1;同 源性96% )、來自萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)的錨定蛋白的氨基酸序列（NCBI WP_03326671.1;同源性86% )、來自暹邏芽孢桿菌(Bacillus siamensis)的錨定蛋白的氨 基酸序列（NCBI WP_016937733 . 1 ;同源性78% )、來自沙福芽孢桿菌（Bacillus sonorensis)的錨定蛋白的氨基酸序列(NCBI WP_006639316.1;同源性66% )等。
[0042]此外，作為預定的氨基酸序列中的、與序列號34所示的CapA蛋白的氨基酸序列具 有45%以上的同源性的氨基酸序列，可以列舉例如來自彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus) 的錨定蛋白的氨基酸序列（NCBI WP_025908233.1;同源性73%)、來自炭疽芽孢桿菌 (Bacillus anthracis)的錨定蛋白的氨基酸序列(NCBI WP_001253153.1;同源性53% )、來 自錯狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)的錨定蛋白的氨基酸序列(NCBI WP_001996162.1;同 源性53% )、來自內生芽胞桿菌（Bacillus endophyticus)的錨定蛋白的氨基酸序列 (NCBIWP_019393395 ? 1;同源性52% )、來自蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)的 錨定蛋白的氨基酸序列(NCBI WP_001170049.1;同源性51 % )、來自巨大芽孢桿菌的錨定蛋 白的氨基酸序列（NCBI WP_013082091.1;同源性51%)、來自地衣芽孢桿菌（Bacillus lichenifomis)的錨定蛋白的氨基酸序列(NCBI AGS77947.1;同源性47%)、來自沙福芽孢 桿菌（Bacillus safensis)的錨定蛋白的氨基酸序列（NCBI WP_024423669.1;同源性 47%)、來自短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)的錨定蛋白的氨基酸序列（NCBI WP_ 017360004.1;同源性47% )、來自同溫層芽孢桿菌(Bacillus stratosphericus)的錨定蛋 白的氨基酸序列(NCBI WP_007497516.1;同源性47% )、來自暹邏芽孢桿菌的錨定蛋白的氨 基酸序列（NCBI WP_016937733. 1 ;同源性47% )、來自死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis)的錨定蛋白的氨基酸序列(NCBI WP_010328824.1;同源性46%)、來自莫海 威芽孢桿菌(Bacillus mo javensis)的錨定蛋白的氨基酸序列(NCBI WP_010332115 ? 1;同 源性46%)等。
[0043] 本發(fā)明的"0-呋喃果糖苷酶"是具有如下活性的酶:識別在末端含有果糖殘基的糖 質中的果糖并將其水解的果糖水解活性、和將由水解而生成的果糖轉移給受體底物的果糖 轉移活性。本發(fā)明的"0-呋喃果糖苷酶"可以是來自酵母、霉菌、植物等生物的野生型的呋 喃果糖苷酶，也可以是含有對野生型的呋喃果糖苷酶的氨基酸序列導入1或2個以上的氨 基酸變異的氨基酸序列的呋喃果糖苷酶。需要說明的是，在本發(fā)明中，"0-呋喃果糖苷酶" 有時與"果糖基轉移酶"、"蔗糖酶"、"P-D-呋喃果糖苷酶"、"轉化酶"、"invertase"或 "invert in"互換使用。
[0044] 在此，在本發(fā)明中，"受體底物"是指可借助于呋喃果糖苷酶的果糖轉移活性，接 受果糖的轉移，附加于果糖的物質。此外，"供體底物"是指可借助于呋喃果糖苷酶的果糖 水解活性，接受果糖的水解，向受體底物提供果糖的物質。
[0045] 即，在本發(fā)明中，"在末端含有果糖殘基的糖質"是指供體底物。作為本發(fā)明的"在 末端含有果糖殘基的糖質"，具體可以列舉例如蔗糖等在末端含有果糖殘基的二糖、蔗果三 糖等在末端含有果糖殘基的暴糖、在末端含有果糖殘基的多糖以及在末端含有果糖殘基的 糖醇、在末端含有果糖殘基的糖苷等。
[0046] 此外，如后述實施例6(1)及(2)所示那樣，本發(fā)明的"受體底物"可以是單糖、二糖、 寡糖、糖苷等糖質，也可以是氫醌等糖質以外的物質。根據(jù)本發(fā)明的附加有果糖的糖質的制 造方法，例如若受體底物為單糖則可以制造二糖，若受體底物為二糖、寡糖，則可以制造寡 糖，若受體底物為糖以外的物質則可以制造糖苷。
[0047] 需要說明的是，在本發(fā)明的附加有果糖的糖質的制造方法中，"在末端含有果糖殘 基的糖質"和"受體底物"可以是同一物質也可以是不同物質。
[0048] 作為本發(fā)明的"0-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列"，具體可以列舉例如來自印度拜葉 林克氏菌印度亞種(Bei jerinckia indica subsp. indica)NBRC3744的咲喃果糖苷酶的 氨基酸序列（序列號2)、來自瘤狀伯克霍爾德菌STM815的呋喃果糖苷酶的氨基酸序列 (GenBank:ACC75109.1;序列號 18)、來自白曲霉(Aspergillus kawachii)IF04303的咲喃 果糖苷酶的氨基酸序列(GenBank:GAA88101.1;序列號22)等。
[0049] 在本發(fā)明中，編碼上述(a)的預定的氨基酸序列、或上述(b)的呋喃果糖苷酶的 氨基酸序列（以下總稱為"本發(fā)明的氨基酸序列"。）的核酸可以如下獲得:從表達含有本發(fā) 明的氨基酸序列的蛋白質的生物提取核酸，以該核酸為模板進行聚合酶鏈反應(PCR)，從而 獲得。此外，還可以以本發(fā)明的氨基酸序列為基礎，根據(jù)表示密碼子和氨基酸的對應關系的 公知的遺傳密碼確定核酸的序列后，使用市售的各種核酸合成機來合成。
[0050] 本發(fā)明的"大腸桿菌"（Escherichia coli)只要能夠以1個多肽形式表達上述(a) 核酸及(b)核酸則可以為任意菌株。
[0051] 本發(fā)明的"以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌"可以按照常規(guī)方法 將按照以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的方式設計的核酸導入大腸桿菌中而獲得。 作為這樣的方法，可以列舉例如后述實施例1(2)及實施例1(5)所示的方法。即，首先在1個 載體的啟動子序列和終止子序列之間插入(a)核酸及(b)核酸，獲得重組載體。此時，若使 (a)核酸和(b)核酸之間不含終止密碼子，則導入了重組載體的大腸桿菌能夠以1個多肽形 式表達(a)核酸及(b)核酸。然后，將獲得的重組載體導入大腸桿菌中并培養(yǎng)一定時間，可以 獲得以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌。
[0052]然后，上述B)的、本發(fā)明的"含有以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的大腸桿 菌的死菌的組合物"只要含有以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌的死菌即 可，對其形態(tài)沒有限制，例如，可以為粉末狀，也可以為液體狀。上述B)的組合物可以通過例 如將上述本發(fā)明的以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌溶菌、殺菌或滅菌而 獲得。在此，將大腸桿菌溶菌、殺菌或滅菌的方法可以列舉通常用于細菌的溶菌方法、殺菌 方法或滅菌方法，具體可以列舉例如將大腸桿菌懸浮于高滲液的方法，對大腸桿菌進行破 碎、磨碎、凍融、超聲波處理或熱處理的方法。此外，上述B)的組合物只要含有與以1個多肽 形式表達(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌的死菌相當?shù)某煞旨纯桑梢赃M行了鹽析、溶劑沉 淀、透析、超濾、凝膠過濾、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、離子交換色譜、親和層析、疏水色譜、 反相色譜、等電點電泳等任意處理，也可以未進行處理。
[0053]其次，上述C)的、由本發(fā)明的"以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌 獲得且含有上述(b)核酸所編碼的氨基酸序列的多肽"只要是由以1個多肽形式表達(a)核 酸及(b)核酸的大腸桿菌獲得、且含有上述(b)核酸所編碼的氨基酸序列即可，可以是僅含 有上述(b)核酸所編碼的氨基酸序列的多肽，也可以是含有在上述(b)核酸所編碼的氨基酸 序列的氨基末端和/或羧基末端附加有1個或多個氨基酸的氨基酸序列的多肽。
[0054]上述C)的多肽可以通過例如由以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌 按照常規(guī)方法提取或純化多肽而獲得。作為提取或純化多肽的方法，可以列舉例如破碎、磨 碎、在緩沖液中懸浮、凍融、超聲波處理、離心分離、熱處理、鹽析、溶劑沉淀、透析、超濾、凝 膠過濾、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、離子交換色譜、親和層析、疏水色譜、反相色譜、等電點 電泳等方法。此外，為了更加簡便，可以直接獲取以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的 大腸桿菌來作為本發(fā)明的上述C)的多肽。即，上述C)的多肽既可以是與以1個多肽形式表達 (a) 核酸及(b)核酸的大腸桿菌的細胞膜結合的狀態(tài)，也可以是不與該大腸桿菌的細胞膜結 合的狀態(tài)。
[0055] 本發(fā)明的附加有果糖的糖質的制造方法中，作為使在末端含有果糖殘基的糖質及 受體底物與上述A)~C)中的任一者接觸的方法，可以列舉如下方法:例如，將上述A)~C)中 的任一者添加到含有在末端含有果糖殘基的糖質及受體底物的溶液中，在20°C~60°C下靜 置或振蕩一定時間左右。
[0056] 本發(fā)明的附加有果糖的糖質的制造方法中，只要不損害本發(fā)明的特征則也可以具 有其它工序，例如，可以具有利用色譜進行的附加有果糖的糖質的分離工序、煎糖等結晶化 工序、干燥工序、洗滌工序、過濾工序、殺菌工序、添加食品添加劑的工序等。
[0057] 其次，本發(fā)明提供大腸桿菌。本發(fā)明的大腸桿菌為按照能夠以1個多肽形式表達下 述(a)核酸及(b)核酸的方式含有(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌、或以1個多肽形式表達下 述(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌；
[0058] (a)編碼以下氨基酸序列(預定的氨基酸序列）的核酸:與序列號6所示的PgsA蛋白 的氨基酸序列或序列號34所示的CapA蛋白的氨基酸序列中的任一者具有45%以上的同源 性的氨基酸序列、
[0059] (b)編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的核酸。
[0060] 需要說明的是，在本發(fā)明的大腸桿菌部分，關于與上述的本發(fā)明的附加有果糖的 糖質的制造方法相同的或相當?shù)臉嫵?，省略重復的說明。
[0061] 在此，"按照能夠以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的方式含有(a)核酸及(b) 核酸的大腸桿菌"是指按照能夠以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的方式來含有(a)核 酸及(b)核酸、但尚未以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌。
[0062] 本發(fā)明的"按照能夠以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的方式含有(a)核酸及 (b) 核酸的大腸桿菌"，可通過與上述的獲得本發(fā)明的"以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核 酸的大腸桿菌"的方法同樣的方法且使用在轉錄起始時需要某些誘導因子的誘導表達型的 啟動子序列、需要阻遏蛋白的解離的操縱基因序列而獲得。
[0063] 即，在使用誘導表達型的啟動子序列時，若在不提供誘導因子的條件下培養(yǎng)，則可 以獲得"按照能夠以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的方式含有(a)核酸及(b)核酸的 大腸桿菌"。作為這類誘導表達型的啟動子序列，可以列舉例如醇脫氫酶基因的啟動子序列 (誘導因子:醇，Waring RB等、Gene、第79卷、第119~130頁、1989年）、a-淀粉酶基因的啟動 子序列（誘導因子:淀粉、麥芽糖等，Tada S等、Mol.Gen.Genet?、第229卷、第301~306頁、 1991年）、ThiA等來自曲霉屬菌的啟動子序列（誘導因子：硫胺素 ，Shoji JY等、FEMS Microbiol .Lett ?、第244卷、第41 ~46頁、2005年）等。
[0064] 此外，在使用需要阻遏蛋白的解離的操縱基因序列時，若在不提供阻遏蛋白的解 離所必須的因子的條件下培養(yǎng)，則可以獲得"按照能夠以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核 酸的方式含有(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌"。作為這類操縱基因序列，可以列舉例如lac 操縱基因序列(阻遏蛋白解離所需要的因子:乳糖、異丙基-0-D-硫代半乳糖苷(IPTG))等。
[0065] 此外，本發(fā)明提供組合物。本發(fā)明的組合物為含有上述以1個多肽形式表達(a)核 酸及(b)核酸的大腸桿菌的死菌的組合物。此外，本發(fā)明提供多肽。本發(fā)明的多肽是由上述 以1個多肽形式表達(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌獲得且含有上述(b)核酸所編碼的氨基 酸序列的多肽。需要說明的是，在本發(fā)明的組合物及多肽部分，關于與上述本發(fā)明的附加有 果糖的糖質的制造方法相同的或相當?shù)臉嫵?，省略重復的說明。
[0066] 以下基于各實施例對本發(fā)明進行說明。需要說明的是，本發(fā)明的技術范圍不受這 些實施例所示出的特征限定。
[0067] 實施例
[0068] <實施例1>0_呋喃果糖苷酶表達體系的構建
[0069] (1)編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的核酸的獲取
[0070] 對印度拜葉林克氏菌印度亞種NBRC3744(以下簡記為"B.Indica"。）的e-呋喃果糖 苷酶進行了克隆。具體而言，首先按照常規(guī)方法提取了B.Indica的基因組DNA。然后，使用下 述序列號3及序列號4的引物在下述條件下進行聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reacti〇n;PCR)，由此擴增來自B. Indica的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA，按照 常規(guī)方法進行測序，確定了全長堿基序列。將來自B.Indica的編碼呋喃果糖苷酶的氨基 酸序列的DNA的全長堿基序列示于序列號1，此外，將其所編碼的來自B.Indica的呋喃果 糖苷酶的氨基酸序列示于序列號2。
[0071]《來自B. Indica的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA擴增用PCR的條件》
[0072] 模板:B.Indica的基因組DNA
[0073]
[0074] 反向引物：5'-111^0^64(：111^611^0^601；1'111^^^(：-3'（序列號4)
[0075] PCR用酶:KOD-Plus-(東洋紡公司）
[0076] 反應條件：以95°C下10秒、60°C下20秒及68°C下2分鐘為1個循環(huán)，30個循環(huán)。
[0077]然后，使用SignalP4 ? lserver(http: //www. cbs ? dtu ? dk/services/SignalP/)來 預測呋喃果糖苷酶的信號序列。需要說明的是，序列號2中，信號序列相當于第1~28位。 [0078] (2)細胞表面表達體系的重組載體的制作
[0079]在下述條件下進行PCR，從而擴增枯草芽孢桿菌的編碼PgsA蛋白（GenBank: ABO 16 245.1)的DNA。將獲得的PCR產物按照常規(guī)方法用限制酶Nde I及Bg 1II消化，將其作為 DNA片段1。此外，對于PCR產物，按照常規(guī)方法進行測序并確認編碼PgsA蛋白的DNA的堿基序 列。將編碼PgsA蛋白的DNA的喊基序列不于序列號5、將其所編碼的PgsA蛋白的氣基酸序列 示于序列號6。
[0080]《編碼PgsA蛋白的DNA擴增用PCR的條件》
[0081 ] 模板:枯草芽孢桿菌（IAM1026、ATCC9466)的基因組DNA
[0082] 正向引物（下劃線表示Ndel位點）：5'-AAACATATGAAAAAAGAACTGAGCITTCATG-3'（序 列號7)
[0083] 反向引物（下劃線表示Bglll位點）：5'-AAAAGATCITTTAGAmTAGITTGTCACTATG-3' (序列號8)
[0084] PCR用酶:KOD-Plus-(東洋紡公司）
[0085] 反應條件：以95°C下10秒、60°C下20秒及68°C下2分鐘為1個循環(huán)，30個循環(huán)。
[0086]然后，在下述條件下進行PCR，擴增來自B.Indica的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸 序列的DNA，按照常規(guī)方法用限制酶BamHI及Xhol消化，將其作為DNA片段2。
[0087]《來自B.Indica的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA擴增用PCR的條件》 [0088] 模板:本實施例1 (1)的B. Indica的基因組DNA
[0089] 正向引物（下劃線表示B a m H I位點）：5 ' - AAAGGATCCTCGGGTTACCCGATACCGACTCCGCAITCGGGACA-3 '（序列號9)
[0090] 反向引物（下劃線表示X h 〇 I位點）：5 ' - CCCCTCGAGTTACTGGCCGITCGTGACACCATGGCCATTAAC-3 '（序列號 10)
[0091] PCR用酶:KOD-Plus-(東洋紡公司）
[0092] 反應條件：以95°C下10秒、60°C下20秒及68°C下2分鐘為1個循環(huán)，20個循環(huán)。
[0093] 然后，使用DNA Ligation Kit Ver.2.1(寶生物(Takara Bio)公司）按照所附的說 明書將DNA片段1及DNA片段2插入pCDFDuet-1質粒(Merck公司）的Ndel位點及Xhol位點，將 其作SpQ)F-pgsA_indica重組載體。
[0094] 此外，關于pCDF-pgsA-indica重組載體，在按照常規(guī)方法用限制酶Ndel及Xhol消 化后，進行電泳而純化，獲得按照能夠以1個多肽形式表達PgsA蛋白及來自B. Indica的呋 喃果糖苷酶的氨基酸序列的方式編碼的DNA，將其作為DNA片段3。然后，同樣地用Ligation high Ver.2(東洋紡公司）在用Ndel及Xhol消化過的pET42a( + )質粒(Merck公司）中插入DNA 片段3,將其作為pET-pgsA-indica重組載體。
[0095] (3)菌體內表達體系的重組載體的制作
[0096]在下述條件下以本實施例1 (2)的pCDF-pgsA-indica重組載體為模板進行PCR，從 而擴增不含編碼pgsA蛋白的DNA的DNA，將其作為DNA片段4。然后，用Ligation high Ver.2 (東洋紡公司）進行DNA片段4的自身連接，將其作為p⑶F-indica重組載體。
[0097]《來自pCDFDuet-1質粒的DNA擴增用PCR的條件，所述pCDFDuet-1質粒插入有來自 B. Indica的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA》
[0098] 模板:本實施例1 (2)的pCDF-pgsA-indica重組載體
[0099]正向引物：5'-〇厶丁厶丁6!11^611^〇01^丁厶01^(：-3'（序列號11)
[0100]
[0101] PCR 用酶:KOD-Plus-Neo (東洋紡公司）
[0102] 反應條件：以98 °C下10秒、59 °C下30秒、68 °C下2分40秒為1個循環(huán)，25個循環(huán)。
[0103] 此外，將pCDF-indica重組載體按照常規(guī)方法用限制酶Ndel及Xhol消化，從而獲得 來自B. Indica的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA，將其作為DNA片段5。然后，同樣 地用Ligation high Ver? 2(東洋紡公司）在用Ndel及Xhol消化后的pET42a( + )質粒(Merck 公司）中插入DNA片段5，將其作為pET-indica重組載體。
[0104] (4)菌體內表達體系(可溶性)的重組載體的制作
[0105]在下述條件下進行PCR，擴增來自B. Indica的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列 的DNA，將其作為DNA片段6。
[0106]《來自B. Indica的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA擴增用PCR的條件》 [0107] 模板:本實施例1(3)的pCDF-indica重組載體
[0108]正向引物：5'-6厶丁66111^厶0^61'111^611^〇01^丁厶01；-3'（序列號13)
[0109]反向引物：5'-6丁66丁66丁0(：111^611^(^66〇1；1'111^^^-3'（序列號14)
[0110] PCR 用酶:KOD-Plus-Neo (東洋紡公司）
[0111] 反應條件：以98 °C下10秒、68 °C下50秒為1個循環(huán)，25個循環(huán)。
[0112] 此外，在下述條件下進行PCR，擴增來自pET42a( + )質粒的DNA，將其作為DNA片段7。
[0113] 《來自pET42a⑴質粒的DNA擴增用PCR的條件》
[0114]模板:pET42a( + )質粒(Merck 公司）
[0115] 正向引物:5'-CTCGAGCACCACCACCACCACCACCACCACTAAIT-3'（序列號 15)
[0116] 反向引物：5'-ACTAGTTGAACCATCCGATIT-3'（序列號 16)
[0117] PCR 用酶:KOD-Plus-Neo (東洋紡公司）
[0118] 反應條件：以98 °C下10秒、68 °C下2分鐘50秒為1個循環(huán)，25個循環(huán)。
[0119] 然后，按照以1個多肽形式表達來自B.Indica的呋喃果糖苷酶和pET42a( + )質粒 中所含有的谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)的方式，用In-Fusion HDCloning Kit(寶生物公司） 將DNA片段6及DNA片段7連接，將其作為pET-GST-indica重組載體。需要說明的是，GST為可 溶性蛋白質，據(jù)報道，通過使GST和目標蛋白以融合蛋白質形式來表達，可提高目標蛋白的 可溶性。
[0120] (5)轉化及轉化體的培養(yǎng)
[0121 ] 將本實施例1 (2)的pCDF-pgsA-indi ca重組載體及pET-pgsA-indi ca重組載體、本 實施例1(3)的pCDF-indica重組載體及pET-indica重組載體、以及本實施例1(4)的pET-GST-indica重組載體導入大腸桿菌BL21(DE3)株的感受態(tài)細胞(COSMO BI0公司）中，獲得作 為轉化體的重組大腸桿菌。
[0122] 將其在37°C下平板培養(yǎng)一晚后，拾取重組大腸桿菌的克隆并接種到M9SEED培養(yǎng)基 lmL中，在30°C、220rpm下振蕩培養(yǎng)20小時。然后，將培養(yǎng)液10yL在M9Main培養(yǎng)基2mL中傳代 培養(yǎng)，在25°C、220rpm下振蕩培養(yǎng)24小時。M9SEED培養(yǎng)基及M9Main培養(yǎng)基的組成如以下所 示。需要說明的是，關于M9SEED培養(yǎng)基及M9Main培養(yǎng)基中的抗生素，對于利用pCDF-pgsA-indica重組載體及pCDF-indica重組載體轉化的大腸桿菌，使用鏈霉素(終濃度50iig/mL); 對于利用pET-pgsA-indi ca重組載體、pET-indica重組載體及pET-GST-indica重組載體轉 化的大腸桿菌，使用卡那霉素(終濃度30yg/mL)。
[0123] M9SEED 培養(yǎng)基（共 lOOrnL);水 72mL、5XM9 鹽 20mL、20% 酪蛋白氨基酸 5mL、20%D-葡 萄糖2mL、2mg/mL胸腺嘧啶lmL、50mM CaCl2 0.2mL、2.5M MgCl2 40yL、100mg/mL FeS〇4 28y L、抗生素
[0124] M9Main 培養(yǎng)基（共 lOOrnL);水 67mL、5XM9 鹽 20mL、20% 酪蛋白氨基酸 5mL、2mg/mL 胸 腺啼啶lmL、50mM CaCl2 0.2mL、100mg/mL FeSCU 28tiL、0ve;rnight Express Autoinduction System l(0.N.E.;Merck公司）Sol.l 2mL、0.N.E.Sol.2 5mL、0.N.E.Sol.3 100yL、抗生素
[0125] <實施例2 >細胞表面表達體系的效果的研究
[0126] (1)酶反應
[0127] 準備實施例1 (5)的重組大腸桿菌的培養(yǎng)液2mL，然后將培養(yǎng)液在12000rpm、4°C下 離心分離5分鐘，從而回收重組大腸桿菌，測定菌體的濕重。此外，調制含有30(w/w)%的蔗 糖的0.04M的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)，將其作為30%蔗糖溶液。在重組大腸桿菌的培養(yǎng)液2mL 中添加30%蔗糖溶液350此進行懸浮，將其在30°C、200rpm下振蕩3小時，由此進行呋喃果 糖苷酶的酶反應，將其作為反應液。需要說明的是，如果大腸桿菌接觸溶質濃度為30(w/ w) %左右的溶液，則水分在滲透壓作用下從菌體流出而發(fā)生溶菌。
[0128] (2)糖組成的確認
[0129] 在本實施例2(1)的反應液50yL中加入水950yL而進行稀釋后，在100°C下加熱10分 鐘。然后，在4°C、15000Xg下離心分離10分鐘，回收上清，用孔徑0.45M1的過濾器過濾，將獲 得的濾液作為HPLC樣品。然后，將HPLC樣品在下述條件下供于HPLC，確認反應液中所含有的 各糖(單糖:果糖及葡萄糖，二糖:蔗糖，三糖以上的寡糖:蔗果三糖、蔗果四糖等)的比例。關 于各糖的比例，以面積百分率形式算出各峰的面積相對于檢測到的全部峰的面積總和的比 例。
[0130] 《HPLC的條件》
[0131] 柱：SHODEX SUGAR KS_802(8.0<i) X300mm)2根
[0132] 流動相:水
[0133] 流速：1.0mL/分鐘
[0134] 注入量:20yL
[0135] 溫度：50°C
[0136] 檢測:差示折射率檢測器(RID;昭和電工公司）
[0137] 然后，將酶反應中使用的蔗糖的質量（118.65mg;蔗糖溶液350此中所含有的蔗糖 的質量)乘以三糖以上的寡糖的面積百分率，算出三糖以上的寡糖的量，將其作為寡糖生成 量。此外，將寡糖生成量除以菌體重量，以百分率形式算出單位重量的菌體的寡糖生成量， 將其作為寡糖生成率。此外，將酶反應中使用的蔗糖的質量（118.65mg)乘以從100%中減去 蔗糖的面積百分率而得的值，從而算出蔗糖消耗量。此外，將蔗糖消耗量除以菌體重量，以 百分率形式算出單位重量的菌體的蔗糖消耗量，將其作為蔗糖消耗率。其結果如表1所示。
[0138] [表 1]
[0140] 如表1所示，利用pCDF-indica重組載體轉化的大腸桿菌的反應液的寡糖生成率為 11.9%，與此相對地，利用pCDF-pgsA-indica重組載體轉化的大腸桿菌的反應液則為 78.6%，寡糖生成率大為6.6倍以上。此外，利用pET-indica重組載體及pET-GST-indica重 組載體轉化的大腸桿菌的反應液的寡糖生成率分別為27.1%及11.3%，與此相對地，利用 口￡1'18^-丨11(11(^重組載體轉化的大腸桿菌的反應液則為116.4%，寡糖生成率分別大為 4.2倍以上、及10.3倍以上。
[0141] 即，可知在使用來自pCDF-Duetl質粒的重組載體及來自pET42a( + )質粒的重組載 體中的任一者時，將在大腸桿菌的細胞表面表達呋喃果糖苷酶時與在菌體內表達呋喃 果糖苷酶時、或在菌體內以可溶性蛋白質形式表達時相比，寡糖的生成效率顯著提高。這些 結果表明，不論轉化中使用的載體的種類為何種，在以1個多肽形式表達用于使蛋白在細胞 表面表達的錨定蛋白和呋喃果糖苷酶時，都能夠極其高效地制造附加有果糖的糖質。
[0142] <實施例3 > 呋喃果糖苷酶的來源的研究
[0143] 發(fā)明人還研究了：能否不受呋喃果糖苷酶的來源限制，均發(fā)揮通過以1個多肽形 式表達用于使蛋白在細胞表面表達的錨定蛋白和呋喃果糖苷酶而能夠高效地制造附加 有果糖的糖質的這樣的效果。具體而言，對屬于與來自B. Indica的咲喃果糖苷酶同一個 家族68的瘤狀伯克霍爾德菌（Burkholderiaphymatum)STM815(以下簡記為"Burk"。）的咲 喃果糖苷酶、及屬于家族32的白曲霉IF04303(以下簡記為"Kawachii"。）的呋喃果糖苷酶 進行了研究。
[0144] (1)編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的核酸的獲取
[0145] [1-1]來自Burk的呋喃果糖苷酶
[0146] 通過實施例1(1)中記載的方法進行了Burk的呋喃果糖苷酶的克隆及測序。但 PCR的條件如下所述。將來自Burk的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA的全長堿基序 列示于序列號17、將其所編碼的來自Burk的呋喃果糖苷酶的氨基酸序列示于序列號18。 需要說明的是，序列號18中，信號序列相當于第1~35位。此外，將通過在下述條件下進行的 PCR而擴增的來自Burk的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA作為DNA片段8。
[0147] 《來自Burk的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA擴增用PCR的條件》
[0148] 模板:Burk的基因組DNA
[0149] 正向引物： 序列號 19)
[0150] 反向引物： ：-3'（序 列號20)
[0151 ] PCR用酶:KOD-Plus-(東洋紡公司）
[0152] 反應條件：以94°C下15秒、58°C下20秒及68°C下2分鐘為1個循環(huán)，21個循環(huán)。
[0153] [1-2]來自Kawachii的咲喃果糖苷酶
[0154] 然后，委托GenScript公司人工合成編碼Kawachii的咲喃果糖苷酶(GenBank: GAA88101.1)的DNA，由此而獲取。將來自Kawachii的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的 DNA的全長堿基序列示于序列號21、將其所編碼的來自kawachii的呋喃果糖苷酶的氨基 酸序列示于序列號22。需要說明的是，序列號22中，信號序列相當于第1~24位。
[0155] (2)細胞表面表達體系的重組載體的制作
[0156] [2-1]來自Burk的呋喃果糖苷酶
[0157] 在下述條件下進行PCR，從而擴增來自插入有編碼PgsA蛋白的DNA的pCDFDuet-1質 粒的、且不含來自B. Indica的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA的DNA，將其作為DNA 片段9。
[0158] 《來自插入有編碼PgsA蛋白的DNA的pCDFDuet-1質粒的DNA擴增用PCR的條件》
[0159] 模板:實施例1(2)的pCDF-pgsA-indica重組載體
[0160] 正向引物：5'-1'0^^^^厶厶6厶厶厶01；(^60^^1^厶厶1'1'1'-3'（序列號23)
[0161] 反向引物：5'-mAGAmTAGITTGTCACTATGATCAAT-3'（序列號24)
[0162] 反應條件：以98°C下10秒、68°C下2分25秒為1個循環(huán)，25個循環(huán)。
[0163] 然后，使用In-Fusion HD Cloning Kit(寶生物公司），按照所附的說明書將本實 施例3( 1) [ 1-1 ]的DNA片段8和DNA片段9連接，將其作為pCDF-pgsA-burk重組載體。
[0164] [ 2-2 ]來自Kawachi i的咲喃果糖苷酶
[0165] 在下述條件下進行PCR，從而擴增來自Kawachii的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸 序列的DNA，將其作為DNA片段10。
[0166] 《來自Kawachii的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA擴增用PCR的條件》
[0167] 模板:本實施例3(1) [1-2]的來自Kawachii的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列 的DNA
[0168] 正向引物：5'-厶厶厶1'0^厶厶厶6厶丁0^01^6611^111^0^(：-3'（序列號25)
[0169] 反向引物：5'-111^〇^6厶(：111^611^厶1厶〇^^06厶1〇1^(：-3'（序列號26)
[0170] PCR 用酶:KOD-Plus-Neo (東洋紡公司）
[0171] 反應條件：以98 °C下10秒、68 °C下50秒為1個循環(huán)，25個循環(huán)。
[0172] 此外，在下述條件下以實施例1 (2)的pCDF-pgsA-indica重組載體為模板進行PCR， 從而擴增不含來自B.Indica的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA的DNA，將其作為 DNA片段11。
[0173] 《來自插入有編碼PgsA蛋白的DNA的pCDFDuet-1質粒的DNA擴增用PCR的條件》
[0174] 模板:實施例1 (2)的pCDF-pgsA-indica重組載體
[0175] 正向引物：5'-(：111^61'0^^^^厶厶6厶厶厶01；(^60^^1^厶厶-3'（序列號27)
[0176] 反向引物：5'-GGATCTITTAGAITTTAGITTGTCACTATGATCAA-3'（序列號28)
[0177] PCR 用酶:KOD-Plus-Neo (東洋紡公司）
[0178] 反應條件：以98 °C下10秒、68 °C下2分25秒為1個循環(huán)，25個循環(huán)。
[0179] 然后，使用In-Fusion HD Cloning Kit(寶生物公司），按照所附的說明書將DNA片 段10及DNA片段11連接，將其作為p⑶F-pgsA-kawachii重組載體。
[0180] (3)菌體內表達體系的重組載體的制作
[0181] [3-1]來自Burk的呋喃果糖苷酶
[0182] 在下述條件下以本實施例3(2)[2-1]的口0^18^-13114重組載體為模板進行?0?， 從而擴增不含編碼PgsA蛋白的DNA的DNA，將其作為DNA片段12。然后，使用Ligation high Ver. 2(東洋紡公司），按照所附的說明書將DNA片段12自身連接，將其作為pCDF-burk重組載 體。
[0183] 《來自pCDFDuet-1質粒的DNA擴增用PCR的條件，所述pCDFDuet-1質粒插入有來自 Burk的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA》
[0184] 模板:本實施例3 (2) [ 2-1 ]的pCDF-pgsA-burk重組載體
[0185] 正向引物：5'-〇厶丁厶丁6〇厶6厶0^^^厶〇60^66(：1'-3'（序列號29)
[0186] 反向引物：5'-1厶1厶1'0'0：1'1'(：11^1厶(：11^厶0^厶1厶-3'（序列號30)
[0187] PCR 用酶:KOD-Plus-Neo (東洋紡公司）
[0188] 反應條件：以98 °C下10秒、59 °C下30秒、68 °C下2分40秒為1個循環(huán)，25個循環(huán)。
[0189] [ 3-2 ]來自Kawachi i的咲喃果糖苷酶
[0190] 在下述條件下以本實施例3(2)[2-2]的口0^1884-1??^〇11；[;[重組載體為模板進行 PCR，從而擴增不含編碼pgsA蛋白的DNA的DNA，將其作為DNA片段13。然后，使用Ligation h i g h V e r . 2 (東洋紡公司），按照所附的說明書將D N A片段13自身連接，將其作為p C D F -kawachii重組載體。
[0191] 《來自pCDFDuet-1質粒的DNA擴增用PCR的條件，所述pCDFDuet-1質粒插入有來自 Kawachii的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA》
[0192] 模板:本實施例 3 (2) [ 2-2 ]的 pCDF-pgsA-kawach i i 重組載體
[0193] 正向引物：5'-CATATGTCCGTGGTCATCGACTAC-3'（序列號31)
[0194] 反向引物：5'-1厶1厶1'0'0：1'1'(：11^1厶(：11^厶0^厶1厶-3'（序列號32)
[0195] PCR 用酶:KOD-Plus-Neo (東洋紡公司）
[0196] 反應條件：以98 °C下10秒、59 °C下30秒、68 °C下2分鐘40秒為1個循環(huán)，25個循環(huán)。
[0197] (4)轉化及轉化體的培養(yǎng)
[0198] 將本實施例3 (2) [ 2-1 ]的pCDF-pgsA-burk重組載體、本實施例3 (2) [ 2-2]的pCDF-pgsA-kawachii重組載體、本實施例3(3) [3-1]的pO)F-burk重組載體及本實施例3(3) [3-2] 的pCDF-kawachii重組載體通過實施例1(5)中記載的方法導入大腸桿菌，對獲得的重組大 腸桿菌進行培養(yǎng)。
[0199] (5)酶反應及寡糖量的測定
[0200] 使用本實施例3(4)的重組大腸桿菌的培養(yǎng)液，利用實施例2(1)中記載的方法進行 呋喃果糖苷酶的酶反應。然后利用實施例2(2)中記載的方法測定反應液中所含有的各糖 的比例，算出寡糖生成量、寡糖生成率、蔗糖消耗量及蔗糖消耗率。其結果如表2所示。為了 進行比較，表2中一并示出了利用表1中記載的pCDF-indica重組載體及pCDF-pgsA-indica 重組載體轉化的大腸桿菌的反應液的結果。
[0201] [表 2]
[0203]如表2所示，利用pCDF-burk重組載體轉化的大腸桿菌的反應液的寡糖生成率為 37.0%，與此相對地，利用pCDF-pgsA-burk重組載體轉化的大腸桿菌的反應液則為 156.7%，寡糖生成率大為4.2倍以上。此外，利用pCDF-kawachii重組載體轉化的大腸桿菌 的反應液的寡糖生成率為34.5%，與此相對地，利用pCDF-pgsA-kawachii重組載體轉化的 大腸桿菌的反應液則為245.2%，寡糖生成率大為7.1倍以上。
[0204] §卩，可以獲知:使來自Burk的咲喃果糖苷酶及來自Kawachi i的咲喃果糖苷酶 在大腸桿菌的細胞表面表達時，與來自B.indica的呋喃果糖苷酶同樣地，寡糖生成效率 顯著高于在菌體內表達的情況。這些結果表明，與用于使蛋白在細胞表面表達的錨定蛋白 融合而以1個多肽形式表達時，不受呋喃果糖苷酶的來源或家族的差異限制，能夠極其高 效地制造附加有果糖的糖質。
[0205] <實施例4>錨定蛋白的研究
[0206] 發(fā)明人還研究了：能否不受錨定蛋白的種類限制，均發(fā)揮通過以1個多肽形式表達 用于使蛋白在細胞表面表達的錨定蛋白和呋喃果糖苷酶而能夠高效地制造附加有果糖 的糖質的這樣的效果。具體而言，以PgsA蛋白的氨基酸序列為基礎，使用基本局部比對搜索 工具(BLAST)進行檢索，提取下述(一)及(二）的錨定蛋白，對這些進行研究。
[0207](一）與PgsA蛋白的氨基酸序列的同源性為45 %的巨大芽孢桿菌DSM319株的CapA 蛋白、
[0208](二)與PgsA蛋白的氨基酸序列的同源性為32 %、與CapA蛋白的氨基酸序列的同源 性為36 %的短短芽抱桿菌（Brevibacillus brevis )NBRC100599株的蛋白質（geninfo 1(16111:1;1^61'1'(61)號為226313341;以下稱為"1^6￥蛋白"。）。
[0209] (1)細胞表面表達體系的重組載體的制作
[0210] [H]編碼CapA蛋白的DNA的擴增
[0211] 對于編碼CapA蛋白的DNA序列，設計以在大腸桿菌中最適的密碼子編碼的堿基序 列，將其作為capA_opti基因。將capA_opti基因的堿基序列示于序列號33、將其所編碼的氨 基酸序列示于序列號34。然后，人工合成capA_opti基因的DNA，以其為模板在下述條件下進 行PCR，從而擴增編碼CapA蛋白的DNA，將其作為DNA片段14。
[0212] 《編碼CapA蛋白的DNA擴增用PCR的條件》
[0213]模板:人工合成的capA_opti基因的DNA
[0214] 正向引物：5'-TAAGAAGGAGATATACATATGAAAGAAAAGAAACTGAACTTCCAAG-3'（序列號 35)
[0215] 36)
[0216] PCR用酶:KOD-Plus-(東洋紡公司）
[0217] 反應條件：以94°C下15秒、58°C下20秒及68°C下2分鐘為1個循環(huán)，21個循環(huán)。
[0218] [1-2]編碼brev蛋白的DNA的擴增
[0219] 按照常規(guī)方法提取短短芽孢桿菌NBRC100599株的基因組DNA。然后，在下述條件下 進行PCR，從而擴增編碼brev蛋白的DNA，將其作為DNA片段15。此外，按照常規(guī)方法對PCR產 物進行測序，確定了編碼brev蛋白的DNA的全長堿基序列。將編碼brev蛋白的DNA的全長堿 基序列示于序列號37,此外，將其所編碼的brev蛋白的氨基酸序列示于序列號38。
[0220] 《編碼brev蛋白的DNA擴增用PCR的條件》
[0221] 模板:短短芽孢桿菌NBRC100599株的基因組DNA
[0222]
[0223] 反向引物：5'-61八八〇〇!^66八1'〇^666〇八61'(^〇^〇1；(：-3'（序列號40)
[0224] PCR 用酶:KOD-Plus-Neo (東洋紡公司）
[0225] 反應條件：以98 °C下10秒、68 °C下1分鐘10秒為1個循環(huán)，45個循環(huán)。
[0226] [1-3]重組載體的制作
[0227] 〈 1-3-1〉CapA 蛋白
[0228] 在下述條件下以實施例1 (2)的pCDF-pgsA-indica重組載體為模板進行PCR，從而 擴增不含編碼pgsA蛋白的DNA的、來自B.Indica的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的 DNA，將其作為DNA片段16。然后，使用In-Fusion HD Cloning Kit(寶生物公司），按照所附 的說明書將本實施例4( 1) [ 1-1 ]的DNA片段14和DNA片段16連接，將其作為pCDF-capA_〇pti-indica重組載體。
[0229] 《來自pCDFDuet-1質粒的DNA擴增用PCR的條件，所述pCDFDuet-1質粒插入有來自 B. Indica的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA》
[0230] 模板:實施例1 (2)的pCDF-pgsA-indica重組載體
[0231] 正向引物：5'-八6八!'(：1^八111^611^01^丁八01^(：-3'（序列號41)
[0232] 反向引物：5'-0厶1厶161厶1厶1'(^〇：1'1'(：11^1厶(：11^厶(：-3'（序列號42)
[0233] PCR 用酶:KOD-Plus-Neo(東洋紡公司）
[0234] 反應條件：以98 °C下10秒、68 °C下3分鐘20秒為1個循環(huán)，25個循環(huán)。
[0235] 〈 l_3_2〉brev 蛋白
[0236] 在下述條件下以實施例1 (2)的pCDF-pgsA-indica重組載體為模板進行PCR，從而 擴增不含編碼PgsA蛋白的DNA的DNA，將其作為DNA片段17。然后，使用In-Fusion HD Cloning Kit(寶生物公司），按照所附的說明書將本實施例4( 1)[ 1-2]的DNA片段15和DNA片 段17連接，將其作為pCDF-brev-indica重組載體。
[0237] 《來自pCDFDuet-1質粒的DNA擴增用PCR的條件，所述pCDFDuet-1質粒插入有來自 B. Indica的編碼呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA》
[0238] 模板:實施例1 (2)的pCDF-pgsA-indica重組載體
[0239] 正向引物：5'-厶6厶丁0：111^611^〇01^丁厶01^-3'（序列號43)
[0240] 反向引物：5'-六161六1六1'0'0：1'1'(：11^1六(：11^六(：1'-3'（序列號44)
[0241] PCR 用酶:KOD-Plus-Neo (東洋紡公司）
[0242] 反應條件：以98 °C下10秒、68 °C下3分鐘20秒為1個循環(huán)，25個循環(huán)。
[0243] (2)酶反應及糖組成的確認
[0244] 將本實施例 4( 1)的pCDF-capA_opti_indica 重組載體及 pCDF-brev-indica 重組載 體通過實施例1(5)所述的方法導入大腸桿菌，對獲得的重組大腸桿菌進行培養(yǎng)。然后，使用 這些重組大腸桿菌的培養(yǎng)液，利用實施例2(1)中記載的方法進行呋喃果糖苷酶的酶反 應。然后利用實施例2(2)中記載的方法測定反應液中所含有的各糖的比例，算出寡糖生成 量、寡糖生成率、蔗糖消耗量及蔗糖消耗率。其結果如表3所示。為了進行比較，表3中一并示 出了利用表1中記載的pCDF-indica重組載體及pCDF-pgsA-indica重組載體轉化的大腸桿 菌的反應液的結果。
[0245] [表 3]
[0246]
[0247] 如表3所示，利用pCDF-indica重組載體轉化的大腸桿菌的反應液的寡糖生成率為 11.9%，與此相對地，利用pCDF-pgsA-indica重組載體轉化的大腸桿菌的反應液則為 78.6%、利用口00?-(^口4_叩^-111(11(^重組載體轉化的大腸桿菌的反應液則為312.2%、利 用pCDF-brev-indica重組載體轉化的大腸桿菌的反應液為1.0%。即，與使用pCDF-indica 重組載體時相比，使用口00?18^-丨11(11(^重組載體時的寡糖生成率大為6.6倍以上、使用 pCDF-capA_opti_indica重組載體時的寡糖生成率大為26 ? 2倍以上，而使用pCDF-brev-indica重組載體時小為約0.08倍。
[0248] 即，可以獲知:在利用brev蛋白使呋喃果糖苷酶在大腸桿菌的細胞表面表達時， 與在菌體內表達時相比，寡糖的生成效率變??；而利用PgsA蛋白、CapA蛋白使呋喃果糖苷 酶在大腸桿菌的細胞表面表達時，與在菌體內表達時相比，寡糖的生成效率顯著提高。這些 結果表明，通過以1個多肽形式表達特定錨定蛋白和呋喃果糖苷酶，從能夠高效地制造附 加有果糖的糖質，所述特定錨定蛋白含有與PgsA蛋白的氨基酸序列或CapA蛋白的氨基酸序 列中的任一者具有45%以上的同源性的氨基酸序列。
[0249] <實施例5>宿主的研究
[0250] 發(fā)明人還研究了 ：能否不受宿主的種類影響，均發(fā)揮以1個多肽形式表達用于使蛋 白在細胞表面表達的錨定蛋白和呋喃果糖苷酶而高效地制造附加有果糖的糖質這樣的 效果。具體而言，對以作為PgsA蛋白的來源的枯草芽孢桿菌及作為CapA蛋白的來源的巨大 芽孢桿菌為宿主的情況進行了研究。
[0251 ] (1)以枯草芽孢桿菌為宿主的情況
[0252] [1-1]重組載體的制作
[0253] 在下述條件下進行PCR，從而擴增編碼PgsA蛋白及來自B. Indica的呋喃果糖苷 酶的氨基酸序列的DNA，將其作為DNA片段18。
[0254] 《編碼PgsA蛋白及來自B. Indica的呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA擴增用PCR 的條件》
[0255] 模板:實施例1 (2)的pCDF-pgsA-indica重組載體
[0256]
[0257] 反向引物：5'氣01^66厶〇61^6厶(：17厶(^6601；1'1^6丁6厶〇厶0^丁66-3'（序列號46)
[0258] PCR 用酶:KOD-Plus-Neo (東洋紡公司）
[0259] 反應條件：以95 °C下20秒、50 °C下30秒、68 °C下2分鐘為1個循環(huán)，25個循環(huán)。
[0260]此外，以作為枯草芽孢桿菌用分泌表達載體的pHT43質粒(MoBiTec公司）的堿基序 列為基礎，設計下述序列號47及序列號48的引物，在下述條件下進行PCR，從而擴增來自 PHT43質粒的DNA，將其作為DNA片段19。
[0261] 《來自pHT43質粒的DNA擴增用PCR的條件》
[0262] 模板:pHT43 質粒(MoBiTec 公司）
[0263] 正向引物：5'-6!11^〇6丁0：01^^^^^6〇01；(：0^厶丁6-3'（序列號47)
[0264] 反向引物：5'-16厶10：11'0^0：1'11^厶11^^^^厶11^1'1'-3'（序列號48)
[0265] PCR 用酶:KOD-Plus-Neo (東洋紡公司）
[0266] 反應條件：以95°C下20秒、68°C下5分、68°C下5分鐘為1個循環(huán)，25個循環(huán)。
[0267] 然后，使用In-Fusion HD Cloning Kit(寶生物公司），按照所附的說明書將DNA片 段18和DNA片段19連接，將其作為pHT43-pgsA-indica重組載體。
[0268] [1-2]轉化體的制作
[0269] 將本實施例5(1) [ 1-1 ]的pHT43-pgsA_indica重組載體通過實施例1 (5)中記載的 方法導入大腸桿菌，并對重組大腸桿菌進行培養(yǎng)后，從重組大腸桿菌回收pHT43-pgsA-indica重組載體。將回收的pHT43-pgsA_indica重組載體及pHT43質粒(MoBiTec公司）利用 電穿孔法導入枯草芽抱桿菌RIK1285株（B.subtilis Secretory Protein Expression System; TAKARA公司），獲得轉化體，將其作為重組枯草芽孢桿菌。電穿孔法使用GENE PULSER II(Bio-Rad公司）并按照以下〈1〉~〈8〉的步驟進行。
[0270] 〈1〉從枯草芽抱桿菌RIK1285(B.subtilis Secretory Protein ExpressionSystem;TAKARA公司）的甘油菌中取出適量菌涂布在LB平板上，在37°C培養(yǎng)一晚 (約16小時）后，拾取單個菌落，接種到裝有25mL的LB培養(yǎng)基的容量250mL的燒瓶中，在28°C 進行一晚(約16小時）的前培養(yǎng)，將其作為前培養(yǎng)液。
[0271] 〈2〉調制添加有終濃度0.5M的山梨醇的LB培養(yǎng)基，將其作為主培養(yǎng)培養(yǎng)基。在裝有 50mL的主培養(yǎng)培養(yǎng)基的容量250mL的三角燒瓶中加入前培養(yǎng)液5mL，在37 °C、220rpm下進行 主培養(yǎng)，將其作為主培養(yǎng)液。主培養(yǎng)進行至濁度值達到穩(wěn)定期(〇D600 = 0.85~0.95)為止。
[0272] 〈3〉將裝有主培養(yǎng)液的三角燒瓶在冰中放置10分鐘以上，然后在5000 Xg、4°C下離 心分離10分鐘。除去上清后，用冰冷的溶液A(0.5M山梨醇、0.5M甘露醇、0.5M海藻糖、10%甘 油)洗滌菌體4次。
[0273] 〈4〉然后，將菌體懸浮于適當量的溶液A中后，分成各60此后保存于-80°C下，將其 作為電穿孔法用菌體。
[0274] 〈 5〉將電穿孔法用菌體在冰中溶解，分別加入適當量的作為樣品的pHT43-pgsA- indica重組載體、作為對照的pHT43質粒(MoBiTec公司）后，轉移到預先用冰冷卻的0.1cm間 隔的透明試管(Cuvette)中，放置1~1.5分鐘。
[0275] 〈 6〉以22KV/cm( 25yF、200 Q )施加脈沖后，加入溶液B(含有0 ? 5M的山梨醇及0 ? 38M 的甘露醇的LB培養(yǎng)基)lmL，在37 °C平穩(wěn)地進行3小時的振蕩培養(yǎng)。
[0276] 〈7〉將該培養(yǎng)液以3500rpm離心分離5分鐘，除去上清。加入100此的溶液B懸浮，涂 布在含有終濃度5yg/mL的氯霉素的LB平板上，在37°C培養(yǎng)一晚。
[0277] 〈8〉將LB平板上出現(xiàn)的菌落加入含有終濃度5yg/mL的氯霉素及終濃度ImM的異丙 基-0-硫代半乳糖苷（IPTG)的L培養(yǎng)基lmL中，在30°C、220rpm下旋轉培養(yǎng)24小時，將其作為 重組枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液。
[0278] [1-4]酶反應及糖組成的確認
[0279] 調制含有45(w/w)%的蔗糖的0.04M的磷酸鉀緩沖液，將其作為45%蔗糖溶液。將 本實施例5(1) [ 1-2]〈8〉的重組枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)液在4°C、3500rpm下離心分離10分鐘， 回收菌體，懸浮于500此的45%蔗糖溶液，將其在3〇°(：、22〇印 111下振蕩24小時，由此進行0-呋 喃果糖苷酶的酶反應。然后，用50 %乙腈水溶液將反應液稀釋至25倍，作為HPLC樣品。然后， 將HPLC樣品在下述條件下供于HPLC，確認糖組成。其結果如圖2所示。
[0280] 《HPLC分析條件》
[0281] 柱：Cosmosil Sugar-D 4.6X1 50mm
[0282] 洗提液：乙腈水溶液(0~9分鐘:72.5~57.5%;9~11分鐘:72.5)%)
[0283] 柱溫度：25°C
[0284] 流速：1.5mL/分鐘
[0285] 注入量：1.5yL
[0286] 檢測：電霧式檢測器(CAD;Thermo Fisher Scientific公司）
[0287] 如圖2所示，利用pHT43-pgsA_indica重組載體轉化的重組枯草芽孢桿菌的反應液 與利用PHT43質粒轉化的重組枯草芽孢桿菌(對照）的反應液的HPLC譜圖的形狀基本相同， 二者都基本沒有確認到三糖以上的寡糖或葡萄糖、果糖的生成。由該結果可以獲知，在枯草 芽孢桿菌中以1個多肽形式表達用于使蛋白在細胞表面表達的錨定蛋白和呋喃果糖苷酶 時，不能尚效地制造附加有果糖的糖質。
[0288] (2)以巨大芽孢桿菌為宿主的情況
[0289] [2-1]重組載體的制作
[0290] 在下述條件下進行PCR，從而擴增編碼CapA蛋白及來自B. Indica的呋喃果糖苷 酶的氨基酸序列的DNA，將其作為DNA片段20。
[0291] 《編碼CapA蛋白及來自B. Indica的呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的DNA擴增用PCR 的條件》
[0292] 模板:實施例 4(1)的pCDF-capA_opti_indica 重組載體
[0293]
[0294] 反向引物：5'-厶〇^6!'1766厶〇^1'17厶(^66〇1；1'1^6丁6厶〇厶〇^丁66-3'（序列號50)
[0295] PCR 用酶:KOD-Plus-Neo (東洋紡公司）
[0296] 反應條件：以94 °C下15秒、58 °C下20秒、68 °C下3分鐘為1個循環(huán)，21個循環(huán)。
[0297] 此外，以作為巨大芽孢桿菌用表達載體的pWH1520質粒(MoBiTec公司）的堿基序列 為基礎，設計下述序列號51及序列號52的引物，在下述條件下進行PCR，從而擴增來自 pWHl 520質粒的DNA，將其作為DNA片段21。
[0298] 《pWH1520質粒的DNA擴增用PCR的條件》
[0299] 模板:pWH1520 質粒(MoBiTec 公司）
[0300] 正向引物：5'-ATGGTCCAAACTAGTACTAATAAAAITAAT-3'（序列號51)
[0301] 反向引物：5'-17611^1'1'1^0：0：1'11^^1'11^厶6丁6厶厶(：-3'（序列號52)
[0302] PCR 用酶:KOD-Plus-Neo(東洋紡公司）
[0303] 反應條件：以94 °C下15秒、68 °C下9分鐘為1個循環(huán)，35個循環(huán)。
[0304] 然后，使用In-Fusion HD Cloning Kit(寶生物公司），按照所附的說明書將DNA片 段20和DNA片段21連接，將其作為pWH1520-capA_opti-indica重組載體。
[0305] [2-2]轉化體的制作
[0306] 將本實施例5 (2) [ 2-1 ]的pWHl520-capA_opti-indica重組載體通過實施例1 (5)中 記載的方法導入大腸桿菌，并對重組大腸桿菌進行培養(yǎng)后，由重組大腸桿菌回收PWH1520-capA_opti_indica重組載體。將回收的pWH152〇-capA_opti_indica重組載體和作為對照的 PWH1520質粒(MoBiTec公司）利用原生質體法分別導入巨大芽孢桿菌中，獲得轉化體，將其 作為重組巨大芽孢桿菌。原生質體法使用巨大芽孢桿菌Pr 〇t〇plast(M〇bitec公司）按照所 附的說明書進行。將獲得的重組巨大芽孢桿菌在加入到含有終濃度l〇yg/mL的四環(huán)素的LB 培養(yǎng)基lmL，在30°C、220rpm下旋轉培養(yǎng)6小時，然后在培養(yǎng)基中添加木糖以使其終濃度為 0.5(w/w) %，在相同條件下再旋轉培養(yǎng)18小時，將其作為重組巨大芽孢桿菌培養(yǎng)液。
[0307] [2-3]酶反應及糖組成的確認
[0308]使本實施例5(2) [2-2]的重組巨大芽孢桿菌培養(yǎng)液通過本實施例5(1) [1-4]中記 載的方法進行酶反應后，進行反應液的糖組成的確認。其結果如圖3所示。
[0309] 如圖3所示，利用pWH1520-capA_opti-indica重組載體轉化的重組巨大芽孢桿菌 的反應液與利用PWH1520質粒轉化的重組巨大芽孢桿菌的反應液的HPLC譜圖的形狀基本相 同，二者都基本沒有確認到三糖以上的寡糖或葡萄糖、果糖的生成。由該結果可以獲知，在 巨大芽孢桿菌中以1個多肽形式表達用于使蛋白在細胞表面表達的錨定蛋白和呋喃果糖 昔酶時，不能尚效地制造附加有果糖的糖質。
[0310]由以上的本實施例5(1) [1-4]及(2) [2-3]的結果可以獲知，雖然PgsA蛋白來自枯 草芽孢桿菌、CapA蛋白來自巨大芽孢桿菌，但以這些為宿主，以1個多肽形式表達用于使蛋 白在細胞表面表達的錨定蛋白和呋喃果糖苷酶時，不能高效地制造附加有果糖的糖質。 [0311]此外，一直以來在蛋白質的表達中常用的酵母具有內源性的呋喃果糖苷酶 (http://www.mfc ? co ? JP/product/kouso/invertase/)，因此在導入外源的咲喃果糖苷 酶制造附加有果糖的糖質時，需要使用使該內源性呋喃果糖苷酶的活性(蔗糖的同化性） 缺失的變異株(例如日本專利第3628336號、第24頁(3))，作為利用呋喃果糖苷酶的附加 有果糖的糖質的制造方法的宿主缺乏通用性、易操作性。
[0312] 綜上可以獲知，作為利用以1個多肽形式表達用于使蛋白在細胞表面表達的錨定 蛋白和呋喃果糖苷酶的微生物進行的、附加有果糖的糖質的制造方法中的宿主，大腸桿 菌是最合適的。
[0313] <實施例6>受體底物的研究
[0314] 對于能夠借助與用于使蛋白在細胞表面表達的錨定蛋白融合從而以1個多肽形式 在大腸桿菌中表達的呋喃果糖苷酶，接受果糖的轉移的物質（受體底物)也進行了研究。 具體而言，對于單糖、二糖和糖苷、以及作為糖質以外的物質的氫醌是否能夠作為受體底物 進行了研究。
[0315] (1)單糖、二糖及糖苷
[0316] [1-1]酶反應
[0317] 將利用實施例1(2)的pCDF-pgsA-indica重組載體轉化的實施例1(5)的重組大腸 桿菌的培養(yǎng)液在12000rpm、4°C下離心分離5分鐘收集菌體后，準備了按照菌體濕重計約 l〇mg的量。此外，準備作為果糖殘基的供體底物的蔗糖(砂糖;三井制糖公司）、作為受體底 物的單糖(D (+)-木糖(和光純藥公司)及L(+)-阿拉伯糖(和光純藥公司））、二糖(蜜二糖(和 光純藥公司）及乳糖一水合物(和光純藥公司））以及糖苷(a-甲基_D( + )_葡糖苷(和光純藥 公司）），調制組成如表4所示的底物溶液No. 1~5。使用0.04M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)作為底 物溶液的溶劑。對于l〇mg的濕菌體分別添加底物溶液No. 1~5各200yL而懸浮，將其在40°C、 200rpm下振蕩1小時，從而進行呋喃果糖苷酶的酶反應，獲得反應液。將添加底物溶液 No. 1~5而獲得的反應液分別作為反應液No. 1~5。
[0318][表 4]
[0320] [1-2]糖組成的確認
[0321] 在本實施例6(1) [ 1-1 ]的反應液No. 1~5各50yL中加入水450yL及乙腈500yL而稀 釋后，在70°C下加熱10分鐘。然后，在25°C、15000Xg下離心分離10分鐘而回收上清，用孔徑 0.45_的過濾器過濾，將獲得的濾液作為HPLC樣品。將其在下述條件下供于HPLC，測定反應 液中所含有的各糖的比例。關于各糖的比例，以面積百分率形式算出各峰的面積相對于檢 測到的全部峰的面積總和的比例。其結果如表5所示。
[0322] 《HPLC的條件》
[0323] 柱：TOSOH TSKgel Amide80粒徑5_(4.6巾 X250mm)
[0324] 洗提液：乙腈水溶液(反應液No. 1~2及5的HPLC樣品：78% ;反應液No. 3~4的HPLC 樣品：70%)
[0325]柱溫度:70°C
[0326] 流速：1.0mL/分鐘
[0327] 注入量：20yL
[0328] 檢測:差示折射率檢測器(RID;昭和電工公司）
[0329] [表 5]
[0331] 如表5所示，可以確認:反應液No. 1~5均含有來自受體底物的寡糖。即，可以獲知： 反應液No. 1~5中，果糖殘基轉移至D( + )_木糖、L( + )_阿拉伯糖、蜜二糖、乳糖一水合物及a-甲基_D( + )_葡糖苷而生成寡糖。這些結果表明，糖質可以成為與用于使蛋白在細胞表面表 達的錨定蛋白融合從而以1個多肽形式在大腸桿菌中表達的呋喃果糖苷酶的受體底物。
[0332] (2)氫醌
[0333] [2_1]酶反應
[0334] 對于利用實施例1(2)的pCDF-pgsA-indica重組載體轉化的實施例1(5)的重組大 腸桿菌的培養(yǎng)液，準備了按照菌體的濕重計為約l〇mg的量。此外，分別準備作為果糖殘基的 供體底物的蔗糖(砂糖;三井制糖公司）、作為受體底物的氫醌(和光純藥公司）。在50mM的乙 酸緩沖液(pH6.0)lmL中溶解蔗糖342mg(終濃度1M)及氫醌28mg(終濃度0.25M)，將其作為底 物溶液。對于l〇mg的濕菌體添加500此的底物溶液而懸浮，然后在40°C、200rpm下振蕩1小 時，從而進行呋喃果糖苷酶的酶反應，將該樣品作為反應液。此外，準備下述組成的對照 溶液No. 1~3，同樣地在40°C、200rpm下振蕩1小時。獲得對照反應液No. 1~3。
[0335] 對于對照溶液No. 1:10mg的濕菌體，添加50mM乙酸緩沖液(pH6.0)500iiL。
[0336] 對照溶液No. 2:僅底物溶液(不含濕菌體）。
[0337] 對照溶液No . 3:對于10mg的濕菌體，添加含有終濃度1M的蔗糖的50mM乙酸緩沖液 (pH6.0)500yL。
[0338] [ 2-2 ]反應液中所含有的物質的確認
[0339] 對于本實施例6(2) [2-1 ]的樣品反應液及對照反應液No. 1~3，利用本實施例6(1) [1-2]中記載的方法進行HPLC，確認反應液中所含有的物質。其中，HPLC的條件如下所述。其 結果如圖4所示。需要說明的是，在280nm的UV檢測中，主要檢測氫醌及來自于氫醌的產物， 在ELSD中主要檢測糖及來自于糖的產物。
[0340] 《HPLC的條件》
[0341] 柱：Imtakt Unison UK-Amino
[0342] 洗提液：乙腈水溶液(0~30分鐘;98~70%梯度）
[0343] 柱溫度:6(TC
[0344] 流速:0.4mL/分鐘
[0345] 注入量：1此
[0346] 檢測:UV檢測器(280nm)及蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)
[0347] 如圖4的最上段的HPLC譜圖中的箭頭所示，僅在樣品反應液中，在保持時間約12分 鐘、約19分鐘及約24分鐘處確認到峰。在同樣的保持時間，對照反應液No. 1中沒有檢測到 峰，因此可知不是來自菌體，在對照反應液No. 2中沒有檢測到峰，因此可知不是氫醌或蔗 糖，在對照反應液No. 3中沒有檢測到峰，因此可知不是蔗糖在呋喃果糖苷酶作用下生成 的產物(葡萄糖、果糖、蔗果三糖等寡糖等）。即，可以獲知:在樣品反應液中，果糖轉移到氫 醌而生成了糖苷。這些結果表明，糖質以外的物質也可以成為與用于使蛋白在細胞表面表 達的錨定蛋白融合從而以1個多肽形式在大腸桿菌中表達的呋喃果糖苷酶的受體底物。
[0348] 以上的本實施例6(1)[1_2]及（2)[2_2]的結果表明：在與用于使蛋白在細胞表面 表達的錨定蛋白融合從而以1個多肽形式在大腸桿菌中表達的呋喃果糖苷酶作用下，能 夠以糖質、糖質以外的物質作為受體底物，來制造附加有果糖的糖質。
【主權項】
1 · 一種附加有果糖的糖質的制造方法，其具有以下工序:使在末端含有果糖殘基的糖 質及受體底物與以1個多肽形式表達下述(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌、含有進行該表達 的大腸桿菌的死菌的組合物、或由進行該表達的大腸桿菌獲得且含有下述(b)核酸所編碼 的氨基酸序列的多肽接觸， (a) 編碼如下氨基酸序列的核酸:與序列號6所示的PgsA蛋白的氨基酸序列或序列號34 所示的CapA蛋白的氨基酸序列中的任一者具有45%以上的同源性的氨基酸序列， (b) 編碼β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的核酸。2. -種大腸桿菌，其為按照能夠以1個多肽形式表達下述(a)核酸及(b)核酸的方式含 有(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌或以1個多肽形式表達下述(a)核酸及(b)核酸的大腸桿 菌， (a) 編碼如下氨基酸序列的核酸:與序列號6所示的PgsA蛋白的氨基酸序列或序列號34 所示的CapA蛋白的氨基酸序列中的任一者具有45%以上的同源性的氨基酸序列， (b) 編碼β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的核酸。3. -種組合物，其含有以1個多肽形式表達下述(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌的死菌， (a) 編碼如下氨基酸序列的核酸:與序列號6所示的PgsA蛋白的氨基酸序列或序列號34 所示的CapA蛋白的氨基酸序列中的任一者具有45%以上的同源性的氨基酸序列， (b) 編碼β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的核酸。4. 一種多肽，其由以1個多肽形式表達下述(a)核酸及(b)核酸的大腸桿菌獲得且含有 下述(b)核酸所編碼的氨基酸序列， (a) 編碼如下氨基酸序列的核酸:與序列號6所示的PgsA蛋白的氨基酸序列或序列號34 所示的CapA蛋白的氨基酸序列中的任一者具有45%以上的同源性的氨基酸序列， (b) 編碼β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的核酸。5. -種附加有果糖的糖質，其是利用權利要求1所述的制造方法而制造的。
【文檔編號】C12N1/21GK105849263SQ201480071249
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年12月26日
【發(fā)明人】栃尾巧, 伊藤有未, 中村早岐, 藤井匡, 田村圭輔
【申請人】物產食品科技股份有限公司, 日本邁科洛生物制藥有限公司