純化或檢測靶蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于純化或檢測存在于溶液中的靶蛋白的方法，所述方法包括：在進(jìn)行檢測或純化步驟之前，將所述溶液與和所述靶蛋白特異性結(jié)合的適體接觸的步驟，其中所述適體不與也可能存在于溶液中的與所述靶蛋白同源的任何蛋白結(jié)合。
【專利說明】純化或檢測靶蛋白的方法
[0001]本申請是申請日為2008年8月13日的、發(fā)明名稱為"純化或檢測靶蛋白的方法"的 中國專利申請 200880111453.4(PCT/FR2008/051495)的分案申請。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及純化和檢測蛋白質(zhì)的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及使用適體特異性地純 化或檢測介質(zhì)(特別是溶液）中的目的蛋白，在所述介質(zhì)中也可能包含與目的蛋白同源的蛋 白。
【背景技術(shù)】
[0003] 用于純化和檢測目的蛋白（也可被稱為"靶蛋白"）的方法通常包括將可能包含目 的蛋白的待測介質(zhì)與能結(jié)合所述目的蛋白的化合物接觸的步驟?？山Y(jié)合靶蛋白的這些化合 物可具有各種性質(zhì)。它們可以是（i)包含具有與蛋白結(jié)合的性質(zhì)的化學(xué)基團(tuán)的有機(jī)化合物 (例如DEAE、季銨、烷基鏈、硅烷醇或蛋白（例如抗體）、糖胺聚糖(肝素）、染料(汽巴藍(lán) F3GA)或核酸(例如適體）。
[0004] 用于純化或檢測靶蛋白的方法的有效性依賴于例如結(jié)合靶蛋白的化合物的親和 力和特異性。
[0005] 對于某些具有復(fù)雜組成的起始介質(zhì)，尤其是包含很多不同蛋白質(zhì)的起始溶液，純 化和檢測目的靶蛋白仍很困難。當(dāng)在復(fù)雜的起始介質(zhì)中待純化或檢測的靶蛋白與一種或多 種不同但彼此高度同源的蛋白共存時(shí)，這尤其是事實(shí)。實(shí)際上，當(dāng)靶蛋白和一種或多種與這 種靶蛋白同源的蛋白存在于溶液中時(shí)，開發(fā)通過使用常規(guī)純化或檢測方法能高水平地區(qū)分 感興趣的靶蛋白與不需要的同源蛋白的純化或檢測工具變得困難。即使抗體一一已知它們 對靶蛋白具有高特異性，也常常遭遇交叉反應(yīng)，包括與很多和靶蛋白具有結(jié)構(gòu)同源性的蛋 白的交叉反應(yīng)。
[0006] 難于特異性地純化或檢測彼此同源的蛋白質(zhì)的這種困難是許多應(yīng)用領(lǐng)域中的缺 陷，包括目的在于特異地研究靶蛋白（不管是否將與靶蛋白潛在同源的任何其它蛋白質(zhì)）的 學(xué)術(shù)研究領(lǐng)域，以及工業(yè)領(lǐng)域中，例如為了開發(fā)新的更有效的純化或檢測工具，以便與已知 的純化或檢測工具相比和管理或行政要求更為相容。
[0007] 當(dāng)?shù)鞍滓灾亟M形式(本文中稱為轉(zhuǎn)基因蛋白）在天然也表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因蛋白的同 源蛋白的轉(zhuǎn)基因生物或微生物中產(chǎn)生時(shí)，難于特異性地純化或檢測彼此同源的蛋白質(zhì)的困 難就會(huì)出現(xiàn)。這尤其包括，從固有地在其基因組中具有所謂的"直系同源"基因（編碼與轉(zhuǎn)基 因編碼的重組蛋白高度同源的蛋白）的生物中獲取重組蛋白時(shí)的情況。
[0008] 在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)的人或動(dòng)物轉(zhuǎn)基因蛋白常常與在該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中天然表達(dá) 的內(nèi)源性蛋白同源。在應(yīng)該避免轉(zhuǎn)基因蛋白與該天然的內(nèi)源性同源蛋白的共提取或共檢測 的情況下，該天然內(nèi)源性同源蛋白的產(chǎn)生構(gòu)成一個(gè)技術(shù)問題。
[0009] 當(dāng)轉(zhuǎn)基因重組蛋白是待用于制備藥物的治療性蛋白時(shí)，重組蛋白純化制品中存在 的任何與該轉(zhuǎn)基因蛋白同源的內(nèi)源性蛋白都可能在服用該藥物的患者中產(chǎn)生不想要的副 作用，包括誘導(dǎo)對該污染性天然蛋白的不想要的免疫應(yīng)答，這種免疫應(yīng)答可能損害醫(yī)學(xué)治 療的有效性，并且甚至有時(shí)會(huì)導(dǎo)致可能對患者健康潛在有害的自身免疫反應(yīng)。隨著在轉(zhuǎn)基 因動(dòng)物中生產(chǎn)的治療性轉(zhuǎn)基因蛋白的越來越多的使用，這些問題也越來越多地出現(xiàn)。因此， 為了獲得高度安全的治療性產(chǎn)品，應(yīng)當(dāng)特異性地純化轉(zhuǎn)基因蛋白，使之存在非常少量的不 想要的同源蛋白，并且如有可能，完全缺乏不想要的同源蛋白。確實(shí)，用于檢測感興趣的靶 蛋白的方法應(yīng)該是特異的、敏感的和有效的。
[0010]根據(jù)稱為SELEX的方法選擇的RNA型適體(單鏈核糖核酸分子），可與目的蛋白特異 地結(jié)合。在Liu等，RNA aptamers specific for bovine thrombin(對牛凝血酶有特異性的 RNA適體），J.Mol.Recognit.，2003:16,23-27中，作者給出了與牛凝血酶結(jié)合但不與人凝血 酶結(jié)合的RNA型適體。盡管單獨(dú)地該文獻(xiàn)顯示通過SELEX法可以選擇能辨別溶液中的同源蛋 白質(zhì)的高特異性RNA適體，但是至今為止尚無文獻(xiàn)描述過使用高特異性適體區(qū)分同源蛋白 的工業(yè)方法。
[0011] 高特異性適體的使用帶來了很多技術(shù)問題。首先，適體通過SELEX法在溶液中選 擇。為了適用于純化或檢測法，適體應(yīng)該被固定在固相支持體上。有很多出版物顯示，當(dāng)適 體被固定化時(shí)，適體的結(jié)合性質(zhì)(親和力、特異性......）會(huì)受到損害。此外，RNA型適體一在現(xiàn) 有技術(shù)中描述的唯一高特異性適體類型一一是非常不穩(wěn)定的分子，其在室溫會(huì)發(fā)生改變。 因此，RNA適體與工業(yè)純化或檢測方法并不相容。化學(xué)修飾的RNA可能是一個(gè)可選方式，但是 此類分子的目前合成成本無可爭議地與工業(yè)規(guī)模應(yīng)用不相容。
[0012] 因?yàn)榭贵w對目的蛋白的強(qiáng)親和力以及它們的相對高特異性，抗體被廣泛地用于蛋 白質(zhì)的純化和檢測方法中。
[0013] 然而，抗體并不總是適用于靶蛋白的純化或檢測。事實(shí)上，在生物系統(tǒng)中制備抗體 具有所有的固有缺陷，包括污染病原體的風(fēng)險(xiǎn)、或純化工程抗體的難度。此外，抗體通常是 免疫原性的，當(dāng)對患者施用時(shí)可能誘導(dǎo)強(qiáng)免疫反應(yīng)。因此，當(dāng)抗體用于純化治療性蛋白時(shí)， 存在抗體或抗體片段留在含治療性蛋白的溶液中并由此在服用這種溶液的患者中引起不 想要的反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。這就是為什么在純化方法中使用抗體難于與某些行政要求相容的原 因，特別是在農(nóng)業(yè)-食品和醫(yī)藥工業(yè)中。而且，還得指出：用于抗體的消毒方式是有限的，這 是因?yàn)榭贵w的敏感性蛋白性質(zhì)，尤其是（i)在變性條件下（例如在尿素、DMSO等存在下）、 (ii)使用高酸或堿PH值時(shí)、（iii)使用某些有害的有機(jī)溶劑時(shí)，或（iv)在高溫下。最后，值得 提醒的是，抗體的選擇是一個(gè)持久的過程(約6個(gè)月），而獲得純化抗體是一項(xiàng)復(fù)雜的工作， 這導(dǎo)致相對高的選擇和制備成本。
[0014] 因此，需要開發(fā)新的目的蛋白純化或檢測工具，其應(yīng)該是有效的、容易實(shí)現(xiàn)的，并 且與已知方法相比應(yīng)該更可靠。當(dāng)溶液也可能包含與靶蛋白同源的蛋白質(zhì)時(shí)，該改良方法 應(yīng)該能選擇性地純化或檢測存在于溶液中的靶蛋白。更特別地，需要開發(fā)新的純化或檢測 工具，其能提高自轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)治療性轉(zhuǎn)基因蛋白獲得的產(chǎn)品的人用安全性。
[0015] 發(fā)明概述
[0016] 本發(fā)明的目的是提供用于純化或檢測存在于溶液中的靶蛋白的方法，所述方法包 括:在進(jìn)行該檢測或純化步驟之前，使所述溶液接觸通過間隔區(qū)（spacer)固定在固相支持 體上的DNA適體的步驟，所述固定化適體與所述靶蛋白特異性結(jié)合，但不與也可能存在于該 溶液中的、與所述靶蛋白同源的任何蛋白結(jié)合。
[0017] 因此，本發(fā)明還涉及通過間隔區(qū)固定在固相支持體上的DNA適體的用途，所述固定 化適體與靶蛋白特異性結(jié)合，所述用途為用于純化或檢測存在于溶液中的所述靶蛋白，其 特征在于:所述固定化適體不結(jié)合與所述靶蛋白同源的蛋白并且所述溶液可包含至少一種 與所述靶蛋白同源的蛋白。
[0018] 本發(fā)明還涉及從包含所述靶蛋白且可能包含與所述靶蛋白同源的蛋白的溶液中 特異性純化靶蛋白的方法，其包括步驟：（i )提供固相支持體，該固相支持體包括通過間隔 區(qū)固定在所述固相支持體上的DNA適體，其特征在于:所述固定化適體與所述靶蛋白特異性 結(jié)合，但不結(jié)合與所述靶蛋白同源的蛋白，（i i)將所述固相支持體接觸所述溶液，和（i i i) 回收與所述適體結(jié)合的靶蛋白。
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及從包含所述靶蛋白且可能包含與所述靶蛋白同源的蛋白的溶 液中特異性檢測靶蛋白的方法，其包括步驟：（i)將所述溶液接觸通過間隔區(qū)固定在固相支 持體上的DNA適體，所述固定化適體與所述靶蛋白特異性結(jié)合，但不結(jié)合與靶蛋白同源的所 述蛋白，和（ii)檢測在所述適體與所述靶蛋白之間形成的復(fù)合物。
[0020] 附圖簡述
[0021] 圖1顯示特異性結(jié)合人因子VII的適體與人血漿來源的FVII(HP FVII)之間的結(jié) 合。圖1的曲線說明人抗-FVII適體與HP FVII之間隨時(shí)間的結(jié)合，其中HP FVII濃度范圍為 50至400nM。
[0022] 圖2顯示固定在芯片上的適體與HP FVII之間的相互作用的特異性。圖2表明在存 在或不存在多克隆抗-FVII抗體時(shí)，固定在芯片上特異性結(jié)合人因子VII的適體與HP FVII 之間隨時(shí)間的結(jié)合。
[0023]圖3顯示與人因子VII特異性結(jié)合的適體和兔血漿來源的FVII之間缺乏結(jié)合。圖3 的曲線說明特異性結(jié)合人因子VII的適體與兔血漿來源的因子VII之間隨時(shí)間的結(jié)合，其中 兔因子VII的濃度范圍為50至400nM。
[0024] 圖4顯示特異性結(jié)合人因子VII的適體與HP FVII、兔因子VII或轉(zhuǎn)基因人因子VII 之間的親和力的差異。圖4曲線說明特異性結(jié)合人因子VII的適體與HP FVII、兔因子VII或 轉(zhuǎn)基因人因子VII之間隨時(shí)間的結(jié)合，其中每種FVII的濃度為400nM。
[0025] 發(fā)明詳述
[0026] 本發(fā)明提供用于純化或檢測存在于溶液中的靶蛋白的方法，所述方法包括:在進(jìn) 行檢測或純化步驟之前，將所述溶液接觸通過間隔區(qū)固定在固相支持體上的DNA適體的步 驟，所述固定化適體與所述靶蛋白特異性結(jié)合，但不與也可能存在于該溶液中的任何與所 述靶蛋白同源的蛋白結(jié)合。
[0027] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過間隔區(qū)固定在固相支持體上的DNA適體的用途，所述固定 化適體與靶蛋白特異性結(jié)合，用于純化或檢測存在于溶液中的所述靶蛋白，其特征在于:所 述固定化適體不結(jié)合與所述靶蛋白同源的蛋白并且所述溶液可包含至少一種與所述靶蛋 白同源的蛋白。
[0028] 在用于純化感興趣的靶蛋白的方法中，當(dāng)靶蛋白包含于起始介質(zhì)（通常是起始溶 液）中時(shí)，在(i)特異性識(shí)別該給定的靶蛋白的適體和(ii)所述靶蛋白之間選擇性地形成復(fù) 合物。之后，通過使所述適體與前面形成的復(fù)合物解離，回收待純化的靶蛋白。
[0029] 在用于檢測感興趣的靶蛋白的方法中，當(dāng)靶蛋白包含于起始介質(zhì)（通常是起始溶 液）中時(shí)，在（i)特異性識(shí)別給定靶蛋白的適體和（ii)所述靶蛋白之間選擇性地形成復(fù)合 物。之后，檢測尤其是（i)在所述適體與所述感興趣的蛋白之間形成的復(fù)合物、或（ii)與所 述適體復(fù)合的、或在之前形成的復(fù)合物解離后為游離形式的、感興趣的靶蛋白。
[0030] 本發(fā)明的另一目的是，提供從包含靶蛋白且可能包含與所述靶蛋白同源的蛋白的 溶液中特異性純化靶蛋白的方法，其包括以下步驟：
[0031] a)提供固相支持體，其包括通過間隔區(qū)固定在所述固相支持體上的DNA適體，特征 在于:所述固定化適體與所述靶蛋白特異性結(jié)合，但不結(jié)合與所述靶蛋白同源的蛋白，
[0032] b)將所述固相支持體接觸所述溶液，和
[0033] c)回收與所述適體結(jié)合的靶蛋白。
[0034] 本發(fā)明的進(jìn)一步目的是，提供從包含靶蛋白且可能包含與所述靶蛋白同源的蛋白 的溶液中特異性檢測靶蛋白的方法，其包括以下步驟：
[0035] a)將所述溶液接觸通過間隔區(qū)固定在固相支持體上的DNA適體，所述固定化適體 與所述靶蛋白特異性結(jié)合，但不結(jié)合與所述靶蛋白同源的蛋白，和
[0036] b)檢測在所述適體與所述靶蛋白之間形成的復(fù)合物。
[0037] 如本文所用，"適體"旨在指單鏈核酸分子，其能夠與蛋白特異性結(jié)合。適體通常包 括5至120個(gè)核苷酸，并且可通過稱為SELEX(通過指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化配體）的方法體外選擇。 適體具有很多優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)樗鼈兊墓押塑账嵝再|(zhì)，所以適體具有低免疫原性，并且對苛刻的物 化條件(存在尿素、DMS0、強(qiáng)酸或堿pH值，使用有機(jī)溶劑或高溫)具有高抵抗力，當(dāng)其用作親 和配體時(shí)，這使得多種消毒(sanitization)策略可以實(shí)施。此外，它們具有高度選擇性。最 后，適體的生產(chǎn)具有相對適中的成本。
[0038]如本文所用，"DNA適體"旨在指由脫氧核糖核苷酸組成的適體，與由核糖核苷酸組 成的RNA適體相對。DNA適體在溶液中有利地穩(wěn)定，因此可工業(yè)應(yīng)用在靶蛋白的純化或檢測 中。
[0039]如本文所用，"蛋白"是指氨基酸的聚合物。這包括蛋白、蛋白片段、遺傳修飾的蛋 白、寡肽及其類似物。蛋白可以是抗體、抗病毒蛋白、激素、生長因子、凝血因子例如因子VII (FVII)、因子VIIKFVIII)、因子X(FX)、因子IX(因子IX)、因子XI (FXI)、因子XII(FXII)、因 子XIII (FXIII)、因子II (凝血酶）、抗凝血酶III (AT III)、肝素輔因子II (HCII)、蛋白C (PC)、凝血調(diào)節(jié)蛋白（TM)、蛋白S(PS)、因子V(FV)、von Willebrand因子(FvW)和組織因子途 徑抑制劑(TFPI)。優(yōu)選該蛋白為天然或修飾的因子VII或其片段。
[0040] 如前所述，"通過間隔區(qū)固定在固相支持體上的DNA適體"（之后也稱為"適體"）用 于本發(fā)明的方法，其能與給定靶蛋白選擇性結(jié)合，所述適體對所述給定靶蛋白的"同源"蛋 白具有降低的結(jié)合能力或無結(jié)合能力。這意味著，根據(jù)本發(fā)明，僅使用如下適體:該適體能 夠顯著地區(qū)分感興趣的靶蛋白和不同于所述靶蛋白但與所述靶蛋白結(jié)構(gòu)接近的蛋白。
[0041] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，用于區(qū)分靶蛋白與靶蛋白的"同源"蛋白的適體具有 這樣的能力，即，所述適體對感興趣的靶蛋白具有親和力，通過解離常數(shù)值(Kd)(以摩爾濃 度表示)定義的該親和力與所述適體對最接近的已知"同源"蛋白的解離常數(shù)值相比低至少 一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0042] 在本發(fā)明的一些其它實(shí)施方案中，適體不與感興趣的靶蛋白的"同源"蛋白結(jié)合。 根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)通過常規(guī)測量方法(例如根據(jù)Biacore?型檢測和結(jié)合測量技術(shù))不能檢測 到適體與同源蛋白的結(jié)合時(shí)，該適體不與同源蛋白結(jié)合。作為舉例，在實(shí)施例中已經(jīng)證實(shí)， 當(dāng)使用結(jié)合測量系統(tǒng)Bkcore?時(shí)，與人因子VII選擇性結(jié)合的seq id no.1的適體不以可 檢測的方式與兔因子VII結(jié)合。
[0043]適體選擇性結(jié)合的"靶蛋白"可以是任何類型的蛋白。靶蛋白尤其可以是治療性蛋 白。
[0044] "同源蛋白"或"與靶蛋白同源的蛋白"是指與靶蛋白具有顯著的結(jié)構(gòu)同源性的蛋 白。
[0045] 如本文所用，"同源"旨在主要指兩種同源，分別是⑴由靶蛋白與同源蛋白之間的 氨基酸序列差異引起的同源，和（ii)由共價(jià)結(jié)合在氨基酸側(cè)鏈上的附加化學(xué)基團(tuán)的差異 (包括糖鏈(C.h:ain:es〇s idi ques)的差異）引起的同源。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說清楚明顯的 是，感興趣的靶蛋白和"同源"蛋白可以彼此不同于氨基酸序列的差異和糖鏈的差異。作為 舉例說明，當(dāng)氨基酸序列的差異發(fā)生在靶蛋白或同源蛋白的糖基化位點(diǎn)的氨基酸上時(shí)，可 能碰上兩種類型的結(jié)構(gòu)差異。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明，給定的靶蛋白和相應(yīng)的同源蛋白可以包含彼此具有至少50%氨基酸 同一性的序列。根據(jù)本發(fā)明，兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的同一性百分比 可通過使用具有缺省參數(shù)的Emboss匹配器一EBL0SUM62來計(jì)算，其中Gap_罰分為10.0和 Extend_罰分為0.5〇
[0047] 優(yōu)選，靶蛋白與同源蛋白之間的氨基酸序列同一性為至少50 %、55 %、60%、65 %、 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0048] 如前所示，感興趣的靶蛋白與同源蛋白之間的差異可能產(chǎn)生于兩種蛋白之間的糖 基化差異。糖基化的差異涉及具有相同的氨基酸序列或具有相似的氨基酸序列但是不同的 聚糖結(jié)構(gòu)的兩個(gè)蛋白。聚糖結(jié)構(gòu)為被移植到蛋白的氨基酸共有序列上的糖鏈。糖基化差異 可涉及N-或0-糖基化以及在N-或0-糖基化后發(fā)生的糖苷分支。糖基化的差異不僅可以涉及 有或沒有這些鏈或支鏈，而且可以涉及有或沒有某些糖(例如巖藻糖、甘露糖、葡糖胺或半 乳糖胺殘基）。可用許多方法分析蛋白的糖基化。一種糖基化分析方法包括:使用一種或多 種酶(PNGaseF、N-糖苷酶)或通過化學(xué)途徑(肼解、β-消除）將蛋白脫糖基化，然后直接分析 在凝膠、毛細(xì)管電泳或HPLC上獲得的聚糖（用紫外、熒光或MS檢測）或在酶介導(dǎo)的解聚(神經(jīng) 氨酸酶和β-半乳糖苷酶)或化學(xué)誘導(dǎo)的解聚(肼解，β-消除)之后分析以便對所述聚糖定序。 另一種分析方法為:對全蛋白使用質(zhì)譜法，這些技術(shù)被稱為MALDI(基質(zhì)輔助激光解吸/電 離）、MALDI-T0F(飛行時(shí)間）、ESI(電噴霧離子化）。
[0049] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的適體為與凝血因子特異性結(jié)合的適 體，所述凝血因子選自因子VIKFVII)、因子VIII(FVIII)、因子X(FX)、因子IX(因子IX)、因 子XI(FXI)、因子XII(FXII)、因子Xin(FXIII)、因子11(凝血酶）、抗凝血酶IIKAT III)、肝 素輔因子II (HCII)、蛋白C(PC)、凝血調(diào)節(jié)蛋白（TM)、蛋白S (PS)、因子V(FV)、von Willebrand因子(FvW)和組織因子途徑抑制劑(TFPI)。有益地，適體與FVII特異性結(jié)合。優(yōu) 選，根據(jù)本發(fā)明的適體與人因子VII特異性結(jié)合，但不與兔因子VII結(jié)合。反過來，根據(jù)本發(fā) 明的適體可以與兔因子VII結(jié)合，但不與人因子VII結(jié)合。
[0050] 與人因子VII特異性結(jié)合但不與兔因子VII結(jié)合的適體可以是包含與序列SEQ ID No. 1具有至少80%核苷酸同一性的核苷酸序列的適體。
[0051]有益地，本發(fā)明的適體以如下解離常數(shù)值(Kd)表征的親和力與靶蛋白結(jié)合，該解 離常數(shù)值為IpM至ΙΟμΜ、優(yōu)選為IOnM至ΙΟμΜ。有益地，適體對靶蛋白的親和力與適體對同源 蛋白的親和力相比高1000至10000倍。
[0052]在根據(jù)本發(fā)明的純化或檢測方法中，DNA適體通過間隔區(qū)固定于固相支持體上。固 定于固相支持體上的適體特別適合于檢測或純化存在于溶液中的靶蛋白。
[0053]如本文所用，"間隔區(qū)"是指在適體與固相支持體之間插入的分子。有益地，該間隔 區(qū)與適體的一個(gè)末端以及與固相支持體結(jié)合。有益地，包括間隔區(qū)的這些結(jié)構(gòu)不直接固定 適體在固相支持體上。間隔區(qū)的性質(zhì)可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)選擇;優(yōu)選該間隔區(qū)為 非特異性寡核苷酸序列或聚乙二醇(PEG)。當(dāng)其為非特異性寡核苷酸序列時(shí)，所述序列優(yōu)選 含有至少5個(gè)核苷酸、優(yōu)選5個(gè)至15個(gè)核苷酸。
[0054] 為了固定適體在間隔區(qū)上，適體可用各種化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，例如能共價(jià)固 定適體的基團(tuán)，例如硫醇、胺或任何其它能與存在于支持體上的化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)的基團(tuán)，或能 非共價(jià)固定適體的基團(tuán)，例如生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)。這些技術(shù)也可用于固定間隔區(qū)到固 相支持體上。
[0055] -旦通過間隔區(qū)固定在固相支持體上，有利地適體在其自由端（即不與間隔區(qū)結(jié) 合的末端)被修飾，包括但不限于:化學(xué)修飾的核苷酸(例如2 氧甲基或2 氟嘧啶、2 核 糖噪呤、亞磷酰胺）、反轉(zhuǎn)核苷酸(reversed nucleotide)、或化學(xué)基團(tuán)（PEG、聚陽離子、膽固 醇）。這些修飾能保護(hù)適體免遭酶促降解。
[0056] 固相支持體可以是親和色譜柱，包括源于瓊脂糖或纖維素的凝膠或合成凝膠，例 如丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯或苯乙烯衍生物;芯片，例如適于表面等離子共振的芯片;膜，例 如聚酰胺、聚丙烯腈或聚酯膜;磁性或順磁性珠。
[0057]有益地，包含靶蛋白且可包含與所述靶蛋白同源的蛋白的溶液是生物溶液，例如 體液、細(xì)胞、細(xì)胞勻漿物、組織、組織勻漿物、器官或整個(gè)生物體。優(yōu)選溶液是獲自動(dòng)物的液 態(tài)生物溶液，例如血、血源性產(chǎn)品、哺乳動(dòng)物乳或哺乳動(dòng)物乳來源的產(chǎn)品?？梢允茄獫{、血漿 冷凍沉淀物、澄化的乳(clarified milk)或其衍生物。根據(jù)本發(fā)明的動(dòng)物是沒有葉綠體的、 活的多細(xì)胞的、非人真核生物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該溶液從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲得。有益 地，該溶液是哺乳動(dòng)物乳或轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物乳來源的產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是哺乳 動(dòng)物，例如奶牛、山羊、雌兔、豬、猴、大鼠、小鼠、或鳥、或昆蟲例如蚊、蠅或蠶。在優(yōu)選的實(shí)施 方案中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因雌兔。有益地，該轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物在 能使所述轉(zhuǎn)基因蛋白在所述轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳中表達(dá)的特異性啟動(dòng)子控制下，在乳腺中 廣生轉(zhuǎn)基因蛋白。
[0058]在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因蛋白的方法可包括以下步驟:將包含編碼轉(zhuǎn)基因 蛋白的基因的DNA分子注射到非人哺乳動(dòng)物的胚胎中，其中所述基因在編碼天然分泌于乳 中的蛋白的基因的啟動(dòng)子(例如酪蛋白啟動(dòng)子、酪蛋白啟動(dòng)子、乳清蛋白啟動(dòng)子、乳球 蛋白或乳清酸性蛋白啟動(dòng)子(WAP))的控制下。然后將胚胎插入到相同物種的哺乳動(dòng)物雌性 中。在胚胎來源的哺乳動(dòng)物充分發(fā)育后，在該哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)泌乳，之后收集乳。該乳包含 所述轉(zhuǎn)基因蛋白。
[0059]在EP 0 527 063中給出在非人哺乳動(dòng)物雌性的乳中生產(chǎn)蛋白的方法的實(shí)例，可重 復(fù)該實(shí)例的教導(dǎo)以制備本發(fā)明的蛋白。含WAP啟動(dòng)子的質(zhì)粒可以通過引入包含WAP基因啟動(dòng) 子的序列而獲得，制備這種質(zhì)粒以便接收外源基因置于WAP基因啟動(dòng)子的控制下。使用含啟 動(dòng)子以及編碼本發(fā)明蛋白的基因的質(zhì)粒，通過顯微注射到雌兔胚胎的雄性原核中，獲得轉(zhuǎn) 基因雌兔。然后將該胚胎轉(zhuǎn)移至激素預(yù)備的雌體的輸卵管中。轉(zhuǎn)基因的存在可以基于由出 生的轉(zhuǎn)基因幼兔提取的DNA，通過DNA印跡法揭示。通過特異性放射免疫試驗(yàn)可以確定哺乳 動(dòng)物乳中的濃度。
[0060] 其它文獻(xiàn)也描述了在非人哺乳動(dòng)物雌性的乳中獲得蛋白的方法?？梢蕴峒暗奈墨I(xiàn) 包括，但不限于，US 7,045,676(轉(zhuǎn)基因小鼠）和EP 1 739 170(轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)von Willebrand因子）。
[0061] 因此，本發(fā)明的再一目的是，提供通過間隔區(qū)固定在固相支持體上的DNA適體的用 途，所述固定化適體與人因子VII特異性結(jié)合，用于純化或檢測存在于轉(zhuǎn)基因雌兔乳中的所 述人因子VII，特征在于:所述固定化適體不與兔因子VII結(jié)合，并且所述轉(zhuǎn)基因雌兔乳中可 包含兔因子VII。
[0062]本發(fā)明的進(jìn)一步目的是，提供通過間隔區(qū)固定在固相支持體上的DNA適體的用途， 所述固定化適體與兔因子VII特異性結(jié)合，用于檢測可能存在于轉(zhuǎn)基因雌兔乳中的所述兔 因子VII，特征在于:所述固定化適體不與人因子VII結(jié)合，并且在所述轉(zhuǎn)基因雌兔乳中包含 人因子VII。
[0063] 人因子VII和兔因子VII具有約75%的氨基酸序列同源性(通過BLAST確定的）。
[0064]本發(fā)明的進(jìn)一步目的是，提供選擇與靶蛋白特異性結(jié)合但不結(jié)合與所述靶蛋白同 源的蛋白的適體的方法，其包括以下步驟：
[0065] a)在有利于結(jié)合的條件下將適體混合物接觸與靶蛋白同源的所述蛋白，并回收不 與同源蛋白結(jié)合的那些適體，
[0066] b)在有利于結(jié)合的條件下將步驟a)中所得的適體混合物接觸所述靶蛋白，
[0067] c)將那些未結(jié)合的適體從那些與所述靶蛋白結(jié)合的適體中分離，
[0068] d)解離適體-靶蛋白對，
[0069] e)擴(kuò)增解離的適體以獲得富含適體的混合物，其與靶蛋白結(jié)合但不結(jié)合與靶蛋白 同源的蛋白，和
[0070] 0按需重復(fù)步驟8)、13)、(3)、(1)、幻多個(gè)循環(huán)，直至獲得與靶分子特異性結(jié)合但不結(jié) 合與所述靶蛋白同源的蛋白的適體。
[0071] 用于選擇本發(fā)明適體的方法與現(xiàn)有技術(shù)中所述的SELEX法有不少相同之處，但是 其額外地包括所謂的"扣除"步驟(步驟a)。因此，本發(fā)明的方法稱為"扣除SELEX"。
[0072]適體選擇SELEX法為:將蛋白接觸DNA或RNA核酸組合文庫(通常為IO15分子），去除 不與靶結(jié)合的核酸，分離并擴(kuò)增與靶結(jié)合的核酸。重復(fù)該方法直至溶液充分地富含對目的 蛋白具有良好親和力的核酸(Tuerk和Gold，"通過指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化配體:噬菌體T4DNA聚 合酉每的RNA配體（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase)"（1990)Science，249(4968):505-10以 及Ellington和Szostak，"體外選擇結(jié)合特異性配體的RNA分子（In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands)"（1990)Nature Aug 30;346(6287):818-22)。SELEX法的其它實(shí)例在EP 0 786 469、EP 668 931、EP 1 695 978、EP 1 493 825中給 出，其教導(dǎo)可被重新用于實(shí)施本發(fā)明的適體選擇方法。
[0073] 可通過任何能從不與靶蛋白結(jié)合的適體中分離出與靶蛋白結(jié)合的適體(稱為適 體-靶蛋白對）的方法，實(shí)現(xiàn)分離步驟(步驟c)?？赏ㄟ^很多現(xiàn)有技術(shù)已知的方法進(jìn)行該分 離。因此，適體-靶蛋白對可被保留在硝酸纖維素濾膜上，而游離適體則不被保留。特異性保 留適體-靶蛋白對的柱也可用于該分離步驟。也可使用其它方法，如液-液萃取、凝膠迀移檢 測或密度梯度離心。分離方法的選擇將取決于靶蛋白的性質(zhì)以及適體-靶蛋白對，可以基于 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的原則作出決定。
[0074] 解離步驟(步驟d)可通過任何能使所述化學(xué)物解離的方法實(shí)現(xiàn)。有益地，解離可通 過離子強(qiáng)度的增加或pH值的變化而發(fā)生。
[0075] 可通過任何能增加適體拷貝的量或數(shù)目的方法，實(shí)現(xiàn)步驟e)的擴(kuò)增。有益地，適體 的擴(kuò)增通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))來進(jìn)行。有益地，擴(kuò)增通過用于DNA的PCR或通過用于RNA的 RT-PCR來實(shí)現(xiàn)。
[0076] "扣除SELEX"法的特征在于稱為"扣除"的步驟(步驟a)，其能去除結(jié)合與靶蛋白同 源的蛋白的適體。在進(jìn)行包括步驟 &)士）、(3)、(1)和幻的一個(gè)循環(huán)后，以下循環(huán)可重頭包括步 驟8)、13)、(3)、(1)和幻，或者可用在之前循環(huán)的步驟幻中擴(kuò)增的適體合并物從步驟13)直接開 始。因此，可以在每個(gè)新循環(huán)的開始執(zhí)行扣除步驟a)，或者可以在完成至少一個(gè)無步驟a)的 循環(huán)后執(zhí)行扣除步驟a)，直至獲得與靶蛋白特異性結(jié)合但不結(jié)合與靶蛋白同源的蛋白的適 體。有益地，每二個(gè)或每三個(gè)循環(huán)進(jìn)行一個(gè)步驟a)。
[0077] 以下實(shí)施例舉例說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例
[0078] 實(shí)施例1:適體(SEQ No. 1)與人因子VII的結(jié)合
[0079] 包含SEQ ID No. 1的適體由Sigma-Proligo公司合成。
[0080] SEQ No.l:
[0081 ] 5 ' PGGGAGAGAGGAAGAGGGAUGGGAGCCUAUGUAACAGAUGCAGAUCCCUAGUCGUCCCAACACCAUA AC_3'_生物素
[0082]該適體通過嫁接生物素在其3'-端被修飾。粗體的核苷酸堿基(SEQ No. 1)被2'-氧 甲基化，這可以通過使適體對核酸酶更具有抵抗力而使適體穩(wěn)定。然后將該適體固定在含 有親和素的SA芯片(Biacore GE)上。由此，以2700RU的固定率(其中IRU約相當(dāng)于Ipg固定化 產(chǎn)品/mm2)，通過適體的3 ' -端，定向固定該適體。
[0083] 將純化的人血漿來源的因子VIKHP FVII，純度:99%)用運(yùn)行緩沖液(Hepes 20mM pH=8，NaCl 50mM，CaCl2 2mM和BSA 0.01%)稀釋，從而獲得其中該人血漿來源的因子VII 的濃度水平為50、100、200和400nM的四個(gè)樣品。將每個(gè)樣品相繼注射到相同的含通過生物 素-鏈霉親和素相互作用固定的適體的芯片中。通過注射僅含有運(yùn)行緩沖液的空白而獲得 對照。在以20μ1/π?η的流速注射運(yùn)行緩沖液到芯片240秒后，以相同的流速進(jìn)行所有注射 120秒。然后以30μ1/π?η的流速注射洗脫緩沖液(NaCl，5Μ)達(dá)60秒，以將人血漿來源的因子 VII與適體解偶聯(lián)。一式兩份進(jìn)行每次注射(樣品和空白）。芯片使得可以通過表面等離子共 振(RPS)實(shí)時(shí)觀察人血漿源因子VII與固定化適體之間的相互作用的產(chǎn)生和破壞。與固定化 適體的結(jié)合導(dǎo)致由該裝置記錄的以共振單位(RU)表達(dá)的信號(hào)的增加（圖1)。用RPS Biacore TlOO裝置(GE)實(shí)施這些測量。借助于Biaevaluation軟件(GE)，對所記錄的相互作用進(jìn)行建 模。根據(jù)別構(gòu)結(jié)合建模，估計(jì)適體與HP FVII的結(jié)合的Kd值為1.4μΜ。
[0084]為了證實(shí)與固定化適體結(jié)合的產(chǎn)品實(shí)際上為因子VII，在相同的芯片上進(jìn)行包括 (i)人血漿源因子VII 200ηΜ和（ii)抗-FVII多克隆抗體IOOnM(Abcam)的注射序列。注射和 分析條件如上文所述的那些相同。如果適體實(shí)際上保留FVII，那么抗-FVII多克隆抗體注射 應(yīng)該在抗體與結(jié)合適體的FVII結(jié)合之后引起信號(hào)增加(RU)?？贵w單獨(dú)被注射作為對照。以 RU表達(dá)的信號(hào)增加清楚地顯示所述適體識(shí)別FVII(圖2)。
[0085]此實(shí)施例顯示固定化后的適體可以以顯著的親和力與人血漿來源的因子VII特異 性結(jié)合。
[0086] 實(shí)施例2:適體(SEQ No. 1)與兔因子VII的結(jié)合
[0087] 將兔血漿來源的因子VII(American Diagnostica)在如實(shí)施例1相同的緩沖液中 稀釋成50、100、200、400nM的濃度水平，之后在如實(shí)施例1相同的條件下注射到包含固定化 適體的相同芯片中。
[0088]圖3中所示的記錄的RU信號(hào)說明，完全不存在適體與兔血漿來源的FVII的結(jié)合，盡 管兔血漿來源的FVII與人血漿來源的FVII之間存在高氨基酸序列同源性(氨基酸序列同源 性約為75%)。
[0089]此實(shí)施例顯示，該適體與人血漿來源的FVII特異性結(jié)合，但不與兔因子VII結(jié)合。 [0090] 實(shí)施例3:適體（SEQ No. 1)在人血漿源因子VII、轉(zhuǎn)基因因子VII和兔血漿源因子 VII之間的親和力差異
[0091] 在與實(shí)施例1相同的條件下，將人血漿源因子VII、兔血漿源因子VII和人轉(zhuǎn)基因因 子VII相繼注射到相同的芯片中。所得的數(shù)據(jù)（圖4)顯示，適體與HP FVII和轉(zhuǎn)基因 FVII結(jié) 合一一具有不同但仍強(qiáng)的親和力，但該適體不與兔因子VII結(jié)合。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于純化或檢測存在于溶液中的靶蛋白的方法，所述方法包括:在進(jìn)行檢測或純化 步驟之前，將所述溶液接觸通過間隔區(qū)固定在固相支持體上的DNA適體的步驟，所述固定化 適體與所述靶蛋白特異性結(jié)合，但不與所述靶蛋白的任何同源蛋白結(jié)合，該同源蛋白也可 存在于該溶液中。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于:所述靶蛋白與所述同源蛋白具有超過50%、優(yōu) 選超過60 %、優(yōu)選超過70 %、優(yōu)選超過80 %、優(yōu)選超過90 %的氨基酸序列同一性。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于:所述靶蛋白與所述同源蛋白具有糖基化同 源性。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)的方法，其特征在于:所述靶蛋白為凝血因子，其選自因 子VII(FVII)、因子VIII(FVIII)、因子X(FX)、因子IX(因子IX)、因子XI(FXI)、因子XII (FXII)、因子XIII(FXIII)、因子11(凝血酶）、抗凝血酶IIKAT III)、肝素輔因子II(HCII)、 蛋白C(PC)、凝血調(diào)節(jié)蛋白（TM)、蛋白S(PS)、因子V(FV)、von Willebrand因子(FvW)和組織 因子途徑抑制劑(TFPI)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于:所述靶蛋白為人因子VII或兔因子VII。6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于:所述同源蛋白為兔因子VII或人因子VII。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其特征在于:所述適體包括與SEQ ID No. 1具有至少80% 同一1性的核苷酸序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)的方法，其特征在于:所述固相支持體選自芯片、親和色 譜柱、磁性或順磁性珠和膜。9. 根據(jù)權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)的方法，其特征在于:所述間隔區(qū)選自非特異性寡核苷 酸序列或聚乙二醇(PEG)類型的序列。10. 根據(jù)權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)的方法，其特征在于:所述溶液為體液，尤其是乳、乳源 產(chǎn)品、血或血源產(chǎn)品。11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于:所述溶液為轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物乳或轉(zhuǎn)基因哺乳 動(dòng)物乳來源的產(chǎn)品。12. 用于從包含靶蛋白且可包含與所述靶蛋白同源的蛋白的溶液中特異性純化靶蛋白 的方法，其包括以下步驟： a) 提供固相支持體，其包括通過間隔區(qū)固定在所述固相支持體上的DNA適體，特征在 于:所述固定化適體與所述靶蛋白特異性結(jié)合，但不結(jié)合與所述靶蛋白同源的蛋白， b) 將所述固相支持體接觸所述溶液，和 c) 回收與所述適體結(jié)合的靶蛋白。13. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于:所述靶蛋白與所述同源蛋白具有超過50%、 優(yōu)選超過60 %、優(yōu)選超過70 %、優(yōu)選超過80 %、優(yōu)選超過90 %的氨基酸序列同一性。14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13的方法，其特征在于:所述靶蛋白為凝血因子，其選自因子VII (FVII)、因子 VIII(FVIII)、因子 X(FX)、因子 IX(因子 IX)、因子 XI(FXI)、因子 XII(FXII)、因 子父111卬乂111)、因子11(凝血酶）、抗凝血酶111(六1'111)、肝素輔因子11(!1(：11)、蛋白〇 (PC)、凝血調(diào)節(jié)蛋白（TM)、蛋白S(PS)、因子V(FV)、von Willebrand因子(FvW)和組織因子途 徑抑制劑(TFPI)，優(yōu)選人或兔因子VII。15. 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征在于:所述適體包括與SEQ ID No. 1具有至少80% 同一1性的核苷酸序列。16. 根據(jù)權(quán)利要求12~15中任一項(xiàng)的方法，其特征在于:所述固相支持體選自芯片、親 和色譜柱、磁性或順磁性珠和膜。17. 根據(jù)權(quán)利要求12~16中任一項(xiàng)的方法，其特征在于:所述間隔區(qū)選自非特異性寡核 苷酸序列或聚乙二醇(PEG)類型的序列。18. 根據(jù)權(quán)利要求12~17中任一項(xiàng)的方法，其特征在于:所述溶液為體液，尤其是乳、乳 源產(chǎn)品、血或血源產(chǎn)品。19. 根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于:所述乳為轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物乳或轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng) 物乳來源的產(chǎn)品。20. 用于從包含靶蛋白且可包含與所述靶蛋白同源的蛋白的溶液中特異性檢測靶蛋白 的方法，其包括以下步驟： a) 將所述溶液接觸通過間隔區(qū)固定在固相支持體上的DNA適體，所述固定化適體與所 述靶蛋白特異性結(jié)合，但不結(jié)合與所述靶蛋白同源的所述蛋白，和 b) 檢測在所述適體與所述靶蛋白之間形成的復(fù)合物。21. 根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其特征在于:所述靶蛋白與所述同源蛋白具有超過50%、 優(yōu)選超過60 %、優(yōu)選超過70 %、優(yōu)選超過80 %、優(yōu)選超過90 %的氨基酸序列同一性。22. 根據(jù)權(quán)利要求20或21的方法，其特征在于:所述靶蛋白為凝血因子，其選自因子VII (FVII)、因子 VIII(FVIII)、因子 X(FX)、因子 IX(因子 IX)、因子 XI(FXI)、因子 XII(FXII)、因 子父111卬乂111)、因子11(凝血酶）、抗凝血酶111(六1'111)、肝素輔因子11(!1(：11)、蛋白〇 (PC)、凝血調(diào)節(jié)蛋白（TM)、蛋白S(PS)、因子V(FV)、von Willebrand因子(FvW)和組織因子途 徑抑制劑(TFPI)，優(yōu)選人或兔因子VII。23. 根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其特征在于:所述適體包括與SEQ ID No. 1具有至少80% 同一1性的核苷酸序列。24. 根據(jù)權(quán)利要求20~23中任一項(xiàng)的方法，其特征在于:所述固相支持體選自芯片、親 和色譜柱、磁性或順磁性珠和膜。25. 根據(jù)權(quán)利要求20~24中任一項(xiàng)的方法，其特征在于:所述間隔區(qū)選自非特異性寡核 苷酸序列或聚乙二醇(PEG)類型的序列。26. 根據(jù)權(quán)利要求20~25中任一項(xiàng)的方法，其特征在于:所述溶液為體液，尤其是乳、乳 源產(chǎn)品、血或血源產(chǎn)品。27. 根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其特征在于:所述乳為轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物乳或轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng) 物乳來源的產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】C12N15/115GK105859829SQ201610206748
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2008年8月13日
【發(fā)明人】L·塞列特, A·施圖魯, F·戴諾, G·佩雷
【申請人】法國血液分割暨生化制品實(shí)驗(yàn)室