一種鹽酸肼屈嗪的藥物組合物及其醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鹽酸肼屈嗪的藥物組合物及其醫(yī)藥用途，本發(fā)明提供的鹽酸肼屈嗪的藥物組合物中含有鹽酸肼屈嗪和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，鹽酸肼屈嗪、化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時，對再生障礙性貧血具有治療作用；鹽酸肼屈嗪和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時，對再生障礙性貧血的治療作用進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療再生障礙性貧血的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專利說明】
一種鹽酸肼屈嗪的藥物組合物及其醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及鹽酸肼屈嗪的新用途，具體涉及一種鹽酸肼屈嗪 的藥物組合物及其醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 鹽酸肼屈嗪臨床用于治療治療高血壓和心力衰竭。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種鹽酸肼屈嗪的藥物組合物，該藥物組合物中含有鹽酸 肼屈嗪和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，鹽酸肼屈嗪和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療再生障礙性貧 血。
[0004] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0005] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物a)，
[0006]
[0007] -種鹽酸肼屈嗪的藥物組合物，包括鹽酸肼屈嗪、如權(quán)利要求1所述的化合物（I) 和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0008] 進(jìn)一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0009] 進(jìn)一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0010] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將布渣葉粉碎，用70~90%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃 取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇取物用 大孔樹脂除雜，先用20 %乙醇洗脫12個柱體積，再用80 %乙醇洗脫15個柱體積，收集80 %洗 脫液，減壓濃縮得80%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中80%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為80 :1、40:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至1」4個組分；（(1)步 驟(c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、20:1和15:1的二氯甲烷-甲醇 梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積 百分濃度為65%的甲醇水溶液等度洗脫，收集13~17個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得 到化合物(I)。
[0011] 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用80%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0012] 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為DlOl型大孔吸附樹脂。
[0013]進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進(jìn)行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0014] 上述化合物(I)在制備治療再生障礙性貧血的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 上述鹽酸肼屈嗪的藥物組合物在制備治療再生障礙性貧血的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0017] 本發(fā)明提供的鹽酸肼屈嗪的藥物組合物中含有鹽酸肼屈嗪和一種結(jié)構(gòu)新穎的天 然產(chǎn)物，鹽酸肼屈嗪、化合物（I)單獨(dú)作用時，對再生障礙性貧血具有治療作用;鹽酸肼屈嗪 和化合物（I)聯(lián)合作用時，對再生障礙性貧血的治療作用進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療再生 障礙性貧血的藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0019] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0020]分離方法：（a)將布渣葉（2kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提?。?5LX 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水飽和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用DlO 1型大孔樹脂除雜，先用20 %乙醇洗脫12個柱體積，再用80 %乙醇洗 脫15個柱體積，收集80%洗脫液，減壓濃縮得80%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中80%乙醇 洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1 (10個柱體積）、40:1 (8個柱體積）、20:1 (8個柱體積)和10:1(9個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組 分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1(7個柱體積）、20:1(8個柱體積)和15:1(7 個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵 合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為65 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集13~17個柱體積 洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (HPLC歸一化純度大于98% )。
[0021] 結(jié)構(gòu)確證:HR-ESI-MS顯示[Μ+Na]+為m/z 289.1422,結(jié)合核磁特征可得分子式為 C15H22〇4，不飽和度為5。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ppm，DMSO-Cl 6，500MHz): H-I (4 · 43，S)，H-3 (3.05，m)，Η-3(3· 14，m)，H-5(4.41，dd，J = 8.5，10.1)，H-6(1.83，ddd，J=10.7，10.1， 14.3)，H-6(2.21，br，dd，J = 8.5，14.3)，H-7(2.32，br，t，J=10.7)，Η-8(1·61，m)，H-8 (1.68，m)，H-9(1.29，ddd，J = 4.4，12.4，14.4)，H-9(2.03，dt，J=14.4,4.4)，H-12(4.01， br，s，2H)，H-13(4.80，s)，H-13(4.96，s)，H-14(l.ll，s)，H-15(4.68，s)，H-15(4.79，s);核 磁共振碳譜數(shù)據(jù)Sc(ppm，DMS〇-d 6,125MHz) :97.3(CH，1-C)，206.7(C，2-C)，36.5(CH2,3-C)， 151.1(C，4-C)，78.2(CH，5-C)，44.4(CH2,6-C)，39.2(CH，7-C)，33.1(CH2,8-C)，39.3(CH2,9-C)，81.1(C，10-C)，156.2(C，n-C)，64.7(CH 2，12-C)，107.2(0?，13-C)，24.3(CH3，14-C)， 110.8(〇12，15-〇。1!1-匪1?譜數(shù)據(jù)顯示一個甲基信號[6!11.11(8，16-14)]，兩個烯屬亞甲基信 號[SH4.80(s，H-13)，4.96(s，H-13)，4.68(s，H-15)，4.79(s，H-15)]，一個含氧亞甲基信號 [3財.01(1^，8,2!1)]，兩個含氧次甲基質(zhì)子[3!14.43(8，!1-1)，4.41((1(1，了 = 8.5，10.1!^，!1- 5)] ^3C-NMR譜顯示了 15個碳信號，包括一個甲基，七個亞甲基(兩個烯屬亞甲基δα〇7.2和 110.8, 一個含氧亞甲基δ〇64.7)，三個次甲基(兩個含氧次甲基δ〇78.2和97.3)，四個季碳 (一個羰基碳SC206.7，兩個烯屬季碳δ(：151.1和156.2，一個含氧季碳SC81.1)。核磁圖譜表 明該化合物為倍半萜類化合物，并含有兩個羥基[SC97.3 (C-I)和64.7 (C-12)]。該化合物不 飽和度由兩個雙鍵，一個癸環(huán)，一個羰基和一個醚橋組成。通過HMBC譜和相應(yīng)氫譜及碳譜可 知 C-5 和 C-IO 形成醚橋。此外，Η-7 與 Η-9(δΗ1·29)，Η-7 與 Η-5，Η-9(δΗ1·29)與 Me-14 的 NOE 相 關(guān)性表明它們均為α構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁 數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗確定，理論值與實(shí)驗值 基本一致。
[0022] 該化合物化學(xué)式及碳原子編號如下：
[0023]
O
[0024] 實(shí)施例2:藥理作用
[0025] 本實(shí)施例使用皮下注射乙酰苯肼與腹腔注射環(huán)磷酰胺相結(jié)合的方法制備再生障 礙性貧血小鼠模型，觀察藥物增加血小板(PLT)計數(shù)，提高血清多能集落刺激因子(Mul t i-CSF)、紅細(xì)胞生成素(EPO)的含量等方面的抗再生障礙性貧血的作用。
[0026] 1、材料與方法
[0027] 1.1動物
[0028] ICR小鼠，雌雄各半，體重18g~22g，吉林大學(xué)實(shí)動物中心提供。
[0029] 1.2試劑與樣品
[0030] 鹽酸肼屈嗪購自中國藥品生物制品檢定所?；衔铮↖)自制，制備方法見實(shí)施例1。 復(fù)方阿膠漿：山東東阿阿膠股份有限公司產(chǎn)品；多能集落刺激因子(Multi-CSF)檢測試劑盒 和促紅細(xì)胞生成素（EPO)檢測試劑盒均為美國R&D公司產(chǎn)品；注射用環(huán)磷酰胺：Baxter Oncology GmbH公司產(chǎn)品；乙酰苯肼：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0031] 1.3儀器
[0032] 酶標(biāo)儀(BI0RAD-680型，日本）；血液分析儀(MEK-6318K型，日本）；臺式高速冷凍離 心機(jī)(Biofuge stratos型，德國）；恒溫箱(ULT1386-3-V41 型，美國）。
[0033] 1.4小鼠分組及模型制備
[0034] 小鼠隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為正常對照組、模型對照組、陽性對照組(復(fù)方 阿膠衆(zhòng)，50mg · kg'和鹽酸肼屈嗪組(80mg · kg<)、化合物⑴組(80mg · kg^1)、鹽酸肼屈嗪 與化合物（I)組合物組【40mg · kg4鹽酸肼屈嗪+40mg · kg"1化合物（I)】。采用皮下注射乙酰 苯肼與腹腔注射環(huán)磷酰胺相結(jié)合的方法復(fù)制貧血模型，具體方法:除空白對照組外，其余組 動物于實(shí)驗第2日，經(jīng)皮下注射乙酰苯肼20mg · kg^1，于第4日，再次皮下注射乙酰苯肼 40mg · kg-S同時從第4日起，動物經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺40mg · kg-S每日1次，連續(xù)4日?？瞻?對照組動物皮下注射等容量生理鹽水。于實(shí)驗第1天起開始按上述劑量灌胃給予受試藥物， 空白對照組與模型對照組小鼠給予等容量蒸餾水。每天1次，連續(xù)給藥14天。
[0035] 1.5外周血象測定實(shí)驗
[0036]末次給藥后30分，眶靜脈取血，血液分析儀檢測外周血，另取血液置入離心管管 內(nèi)，室溫靜置411后，250(^/1^11離心1〇1^11，分離出血清，-20°(：冰箱保存?zhèn)溆谩Ｑ悍治鰞x檢 測血小板(PLT)變化。
[0037] 1.6造血相關(guān)因子測定實(shí)驗
[0038]采用酶聯(lián)免疫法檢測動物血清多能集落刺激因子(Multi-CSF)，促紅細(xì)胞生成素 (EPO)的含量。
[0039] 1.7統(tǒng)計學(xué)方法
[0040]實(shí)驗數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X土s)表示，應(yīng)用SPSS18.0版統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差 分析和t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0041 ] 2、實(shí)驗結(jié)果
[0042] 2.1對再生障礙性貧血模型動物外周血象的影響
[0043]與正常對照組比較，模型對照組小鼠 PLT明顯減少(P<0.01);與模型對照組比較， 鹽酸肼屈嗪與化合物（I)組合物組和復(fù)方阿膠漿組PLT明顯增加(P<0.01);與模型對照組 比較，鹽酸肼屈嗪組、化合物（I)組PLT增加(P<0.05)。結(jié)果見表1。
[0044] 2.2對再生障礙性貧血模型小鼠血清Multi-CSF含量及血清EPO含量的影響
[0045] 與正常對照組比較，模型對照組小鼠的血清Multi-CSF含量(pg/ml)明顯降低(P< 0.01)，血清EPO含量也明顯降低(P<0.01)。與模型對照組比較，鹽酸肼屈嗪與化合物（I)組 合物組和復(fù)方阿膠漿組小鼠的血清Mul t i-CSF含量明顯升高(P<0.01)，血清EPO含量也明 顯升高(P < 〇. 〇 1);與模型對照組比較，鹽酸肼屈嗪組、化合物（I)組小鼠的血清Mu 11 i -CSF 含量升高(p<〇. 05)，血清EPO含量也升高(P<0.05)。結(jié)果見表1。
[0046] 表1對再生障礙性貧血模型小鼠 PLT、血清Multi-CSF含量及血清EPO含量的影響
[0048]機(jī)體造血是一個極其復(fù)雜的過程，其中與造血干祖細(xì)胞、骨髓造血的微環(huán)境和相 關(guān)造因子的作用關(guān)系密切，貧血主要由于骨髓紅系造血干祖細(xì)胞受到損害，或造血的微環(huán) 境改變而引起，表現(xiàn)為外周血紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞比容積異常。本研究外周 血檢測表明，模型組動物紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞比容均明顯低于同期對照組， 說明乙酰苯肼和環(huán)磷酰胺聯(lián)合給藥不僅可以造成血細(xì)胞的大量破壞，同時可能對骨髓造血 功能有明顯的抑制。各給藥組動物紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞比容增加，表明參紅 補(bǔ)血顆粒對動物的貧血狀態(tài)有明顯的改善作用。
[0049] 造血因子在骨髓造血功能中起重要的調(diào)節(jié)作用，其中多能集落刺激因子(Multi-CSF)是造血干細(xì)胞增殖分化的正性調(diào)節(jié)因子。它通過與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合傳遞生長、 分化信號，調(diào)控造血干細(xì)胞生存、增殖及向各系血細(xì)胞分化、成熟，主要由活化的CD4+T細(xì)胞 產(chǎn)生。此外，Multi-CSF還可調(diào)節(jié)多種成熟細(xì)胞的生長、分化及相關(guān)的基因表達(dá)，是造血功能 調(diào)節(jié)的重要影響因子。
[0050] 上述結(jié)果表明，鹽酸肼屈嗪、化合物（I)單獨(dú)作用時，對再生障礙性貧血具有治療 作用；鹽酸肼屈嗪和化合物（I)聯(lián)合作用時，對再生障礙性貧血的治療作用進(jìn)一步提高，可 以開發(fā)成治療再生障礙性貧血的藥物。
[0051] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物α)，2. -種鹽酸肼屈嗪的藥物組合物，其特征在于:包括鹽酸肼屈嗪、如權(quán)利要求1所述的 化合物(I)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鹽酸肼屈嗪的藥物組合物，其特征在于:藥學(xué)上可以接受的載 體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載 體或潤滑劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鹽酸肼屈嗪的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、 膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射 劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將布 渣葉粉碎，用70~90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用20%乙醇洗脫12個柱體積，再用80%乙醇洗脫 15個柱體積，收集80%洗脫液，減壓濃縮得80%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中80%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、40:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、20:1 和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合 的反相硅膠分離，用體積百分濃度為65%的甲醇水溶液等度洗脫，收集13~17個柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用80%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療再生障礙性貧血的藥物中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求2~4任一所述的鹽酸肼屈嗪的藥物組合物在制備治療再生障礙性貧血的 藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K31/502GK105859738SQ201610335172
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】黃芳
【申請人】黃芳