次血紅素分子與肽偶聯(lián)的方法、環(huán)化次血紅素肽及其制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種次血紅素分子與肽鏈偶聯(lián)的方法；以及環(huán)化的次血紅素肽及其制備方法和用途。次血紅素分子與肽鏈的偶聯(lián)方法包括：1)使次血紅素的兩個(gè)羧基脫水形成酸酐，2)使所述酸酐與肽鏈的游離氨基形成酰胺鍵。制備環(huán)化的次血紅素肽的方法包括：1)在固相載體上，按照Fmoc固相合成法得到經(jīng)保護(hù)的NH2-β-Ala-His(Trt)-X-Lys(Mtt)-固相載體，2)偶聯(lián)次血紅素，3)選擇性地切割Mtt側(cè)鏈保護(hù)基，暴露出游離氨基，使所述游離氨基與次血紅素的羧基縮合成環(huán)，得到c(Dh-β-Ala-His(Trt)-X-Lys)-固相載體，4)脫除其他氨基酸的保護(hù)基團(tuán)，并將所得的c(Dh-β-Ala-His(Trt)-X-Lys)從固相載體上切割下來(lái)。
【專利說(shuō)明】
次血紅素分子與肽偶聯(lián)的方法、環(huán)化次血紅素肽及其制備 方法和用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種次血紅素分子與肽鏈偶聯(lián)的 方法；以及環(huán)化的次血紅素肽及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 次血紅素 6 肽（Deuterohaemin- β -Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys, Dh- β -AHTVEK，Dh ΗΡ-6)作為一種鐵卟啉的肽類衍生物，是抗壞血酸過(guò)氧化物酶的模擬酶，體內(nèi)/體外試驗(yàn)結(jié) 果表明其具有良好的抗氧化活性，在預(yù)防和/或治療糖尿病、白內(nèi)障、心腦血管疾病、衰老、 炎癥方面均顯示較好的功效。
[0003] 然而，次血紅素6肽作為一種多肽，由于分子量大、不易透過(guò)細(xì)胞膜、易受生物體 內(nèi)酶的降解，因此常規(guī)的給藥途徑是注射。然而，從患者使用的方便、安全及順應(yīng)性角度考 慮，尤其是例如糖尿病這類需要長(zhǎng)期用藥的情況，這樣的給藥方式并不理想。相較于注射給 藥，口服給藥是各種給藥方式中較為理想的方式之一。雖然目前通過(guò)多肽鏈修飾技術(shù)（參 見(jiàn)CN103450341 A)顯著提高了多肽的穩(wěn)定性，從而可提高多肽的生物利用度，為口服給藥 奠定了基礎(chǔ)，但是這些修飾卻不能顯著改善次血紅素6肽的腸道細(xì)胞透過(guò)性，因此，仍然不 適于口服。
[0004] 而且，當(dāng)前次血紅素分子與肽鏈偶聯(lián)的方法主要是采用高效縮合劑，如磷、脲正離 子HATU、PyBop等，將次血紅素的羧基轉(zhuǎn)變成活潑酯，肽鏈游離氨基（親核試劑）進(jìn)攻酯鍵 形成酰胺鍵，雖然HATU、PyBop的活化性能很高，但最終目標(biāo)次血紅素肽的產(chǎn)率卻并不高， 原因在于他們對(duì)Dh的兩個(gè)羧基沒(méi)有選擇性，導(dǎo)致兩個(gè)羧基均被活化，副反應(yīng)產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)目的 產(chǎn)物生成，如次血紅素與肽鏈雙偶聯(lián)產(chǎn)物和次血紅素肽二甲胺化雜質(zhì)，使粗肽產(chǎn)品純度小 于40 %，增加了后續(xù)純化難度，最終收率僅10 %。
[0005] PyBop/HOBt縮合反應(yīng)的機(jī)理如下：
[0006]
[0007] 傳統(tǒng)方法采用低取代樹脂降低肽鏈密度、減少反應(yīng)時(shí)間、更換低活性的活化劑和 反應(yīng)試劑抑制副反應(yīng)進(jìn)行，但這些條件優(yōu)化的改進(jìn)效果非常有限。
[0008] 為了解決上述問(wèn)題，需要對(duì)次血紅素6肽進(jìn)一步改造，以使其適于口服，還需要一 種能夠高效偶聯(lián)次血紅素與肽鏈的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種次血紅素分子與肽鏈的偶聯(lián)方法，所述方法包括 以下步驟：
[0010] 1)使次血紅素的兩個(gè)羧基脫水形成酸酐，
[0011] 優(yōu)選地，以DIC或乙酸酐為活化劑，使次血紅素的兩個(gè)羧基脫水形成酸酐，
[0012] 2)使所述酸酐與肽鏈的游離氨基形成酰胺鍵，
[0013] 所述肽鏈可以是游離的肽鏈或在固相載體上偶聯(lián)的肽鏈，例如，在固相合成過(guò)程 中形成的偶聯(lián)在樹脂上的肽鏈。
[0014] 優(yōu)選地，所述方法可包括以下步驟：
[0015] 1)用DMF溶解次血紅素，然后加入DCM和DIC，在室溫下攪拌50-70min ; _6] 2)減壓揮干，得到剩余物；
[0017] 3)將剩余物用DMF溶解，加入所述肽鏈，在25-30攝氏度下，以120-140rpm振搖 50_70min，然后抽干。
[0018] 優(yōu)選地，在步驟1中，DIC與肽鏈的摩爾比為1:1。
[0019] 所述肽鏈的長(zhǎng)度可以為1-50個(gè)氨基酸、1-25個(gè)氨基酸、20個(gè)氨基酸、1-15個(gè)氨基 酸、1-10個(gè)氨基酸、1-5個(gè)氨基酸。
[0020] 所述肽鏈可以是固相合成反應(yīng)中得到的與樹脂偶聯(lián)的肽，例如本發(fā)明實(shí)施例中得 到的與Rink-amide樹脂偶聯(lián)的肽。
[0021] 舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)使用DIC為活化劑時(shí)，次血紅素的縮合反應(yīng)的機(jī)理如下：
[0022]
[0023] 其中R代表肽鏈。
[0024] 本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)的偶聯(lián)方法（例如通過(guò)PyBop/HOBt縮合反應(yīng)進(jìn)行的偶聯(lián)） 相比，避免了副反應(yīng)大量發(fā)生，將粗肽的純度提高至80%以上，極大地增加了產(chǎn)率，降低了 生產(chǎn)成本。
[0025] 本發(fā)明的另一目的是提供一種制備環(huán)化的次血紅素肽的方法，所述方法包括：
[0026] 1)在固相載體上，按照Fmoc固相合成法從C端（羧基端）至N端（氨基端）順序 地偶聯(lián)經(jīng)保護(hù)的 Fmoc-Lys (Mtt) -OH、Fmoc-X-〇H、Fmoc-His-OH、Fmoc- β -Ala-OH，得到經(jīng)保 護(hù)的 NH2- β -Ala-His (Trt) -X-Lys (Mtt)-固相載體，
[0027] 其中X代表具有扭轉(zhuǎn)酰胺鍵的任一氨基酸，
[0028] 其中，所述固相載體為Fmoc固相合成法中常用的載體。優(yōu)選地，所述固相載體為 Rink amide MBHA 樹脂。
[0029] 2)偶聯(lián)次血紅素，其中優(yōu)選用上述本發(fā)明的偶聯(lián)方法將次血紅素與步驟1)中的 NH2- β -Ala-His (Trt) -X-Lys (Mtt)-固相載體進(jìn)行偶聯(lián)。
[0030] 3)選擇性地切割Mtt側(cè)鏈保護(hù)基，暴露出游離氨基，然后在縮合劑的作用下，使所 述游離氨基與次血紅素的羧基縮合成環(huán)，得到c (Dh- β -Ala-His (Trt) -X-Lys)-固相載體，
[0031] 其中所述縮合劑可為 PyBop/HOBt、HBTU/HOBt、HATU/HOAt，
[0032] 其中，用I %的TFA選擇性切割Mtt側(cè)鏈保護(hù)基。
[0033] 優(yōu)選地，在步驟3中，將偶聯(lián)次血紅素后得到的肽樹脂抽干，加入1%的TFA-DCM， 在26-28°C下以120-140rpm振搖50-70min，來(lái)選擇性切割Mtt保護(hù)基。
[0034] 優(yōu)選地，在步驟3中，將選擇性切割Mtt保護(hù)基的樹脂肽抽干，加入PyBop/HOBt、 DIEA，26-28°C，反應(yīng)10_12h，來(lái)進(jìn)行縮合成環(huán)反應(yīng)。
[0035] 其中所述PyBop/HOBt和DIEA與所述肽樹脂的摩爾比為6:1~6. 3:1和12:1~ 12. 6:1〇
[0036] 4)脫除其他氨基酸的保護(hù)基團(tuán)，并將所得的c (Dh- β -Ala-His (Trt) -X-Lys)從固 相載體上切割下來(lái)，得到含有環(huán)化的次血紅素肽c (Dh-β -ΑΗΧΚ)的溶液。
[0037] 優(yōu)選地，所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為：c (Dh- β -ΑΗΡΚ)，其中P為脯氨酸。
[0038] 優(yōu)選地，所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為：c (Dh- β -AHGK)，其中G為甘氨酸。
[0039] 優(yōu)選地，所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為c(Dh-i3 -AH-(d)E-K)，其中（d)E為D-谷氨 酸。
[0040] 優(yōu)選地，所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為c(Dh-0 -AH-(Me)E-K)，其中（Me)E為N-甲 基谷氨酸。
[0041 ] 優(yōu)選地，對(duì)4)中得到的溶液進(jìn)行純化，純化方法例如洗滌、重結(jié)晶及色譜法（例如 HPLC)等。
[0042] 本領(lǐng)域已知肽鏈環(huán)化的成敗在于成環(huán)兩位點(diǎn)具有空間上的可接近性，包括合適的 距離及恰當(dāng)?shù)慕嵌?，距離太遠(yuǎn)或角度相背均難以使兩位點(diǎn)偶聯(lián)。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，在賴 氨酸前一位點(diǎn)引入扭轉(zhuǎn)肽鍵順式構(gòu)象的氨基酸，如D型氨基酸、N-甲基氨基酸等，以促進(jìn)賴 氨酸與次血紅素空間相近，這種序列具有距離短、角度匹配的特點(diǎn)，因而能夠使環(huán)化效率達(dá) 到30%。并且發(fā)明人還采用了樹脂上成環(huán)策略，以特殊側(cè)鏈保護(hù)的Fmoc-Lys (Mtt)-OH為 構(gòu)件合成環(huán)肽前體，1 % TFA選擇性切割Mtt側(cè)鏈保護(hù)基，暴露出游離氨基，在高效縮合劑 PyBop/HOBt作用下，使其與Dh的羧基縮合成環(huán)。
[0043] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供環(huán)化的次血紅素肽，其結(jié)構(gòu)如下：c (Dh- β -AHXK)，Dh 代表次血紅素 ，β -A代表丙氨酸，H代表組氨酸，X代表具有扭轉(zhuǎn)酰胺鍵的任一氨基酸，K代 表賴氨酸，c表示環(huán)化，環(huán)化發(fā)生在Dh的羧基與K側(cè)鏈ε -氨基。
[0044] 其中所述具有扭轉(zhuǎn)酰胺鍵的任一氨基酸，是指引入扭轉(zhuǎn)肽鍵順式構(gòu)象的氨基酸， 如D型氨基酸、N-甲基氨基酸等以促進(jìn)賴氨酸與次血紅素空間接近。
[0045] 優(yōu)選地，所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為：c (Dh- β -ΑΗΡΚ)，其中P為脯氨酸。
[0046] 優(yōu)選地，所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為：c (Dh- β -AHGK)，其中G為甘氨酸。
[0047] 優(yōu)選地，所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為c(Dh_i3 -AH-(d)E-K)，其中（d)E為D-谷氨 酸。
[0048] 優(yōu)選地，所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為c(Dh-0 -AH-(Me)E-K)，其中（Me)E為N-甲 基谷氨酸。
[0049] 本發(fā)明的環(huán)化的次血紅素肽具有高的過(guò)氧化物酶活性，高的腸道細(xì)胞透過(guò)性，并 具有高的抗酶解性。因此可以以口服的方式作為過(guò)氧化物酶用于疾病的治療和/或預(yù)防。
[0050] 本發(fā)明提供了環(huán)化的次血紅素肽在制備用于預(yù)防和/或治療疾病的藥劑中的用 途，所述疾病可以使用抗壞血酸過(guò)氧化物酶或者具有抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性的化合物治 療，具體而言，所述疾病可以選自糖尿病、白內(nèi)障、心腦血管疾病、衰老、炎癥，所述藥劑特別 適于口服給藥。
[0051] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的環(huán)化的次血紅素肽和可藥用載 體。
【附圖說(shuō)明】
[0052] 圖1為Dh- β -AHTVEK的高效液相色譜圖，其中DIC為活化劑。
[0053] 圖2為Dh- β -AHTVEK的高效液相色譜圖，其中乙酸酐為活化劑。
[0054] 圖3為Dh- β -AHTVEK的高效液相色譜圖，其中PyBop為活化劑。
[0055] 圖4為Dh- β -AHTVEK的高效液相色譜圖，其中HATU為活化劑。
[0056] 在圖卜圖 4 中，a 為 Dh-β-AHTVEK、b 為 Dh(C2H6N)-P-AHTVEK、c 為 Dh (-β -AHTVEK)2〇
[0057] 圖5 :圖5A為次血紅素肽在血清中的穩(wěn)定性；圖5B為次血紅素肽在小腸勻漿中的 穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0058] 在本文中公開(kāi)了一系列多肽的氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，在以 三字母的氨基酸殘基或單個(gè)字母表示某一序列時(shí)，該序列從左至右表示的是該多肽從N端 (氨基端）至C端（羧基端）的序列。例如當(dāng)使用"Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys"表示某 一多肽的序列時(shí)，意為該多肽的序列為"N端-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys-C端"，而當(dāng)使用 "AHTVEK"表示某一多肽的序列時(shí)，意為該多肽的序列為"N端-AHTVEK-C端"。
[0059] 當(dāng)沒(méi)有具體標(biāo)明氨基酸的構(gòu)型時(shí)，其是指α -氨基酸。
[0060] 對(duì)本發(fā)明中所用英文及縮寫及其含義說(shuō)明如下：

[0063] "可藥用的載體"是指在生物學(xué)上或其他方面不會(huì)具有不良作用的物質(zhì)，即可以將 所述物質(zhì)與本發(fā)明的環(huán)化的次血紅素肽一同給予受試者，同時(shí)不會(huì)引起任何不良的生物學(xué) 影響或以有害的方式與含有它的藥物組合物的任何其他組分相互作用。顯然應(yīng)當(dāng)選擇可使 活性成分的任何降解降到最低并且使受試者體內(nèi)的任何不良副作用減到最小的載體，這 是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
[0064] 合適的載體包括但不限于：抗氧化劑、防腐劑、著色劑、調(diào)味劑和稀釋劑、乳化劑、 懸液劑、溶劑、填充劑、增量劑、緩沖劑、載體、沖淡劑、賦形劑和/或藥用佐劑。
[0065] 本發(fā)明的藥物組合物用于口服給藥時(shí)可采用片劑、延遲型片劑、舌下片劑、膠囊 劑、吸入型氣溶膠、吸入型溶液劑、干粉吸入劑或液體制劑（例如混合物、溶液劑、酏劑、糖 漿劑或懸液劑）的形式，所有劑型均含有本發(fā)明的環(huán)化的次血紅素肽；所述制劑可通過(guò)本 領(lǐng)域公知的方法來(lái)制備。
[0066] 如果組合物為片劑的形式，可使用通常用于制備固體制劑的任意藥物載體。所述 載體的實(shí)例包括硬脂酸鎂、滑石、凝膠、阿拉伯膠、硬脂酸、淀粉、乳糖和蔗糖。
[0067] 片劑可任選與一種或多種輔助成分一起壓制或模制來(lái)制備。壓制片劑可通過(guò)在適 合的機(jī)器中壓制任選與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、潤(rùn)滑劑、表面活性劑或分散劑混合的 呈自由流動(dòng)形式（例如粉末或顆粒）的活性成分來(lái)制備。
[0068] 模制片劑可通過(guò)在適合的機(jī)器中將由惰性液體稀釋劑潤(rùn)濕的粉末狀化合物的混 合物模制來(lái)制備。所述片劑可任選包覆包衣或經(jīng)刻痕且可進(jìn)行調(diào)配以提供緩慢或控制地釋 放其中的活性成分。
[0069] 對(duì)于片劑劑型，視劑量而定，藥物可組成劑型的1重量％至80重量％，更通常組成 劑型的5重量％至60重量％。除藥物外，片劑通常含有崩解劑。崩解劑的實(shí)例包括羥基乙 酸淀粉鈉、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、交聯(lián)羧甲纖維素鈉、交聯(lián)聚維酮、聚乙烯吡咯 烷酮、甲基纖維素、微晶纖維素、低級(jí)烷基取代的羥丙基纖維素、淀粉、預(yù)膠凝化淀粉以及海 藻酸鈉。崩解劑通常會(huì)構(gòu)成劑型的1重量％至25重量％、優(yōu)選5重量％至20重量％。
[0070] 粘合劑通常用來(lái)賦予片劑制劑以黏著性質(zhì)。適合的粘合劑包括微晶纖維素、凝膠、 糖類、聚乙二醇、天然和合成的膠、聚乙烯吡咯烷酮、預(yù)膠凝化淀粉、羥丙基纖維素以及羥丙 基甲基纖維素。片劑還可含有稀釋劑，例如乳糖（一水合物、噴霧干燥的一水合物、無(wú)水物 等）、甘露糖醇、木糖醇、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、微晶纖維素、淀粉以及二水合磷酸氫鈣。 片劑還可任選包含表面活性劑，例如月桂基硫酸鈉以及聚山梨醇酯80,以及助流劑，例如二 氧化硅和滑石。如果存在，表面活性劑的量通常為片劑的〇. 2重量％至5重量％，且助流劑 的量通常為片劑的〇. 2重量％至1重量％。
[0071] 片劑通常還包含潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、硬脂酰富馬酸鈉，以 及硬脂酸鎂與月桂基硫酸鈉的混合物。潤(rùn)滑劑通常以片劑的〇. 25重量％至10重量％，優(yōu) 選〇. 5重量％至3重量％的量存在。其他常規(guī)成分包括抗氧化劑、著色劑、調(diào)味劑、防腐劑 以及掩味劑。
[0072] 示例性的片劑含有最高達(dá)約80重量％的藥物、約10重量％至約90重量％的粘合 劑、約0重量％至約85重量％的稀釋劑、約2重量％至約10重量％的崩解劑，以及約0. 25 重量％至約10重量％的潤(rùn)滑劑。片劑混合物可通過(guò)直接壓縮或通過(guò)乳輥來(lái)壓縮形成片劑。 或者，片劑混合物或混合物的部分可在制片前濕法制粒、干法制?；蛉廴诜ㄖ屏！⑷廴谀Y(jié) 或擠壓。最終制劑可包含一層或多層且可被包衣或不包衣；或囊封。
[0073] 如果組合物為膠囊的形式，任何常規(guī)的囊封均適合，例如在硬凝膠膠囊中使用上 述載體。如果組合物呈軟凝膠膠囊形式，可考慮任何通常用于制備分散劑或懸液劑的藥物 載體（例如水性膠、纖維素、硅酸鹽或油類）并將其納入軟凝膠膠囊中。
[0074] 用于口服給藥的固體制劑可配制為即釋和/或修飾釋放。修飾釋放制劑包括延遲 釋放、持續(xù)釋放、脈動(dòng)釋放、控制釋放、靶向釋放以及程序釋放。
[0075] 液體制劑包括懸液劑、溶液劑、糖漿劑及酏劑。所述制劑可用作軟膠囊或硬膠囊中 的填充劑且通常包括載體（例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纖維素或適合的油），以 及一種或多種乳化劑和/或懸液劑。溶液劑可以為活性化合物的水溶性鹽或其他衍生物結(jié) 合，例如，蔗糖以形成糖漿。液體制劑還可以通過(guò)復(fù)原例如小藥袋里的固體來(lái)制備。
[0076] 實(shí)施例
[0077] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。以下實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員能夠更好地理解本發(fā)明，這僅僅出于示例性目的，并非意在限制本發(fā)明的范圍。已經(jīng)努 力確保有關(guān)數(shù)字（如數(shù)量、溫度等）的準(zhǔn)確性，但應(yīng)該考慮到會(huì)存在一些誤差和偏差。除非 另有說(shuō)明，份數(shù)為重量份數(shù)，溫度以°(：為單位或者為環(huán)境溫度，壓力接近或等于大氣壓。
[0078] 主要試劑、儀器：
[0079] Rink amide MBHA resin、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-d-Glu (OtBu)-〇H、 Fmoc-N-Me-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-His (Trt)-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH、 Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Lys (Boc) -〇H、Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-Val-OH、 DIC、HOBt、PyBop、HATU、HOAt、DIEA、NMM、DMF、DCM、哌啶、三氟乙酸、乙酸酐、苯甲醚、苯酚： 上海吉爾生化公司
[0080] 甲醇、乙醚：北京化工廠
[0081] 色譜純乙腈：美國(guó)Baker公司
[0082] EDTA-Na2、抗壞血酸、H2O2為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。
[0083] DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、HBBS、D-HBBS :德國(guó) GIBCO Invitrogen 公司
[0084] R215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士 BUCHI公司
[0085] Alphal-4凍干機(jī)：德國(guó)CHRIST公司
[0086] 高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司
[0087] iMark酶標(biāo)儀：日本BioRAD公司
[0088] CKX41倒置顯微鏡：日本OLYMPUS公司
[0089] 110X50水浴振蕩箱：上海智城公司
[0090] pH儀、AG285分析天平：瑞典METTLER公司
[0091] 高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司
[0092] MALDI-T0F-T0F 58〇0 質(zhì)譜儀：美國(guó) AB Sciex 公司
[0093] NanoDrop 2000紫外分光光度儀、CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo公司
[0094] SW-CJ-2F凈化工作臺(tái)：蘇州安泰公司
[0095] YMC ODS-A色譜柱：日本YMC公司
[0096] Eclipse XDB C18 色譜柱：美國(guó) Agilent 公司
[0097] 內(nèi)插式24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、Millicel-ERS2電阻儀：美國(guó)Millipore公司
[0098] 實(shí)施例1以DIC為活化劑制備Dh- β -AHTVEK
[0099] 溶脹：取Rink amide MBHA樹脂0.1 mmol (取代度0. 33mmol/g)，置于肽合成反應(yīng) 器中，加4ml DMF進(jìn)行溶脹，在27°C下以130rpm振搖30min進(jìn)行溶脹，用DMF洗滌樹脂，每 次洗滌3分鐘，共洗滌6次，洗滌完畢后抽干。
[0100] 脫？111〇(3保護(hù)：向肽合成反應(yīng)器中加入4111120%哌啶-01^，在27°(：下以130印111振 搖20min，DMF洗滌樹脂，每次洗滌3min，共洗滌6次，洗滌完畢后抽干。
[0101] 偶聯(lián)：取 Fmoc-Lys (Boc)-OH (0· 3mmol)，PyBop (0· 3mmol), HOBt (0. 3mmol)，喊試 劑NMM(0. 6mmol)，溶于4ml DMF，然后將上述混合物加入至肽合成反應(yīng)器中，在27°C下 以130rpm振搖lh。用DMF洗滌樹脂，每次洗滌3min，共洗滌6次，洗滌完畢后抽干，得到 Fmoc-Lys(Boc)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0102] 重復(fù)上述脫保護(hù)及偶聯(lián)步驟，依次將Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Thr (tBu) -OH、Fmoc-His (Trt) -OH、Fmoc- β -Ala-OH 連接到序列上，最后脫除 Fmoc 保 護(hù)基，得到 NH2-0-Ala-His(Trt)-Thr(tBu)-Val-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0103] 取次血紅素（0. 3mmol)用 0. 5ml DMF 溶解，然后加入 DCM 2ml，DIC(0. 3mmol)，在 室溫下攪拌lh，在40°C下減壓揮干DCM，所得的剩余物用5mlDMF溶解，并將所得的溶液加入 至肽合成反應(yīng)器中，在27°C下以130rpm振搖lh。然后抽干反應(yīng)物，得到Dh-β -Ala-His(T rt)-Thr (tBu)-Val-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0104] 樹脂肽用DMF及甲醇洗滌，每次分別洗滌3min，共洗滌6次，真空干燥12小時(shí)。
[0105] 每次脫保護(hù)及偶聯(lián)反應(yīng)后，取少量樹脂粒，加 Kaiser ninhydrin試劑（A，6%諱三 酮的乙醇溶液；B，80%苯酚的乙醇溶液；C，0.0 OlM KCN的吡啶溶液）2滴，120°C反應(yīng)5min， 若樹脂為藍(lán)色（伯胺）表明氨基暴露。
[0106] 切割：向所得的樹脂肽中加入4ml切割液（TFA:苯甲醚：苯酚：水 (92. 5:2. 5:2. 5:2. 5))，在 27°C下以 130rpm 振搖 lh，過(guò)濾除去樹脂。
[0107] 沉淀：將含有粗肽的切割液滴入50ml冷乙醚中，先在-20°C下放置lh，然后在4°C 下以8000rpm離心10min，用20ml乙醚洗沉淀2次，離心，收集粗肽沉淀，真空干燥12h，得 到粗肽。
[0108] 純化：將上述粗肽溶于水，使用半制備HPLC以下文所述的色譜條件進(jìn)行純化。分 部收集目標(biāo)色譜峰，合并純度大于95 %的組份。收集液在37°C，50毫巴減壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 以除去乙腈，將剩余的肽溶液冷凍干燥24h。色譜條件：色譜柱YMC 0DS-A(250X20mm， ΙΟμπι)，流動(dòng)相A為水，B為乙腈（均含0. 1% TFA)，梯度洗脫，60min內(nèi)B相的比例由10% 增至70%，流速20ml/min，紫外檢測(cè)386nm。獲得了純品肽。
[0109] 結(jié)構(gòu)鑒定：純品以RP-HPLC和MALDI-TOF-TOF MS進(jìn)行鑒定。色譜條件：色譜柱 Eclipse XDB (：18(4.6\15〇111111，54111)，流動(dòng)相厶為10%乙腈-水，8為90%乙腈-水（均 含0. 1% TFA)，梯度洗脫，在5min內(nèi)B相的比例由10%增至20%，再經(jīng)IOmin增至50%， 最后5min增至70%，流速1.0 ml/min，紫外檢測(cè)386nm，柱溫25°C。質(zhì)譜條件：0. 5 μ 1所得 的純品肽（將冷凍干燥后的肽用純化水溶解得到，濃度為0. lmg/ml)與0. 5 μ 1基質(zhì)（50mM R-氰基-4-羥基肉桂酸溶于乙腈）混勻，點(diǎn)樣于不銹鋼測(cè)試板上，室溫干燥。反射模式，陽(yáng) 咼子掃描。
[0110] 結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果表明所得的純品肽序列與理論一致，純度為97.0%。
[0111] 實(shí)施例2以乙酸酐為活化劑制備Dh-β-AHTVEK
[0112] 采用與實(shí)施例1中相同的固相合成方法，得到NH2-β -Ala-His (Trt)-Thr (tBu)-V al-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0113] 取次血紅素（0. 3mmol)，乙酸酐（0. 3mmol)，用5ml DMF溶解，置于50mL三頸瓶中， 在130°C下攪拌Ih (側(cè)口干燥管中以氫氧化鈉收集蒸餾出來(lái)的水和乙酸）。將反應(yīng)產(chǎn)物冷 至室溫，加入至肽合成反應(yīng)器中，在27°C下以130rpm振搖lh。然后抽干反應(yīng)物，得到Dh-β -Ala-His (Trt) -Thr (tBu) -Val-Glu (OtBu) -Lys (Boc) -Rinkamide MBHA 樹脂。
[0114] 樹脂肽用DMF及甲醇洗滌，每次分別洗滌3min，共洗滌6次，真空干燥12小時(shí)。
[0115] 然后，采用與實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行切割、沉淀、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)構(gòu)鑒定 結(jié)果表明所得的純品肽序列與理論一致，純度為98. 0%。
[0116] 結(jié)果如圖1和2所示，以DIC或乙酸酐活化次血紅素，與肽鏈偶聯(lián)效率非常高，顯 著降低相關(guān)副產(chǎn)物的生成，其中主成分DhHP-6均大于80%，二甲胺雜質(zhì)小于10%，以上按 色譜峰面積歸一化計(jì)算純度值，未檢出肽鏈雙偶聯(lián)產(chǎn)物。說(shuō)明本發(fā)明的酸酐法使得Dh與肽 鏈偶聯(lián)的選擇性增強(qiáng)，顯著提高目標(biāo)產(chǎn)物的含量，產(chǎn)品最終收率為約40 %，為進(jìn)一步環(huán)化次 血紅素肽鏈奠定基礎(chǔ)。
[0117] 實(shí)施例3以PyBop為活化劑制備Dh-β-AHTVEK
[0118] 采用與實(shí)施例1中相同的固相合成方法，得到NH2-β -Ala-His (Trt)-Thr (tBu)-V al-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0119] 取次血紅素（0· 3mmol)，PyBop (0· 3mmol), HOBt (0. 3mmol)，喊試劑 ΝΜΜ(0· 6mmol)， 溶于4ml DMF，加入肽合成反應(yīng)器中，在27°C以130rpm振搖lh。抽干，得到Dh-P-Ala-His (Trt)-Thr (tBu)-Val-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0120] 然后，采用與實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行切割、沉淀、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)構(gòu)鑒定 結(jié)果表明所得的純品肽序列與理論一致，純度為97. 5%。
[0121] 實(shí)施例4以HATU為活化劑制備Dh-β-AHTVEK
[0122] 采用與實(shí)施例1中相同的固相合成方法，得到NH2-β -Ala-His (Trt)-Thr (tBu)-V al-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0123] 取次血紅素（0· 3mmol)，HATU (0· 3mmol)，HOAt (0· 3mmol)，堿試劑 NMM (0· 6mmol)， 溶于4ml DMF，然后加入肽合成反應(yīng)器中，在27°C以130rpm振搖lh。抽干，得到Dh-P-Ala -His (Trt)-Thr (tBu)-Val-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Rink amide MBHA 樹脂。樹脂肽用 DMF 及 甲醇洗滌，每次分別洗滌3min，共洗滌6次，真空干燥12小時(shí)。
[0124] 然后，采用與實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行切割、沉淀、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)構(gòu)鑒定 結(jié)果表明所得的純品肽序列與理論一致，純度為97. 8%。
[0125] 結(jié)果如圖3和4所示，以高活性縮合劑PyBop或HATU活化Dh，與肽鏈偶聯(lián)后副產(chǎn) 物較多，其中主成分DhHP-6均小于40 %，二甲胺雜質(zhì)及肽鏈雙偶聯(lián)產(chǎn)物占50 %，以上按色 譜峰面積歸一化計(jì)算純度值。將圖1-4的結(jié)果進(jìn)行比較，可以看出本發(fā)明具有巨大的優(yōu)勢(shì)。
[0126] 實(shí)施例 5 c (Dh- β -AHPK)的制備
[0127] 采用與實(shí)施例1中相同的固相合成方法，得到NH2-β-Ala-His (Trt)-Pro-Lys (Mt t)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0128] 取次血紅素（0· 3mmol)用 0· 5ml DMF 溶解，加入 DCM 2ml，DIC(0. 3mmol)，在室溫 下攪拌lh，在40°C下減壓揮干DCM，所得的剩余物以5ml DMF溶解，并將所得的溶液加入至 肽合成反應(yīng)器中，在27°C下以130rpm振搖lh。抽干后得到Dh-β -Ala-His(Trt)-Pro-Lys (Mtt)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0129] 用DMF及DCM分別洗滌樹脂，每次洗滌3min，共洗滌6次，抽干。向肽合成反應(yīng)器 加入I % TFA-DCM，在27°C下反應(yīng)30min，用DMF洗滌樹脂，每次洗滌3min，共洗滌6次，洗滌 完畢后抽干。加入？78(^/!1(?丨(0.6臟〇1)，0此4(1.2臟〇1)，在27°(：下反應(yīng)1211。得到(3(011 -P-Ala-His(Trt)-Pro-Lys)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0130] 所得的樹脂肽用DMF及甲醇分別洗滌，每次洗滌3min，共洗滌6次，真空干燥12h。
[0131] 然后，采用與實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行切割、沉淀、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)構(gòu)鑒定 結(jié)果表明所得的純品肽序列與理論一致，純度為97. 4%。環(huán)化效率為28. 8%。
[0132] 實(shí)施例 6 c (Dh- β -AHGK)的制備
[0133] 采用與實(shí)施例1中相同的固相合成方法，得到
[0134] NH2-β-Ala-His (Trt)-Gly-Lys (Mtt)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0135] 取次血紅素（0· 3mmol)用 0· 5ml DMF 溶解，加入 DCM 2ml，DIC(0. 3mmol)，在室溫 下攪拌lh，在40°C下減壓揮干DCM，所得的剩余物以5ml DMF溶解，并將所得的溶液加入至 肽合成反應(yīng)器中，在27°C下以130rpm振搖lh。抽干后得到Dh-β -Ala-His(Trt)-Gly-Lys (Mtt)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0136] 以DMF及DCM分別洗滌樹脂，每次洗滌3min，共洗滌6次，洗滌完畢后抽干。向肽 合成反應(yīng)器中加入1% TFA-DCM，在27°C下反應(yīng)30min，用DMF洗滌樹脂，每次洗滌3min，共 洗滌6次，洗滌完畢后抽干。向肽合成反應(yīng)器加入PyBop/HOBt (0. 6mmol)，DIEA(1. 2mmol)， 在 27°C 下反應(yīng) 12h。得到C(Dh-P-Ala-His(Trt)-Gly-Lys)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0137] 所得的樹脂肽用DMF及甲醇分別洗滌，每次洗滌3min，共洗滌6次，真空干燥12h。
[0138] 然后，采用與實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行切割、沉淀、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)構(gòu)鑒定 結(jié)果表明所得的純品肽序列與理論一致，純度為97. 7%。環(huán)化效率為29. 3%。
[0139] 實(shí)施例 7 c (Dh- β -AH- (d) E-K)的制備
[0140] 采用與實(shí)施例1中相同的固相合成方法，得到
[0141] NH2-β-Ala-His (Trt)-d_Glu (OtBu)-Lys (Mtt)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0142] 取次血紅素（0· 3mmol)用 0· 5ml DMF 溶解，加入 DCM 2ml，DIC(0. 3mmol)，在室溫 下攪拌lh，在40°C下減壓揮干DCM，所得的剩余物以5ml DMF溶解，并將所得的溶液加入至 肽合成反應(yīng)器中，在27°C下以130rpm振搖lh。抽干后得到Dh-P-Ala-His(Trt)-d-Glu(0 tBu)-Lys (Mtt)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0143] 以DMF及DCM分別洗滌樹脂，每次洗滌3min，共洗滌6次，洗滌完畢后抽干。向肽合 成反應(yīng)器加入1 % TFA-DCM，在27°C下反應(yīng)30min，用DMF洗滌樹脂，每次洗滌3min，共洗滌 6次，洗滌完畢后抽干。向抽干后所得的樹脂加入PyBop/HOBt (0. 6mmol)，DIEA (I. 2mmol)， 在 27°C下反應(yīng) 12h。得到 c (Dh_ P-Ala-His(Trt)-d_Glu (OtBu)-Lys)-Rink amide MBHA 樹 脂。
[0144] 所得的樹脂肽用DMF及甲醇分別洗滌，每次洗滌3min，共洗滌6次，真空干燥12h。
[0145] 然后，采用與實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行切割、沉淀、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)構(gòu)鑒定 結(jié)果表明所得的純品肽序列與理論一致，純度為97. 1 %。環(huán)化效率為27. 5%。
[0146] 實(shí)施例 8 c (Dh- β -AH- (Me) E-K)的制備
[0147] 采用與實(shí)施例1中相同的固相合成方法，得到NH2-β -Ala-His (Trt)-N-Me-Glu (0 tBu)-Lys (Mtt)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0148] 取次血紅素（0· 3mmol)用 0· 5ml DMF 溶解，加入 2ml DCM，DIC(0. 3mmol)，在室溫 下攪拌lh，在40°C下減壓揮干DCM，所得的剩余物以5ml DMF溶解，并將所得的溶液加入至 肽合成反應(yīng)器中，在27 °C下以130rpm振搖lh。抽干后得到Dh-P-Ala-His(Trt)-N-Me-G Iu(OtBu)-Lys(Mtt)-Rink amide MBHA 樹脂。
[0149] 以DMF及DCM分別洗滌樹脂，每次洗滌3min，共洗滌6次，洗滌完畢后抽干。向肽合 成反應(yīng)器加入1 % TFA-DCM，在27°C下反應(yīng)30min，用DMF洗滌樹脂，每次洗滌3min，共洗滌 6次，洗滌完畢后抽干。然后向反應(yīng)器加入PyBop/H0Bt(0. 6mmol)，DIEA(1. 2mmol)，在27°C 下反應(yīng) 12h。得到 c (Dh_ β -Ala-His (Trt) -N-Me-Glu (OtBu) -Lys) -Rink amide MBHA 樹脂。
[0150] 所得的樹脂肽用DMF及甲醇分別洗滌，每次洗滌3min，共洗滌6次，真空干燥12h。
[0151] 然后，采用與實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行切割、沉淀、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)構(gòu)鑒定 結(jié)果表明所得的純品肽序列與理論一致，純度為98. 2%。環(huán)化效率為28. 2%。
[0152] 實(shí)施例9過(guò)氧化物酶活性
[0153] 將實(shí)施例1-8中所得到的純肽用水配置成濃度為200 μ M/L的肽溶液，然后按照如 下方法分別測(cè)量所得的純肽的過(guò)氧化物酶活性：
[0154] 取 2. 5ml 50mM 磷酸鹽（ρΗ7· 4)、0· ImM EDTA-Na2緩沖液，20 μ 1 抗壞血酸（0· 5mM)， 10 μ IH2O2 (0. 3mM)，20 μ 1肽溶液（2 μ Μ)，加入Icm石英比色皿，終體積3ml。其中不加抗壞 血酸和H2O2為空白對(duì)照，室溫25°C監(jiān)測(cè)290nm吸光度在60s( sp〇t/5s)的降低?；钚詥挝欢?義為每min轉(zhuǎn)化1 μ mol抗壞血酸所需的肽的量，比活定義為每μ mol肽所具有的活性。計(jì) 算公式如下，U比活（Unit/ μ mol)，ΔΑ吸光度差，ε抗壞血酸的消光系數(shù)（2. 8mM \ cm 3， c肽濃度（μ Μ)，1000單位換算系數(shù)。
[0155]
[0156] DhHP-6作為過(guò)氧化物酶模擬物，能夠催化電子傳遞給還原性底物，因此酶活力以 抗壞血酸（AsA)和H2O 2體系測(cè)定。表1結(jié)果所示，DhHP-6的活性為30U/ μπιο?，即每分鐘1 分子的次血紅素肽可以轉(zhuǎn)化約30分子的抗壞血酸和約15分子的H2O2。將DhHP-6序列截短 環(huán)化，酶活性為原形藥的50-70%，這4個(gè)分子的共同特點(diǎn)是Lys側(cè)鏈ε -NH2均被反應(yīng)掉， 溶解性降低可能是一方面因素。
[0157] 表1次血紅素肽過(guò)氧化物酶活性
[0159] 實(shí)施例10 Caco-2細(xì)胞透過(guò)性
[0160] Caco-2細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）以DMEM培養(yǎng)基（購(gòu) 于德國(guó)GIBCO Invitrogen公司）（添加10%胎牛血清，1%非必需氨基酸（Gibco商品），2mM 谷氨酰胺）傳代培養(yǎng)（37°C，5% CO2)。取60~66代次細(xì)胞，按2. 5 X IO5細(xì)胞/cm2鋪種于 聚碳酸酯膜上（內(nèi)插式24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，孔徑0. 4 μ m，表面積0. 6cm2)。每2天換液，待生 長(zhǎng)至21~23天，細(xì)胞單層完全分化，跨膜電阻趨于穩(wěn)定（500~800 Ω . cm2)，可以用于膜透 過(guò)測(cè)定。細(xì)胞用HBSS (購(gòu)于德國(guó)GIBCO Invitrogen公司）洗2次，加400 μ I HBSS于37°C 孵育30min。次血紅素肽樣品以HBSS溶解（ImM)，經(jīng)0. 22 μ m濾膜除菌，取200 μ 1加入到 細(xì)胞頂側(cè)，400 μ I HBSS加入到細(xì)胞基底側(cè)，37°C孵育120min。收集基底側(cè)HBSS，以HPLC測(cè) 定所收集的HBSS中的肽含量，計(jì)算表觀滲透系數(shù)。公式如下，P app表觀滲透系數(shù)（cm/s)，C。 肽初始濃度，A膜表面積（0. 6cm2)，dQ/dt肽透過(guò)速率：
[0161]
[0162] Caco-2細(xì)胞來(lái)源于人結(jié)腸癌細(xì)胞，在體外生長(zhǎng)、融合并分化，形成連續(xù)的單層腸上 皮細(xì)胞，且表達(dá)小腸刷狀緣相關(guān)的酶系，是預(yù)測(cè)藥物人體吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的標(biāo)準(zhǔn)體外模型。 表2結(jié)果顯示，DhHP-6的表觀滲透系數(shù)P app在3 X 10 Scm/s范圍，為小腸吸收不良的化合物。 4個(gè)環(huán)肽的細(xì)胞透過(guò)量比原形藥均增加3倍，達(dá)到10 7cm/s范圍，顯著提高了腸道細(xì)胞的吸 收程度。環(huán)肽的剛性結(jié)構(gòu)限制分子構(gòu)象多樣性，容易穿透細(xì)胞間限制性和非限制性孔道，增 加了其滲透量。
[0163] 表2次血紅素肽Caco-2細(xì)胞透過(guò)性
[0164]
[0165] 實(shí)施例11代謝酶穩(wěn)定性
[0166] 血清穩(wěn)定性：大鼠（SD大鼠，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）尾靜脈取血后，將血樣 在37°C靜置2h，然后3000rpm離心10min，分離上層血清。取100 μ 1血清和次血紅素肽 (0· ImM)混合，37°C孵育，分別于0、6、12、18、24h加入200 μ1 TFA(12% )終止反應(yīng)（渦旋 60s)，1000 Orpm離心5min，取上清用IM NaOH調(diào)pH 5~7,以HPLC測(cè)定肽含量。
[0167] 小腸勻漿穩(wěn)定性：取新鮮分離的大鼠（SD大鼠，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）12指腸至 回腸段約20cm，用50ml冷生理鹽水沖洗內(nèi)容物，剪成小段置于PBS中（5ml，pH7. 5)，冰浴 勾衆(zhòng)（200rpm，2min)，4°C離心（10000rpm，10min)，收集上清，紫外280nm測(cè)定總蛋白濃度。 取100 μ 1血清和次血紅素肽（0. 5mM)混合，37°C孵育，分別于0、20、40、60、120、180、240、 360、480min加入200 μ1 TFA(12%)終止反應(yīng)（渦旋608)，10000鄺111離心51^11，取上清用 IM NaOH調(diào)pH 5~7,以HPLC測(cè)定肽含量。
[0168] 人體胃腸道內(nèi)含有豐富的消化酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋 白酶、外肽酶、內(nèi)肽酶等，口服多肽吸收入血液之前，須經(jīng)歷上述代謝酶的作用。多肽的口 服生物利用度低，很大原因在于酶催化下的快速降解，降低了透過(guò)腸道屏障的有效藥物濃 度。因此，本文設(shè)計(jì)合成特定位點(diǎn)環(huán)化的次血紅素肽，以增強(qiáng)其代謝穩(wěn)定性，并在體外模擬 生理環(huán)境，考察修飾后肽鏈的抗酶水解能力。如圖5所示，DhHP-6在血清中的降解速率明 顯比在小腸勾衆(zhòng)中慢，24h仍剩余80%。DhHP-6在小腸代謝酶的作用下迅速水解，半衰期 僅為lOmin。通過(guò)對(duì)代謝產(chǎn)物的解析，推測(cè)其主要降解途徑是羧肽酶從肽鏈C端逐步切割。 DhHP-6在血清中的代謝途徑與在腸勻漿中類似，但降解的速率較慢，可能由于血清中蛋白 酶或酰胺酶的濃度（活力）低導(dǎo)致。將肽鏈C端與N端次血紅素環(huán)化，環(huán)化物顯示出超強(qiáng) 的酶解穩(wěn)定性，8h后仍有98%剩余，比原形藥的半衰期增加2個(gè)數(shù)量級(jí)。環(huán)狀結(jié)構(gòu)使肽鏈 無(wú)法被蛋白內(nèi)/外切酶所識(shí)別結(jié)合，進(jìn)而催化酰胺鍵水解，因此環(huán)肽抵抗酶解的性能非常 優(yōu)秀。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種次血紅素分子與肽鏈的偶聯(lián)方法，所述方法包括以下步驟： 1) 使次血紅素的兩個(gè)羧基脫水形成酸酐， 2) 使所述酸酐與肽鏈的游離氨基形成酰胺鍵。2. 權(quán)利要求1的偶聯(lián)方法，其特征在于，在步驟1)中，以DIC或乙酸酐為活化劑，使次 血紅素的兩個(gè)羧基脫水形成酸酐。3. -種制備環(huán)化的次血紅素肽的方法，所述方法包括： 1) 在固相載體上，按照Fmoc固相合成法從C端（羧基端）至N端（氨基端）順序地偶 聯(lián)經(jīng)保護(hù)的 Fmoc-Lys (Mtt) -OH、Fmoc-X-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc- β -Ala-OH，得到經(jīng)保護(hù)的 NH2- β -Ala-His (Trt) -X_Lys (Mtt)-固相載體， 其中X代表具有扭轉(zhuǎn)酰胺鍵的任一氨基酸， 2) 偶聯(lián)次血紅素，其中用權(quán)利要求1的偶聯(lián)方法將次血紅素與步驟1)中的 ΝΗ2- β -Ala-His (Trt) -X-Lys (Mtt)-固相載體進(jìn)行偶聯(lián)， 3) 選擇性地切割Mtt側(cè)鏈保護(hù)基，暴露出游離氨基，然后在縮合劑的作用下，使所述游 離氨基與次血紅素的羧基縮合成環(huán)，得到c(Dh-0 -Ala-His (Trt)-X-Lys)-固相載體， 4) 脫除保護(hù)基團(tuán)，并將所得的c(Dh-0-Ala-His(Trt)-X-Lys)從固相載體上切割下 來(lái)，得到含有環(huán)化的次血紅素肽c (Dh- β -AHXK)的溶液。4. 權(quán)利要求3的方法，其特征在于，所述縮合劑為PyBop/HOBt、HBTU/HOBt、HATU/HOAt。5. 權(quán)利要求3的方法，其特征在于，用1 %的TFA選擇性切割Mtt側(cè)鏈保護(hù)基。6. 權(quán)利要求3的方法，其特征在于， 所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為：c (Dh- β -AHPK)，其中P為脯氨酸； 所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為：c (Dh- β -AHGK)，其中G為甘氨酸； 所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為c (Dh- β -AH- (d) Ε-Κ)，其中（d) Ε為D-谷氨酸；或 所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為c (Dh- β -AH- (Me) E-K)，其中（Me) E為N-甲基谷氨酸。7. 用權(quán)利要求3的方法制備的環(huán)化的次血紅素肽，其結(jié)構(gòu)如下：c (Dh- β -AHXK)，Dh代 表次血紅素 ，β -A代表丙氨酸，H代表組氨酸，X代表具有扭轉(zhuǎn)酰胺鍵的任一氨基酸，K代表 賴氨酸，c表示環(huán)化，環(huán)化發(fā)生在Dh的羧基與Κ側(cè)鏈ε -氨基。8. 權(quán)利要求7的環(huán)化的次血紅素肽，其中： 所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為：c (Dh- β -ΑΗΡΚ)，其中Ρ為脯氨酸； 所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為：c (Dh- β -AHGK)，其中G為甘氨酸； 所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為c (Dh- β -AH- (d) Ε-Κ)，其中（d) Ε為D-谷氨酸；或 所述環(huán)化的次血紅素的結(jié)構(gòu)為c (Dh- β -AH- (Me) E-K)，其中（Me) E為N-甲基谷氨酸。9. 權(quán)利要求7或8的環(huán)化的次血紅素肽制備用于預(yù)防和/或治療疾病的藥劑中的用 途，所述疾病可以使用抗壞血酸過(guò)氧化物酶或者具有抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性的化合物治 療，優(yōu)選地，所述疾病選自糖尿病、白內(nèi)障、心腦血管疾病、衰老、炎癥，優(yōu)選地，所述藥劑是 口服藥劑。10. -種藥物組合物，其包含權(quán)利要求7或8的環(huán)化的次血紅素肽和可藥用載體。
【文檔編號(hào)】A61P27/12GK105859840SQ201510032620
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2015年1月22日
【發(fā)明人】董慶光, 李惟, 陳妍
【申請(qǐng)人】長(zhǎng)春百益制藥有限責(zé)任公司