一種類膠原蛋白-人堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種類膠原蛋白?人堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白，該融合蛋白全長488個氨基酸，氮端為經(jīng)修飾的化膿鏈球菌來源的類膠原蛋白Scl2?M，Scl2?M蛋白長度為327個氨基酸，碳端為人堿性成纖維細(xì)胞生長因子hbFGF，hbFGF蛋白長度為155個氨基酸。兩個肽段之間含有腸激酶酶切位點(diǎn)。制備方法包括類膠原蛋白?人堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建、融合蛋白的發(fā)酵、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子和類膠原蛋白的純化以及生物活性的測定。本發(fā)明能夠同時高效生產(chǎn)人堿性成纖維細(xì)胞生長因子和類膠原蛋白，從而為人堿性成纖維細(xì)胞生長因子的規(guī)?；苽湟约邦惸z原蛋白的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種類膠原蛋白-人堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種類膠原蛋白-人堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白及其表達(dá)和純化，尤其涉及一種利用類膠原蛋白融合標(biāo)簽同時高效生產(chǎn)重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子和類膠原蛋白的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]化膿鏈球菌的類膠原蛋白Scl2無需羥基化修飾就可形成穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)并且Tm為35-39。。(Chunying Xu, Zhuoxin Yu, et al.B1macromolecules, 2010, 11: 348-356)。來源于化膿鏈球菌的類膠原蛋白Scl2研究較多，該重組Scl2蛋白由N-端球狀結(jié)構(gòu)域(V)和膠原區(qū)域(CL)組成，重組CL蛋白可促進(jìn)細(xì)胞的粘附且對細(xì)胞無毒性并可通過戊二醛交聯(lián)和冷凍干燥形成生物材料，為該類膠原蛋白在生物醫(yī)學(xué)材料和組織工程中的應(yīng)用提供依據(jù)(Yong Y.Peng, AyumiYoshizumi, et al.B1materials, 2010, 31: 2755-2761)。通過高密度發(fā)酵，該重組蛋白Scl2在大腸桿菌中的表達(dá)量最高可達(dá)19 g/L(Y.Y.Peng, LHowell, et al.Microb Cell Fact, 2012, 11: 96-103)。
[0003]CL本身不具有生物功能，但將一些具有特殊功能的氨基酸序列整合到該蛋白中后，可賦予該重組蛋白新的功能，如整合素結(jié)合位點(diǎn)(GERGFPGERGVE)可使得該蛋白對細(xì)胞具有更好的粘附作用和促進(jìn)傷口愈合等作用(Stacy Cereceres, Tyler Touchet, et al.Adv Wound Care (New Roche I Ie), 2015, 4: 444-456；Y.Peng Yong, V1letStoichevska, et al.J B1med Mater Res A, 2014, 102: 2189-2196;Dany J.Munoz-Pinto, Viviana R.Guiza-Arguello, et al.J Mater Chem B, 2015, 3: 7912-7919)、肝素結(jié)合位點(diǎn)(GRPGKPGKQGQK)可使得該蛋白具有結(jié)合肝素的能力(Y.Peng Yong, V1letStoichevska, et al.J B1med Mater Res A, 2014, 102: 2189-2196)、RGD能介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間的粘附作用(Susan L.Beilis.B1materials, 2011，32: 4205-4210)并且含有RGD的多肽可阻止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡(Sabine Zitzmann , VolkerEhemann, et al.Cancer Res, 2002, 62: 5139-5143)等功能，從而使得該蛋白在生物醫(yī)學(xué)材料和組織工程方面的應(yīng)用具有無限的潛力。
[0004]人喊性成纖維細(xì)胞生長因子(humanbasic fibroblast growth factor ,hbFGF)由155個氨基酸組成，分子量約為17.18 kDaAbFGF是細(xì)胞生長和分化的重要調(diào)節(jié)因子，具有促血管生成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞趨化和細(xì)胞迀移等活性，在細(xì)胞分化和機(jī)體發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用(CN102675473A)。
[0005]hbFGF分子量小且不需要進(jìn)行糖基化修飾，因此可在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。但hbFGF在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)不高，這是由于hbFGF容易降解且大多數(shù)還以包涵體的形式存在，使得hbFGF的大規(guī)模制備變得繁瑣、昂貴，從一定程度上限制了該蛋白的廣泛應(yīng)用(J.A.Andrades, J.A.Santamaria, et al.Protoplasma, 2001, 218: 95-103)。將hbFGF與融合蛋白進(jìn)行融合表達(dá)有助于提尚該蛋白的可洛性表達(dá)，如GST、TrxA標(biāo)簽等(ZhiSheng, Shin Bey Chang, et al.Protein ExpresPurif，2003，27: 267-271；S.1msoonthornruksa， K.Pruksananonda， et al.JMolMicrob B1tech, 2015， 25: 372-380)。通過載體中的凝血酶、腸激酶等特異性酶切位點(diǎn)將親和標(biāo)簽和融合蛋白進(jìn)行切除，可獲得成熟的hbFGF。但此類融合蛋白標(biāo)簽隨后卻被丟棄，從而造成了一定的浪費(fèi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明首先要解決的技術(shù)問題是，針對【背景技術(shù)】中的問題，提供一種類膠原蛋白-人堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白。
[0007]為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:該融合蛋白全長488個氨基酸，其氨基酸序列為序列表中的SEQ N0.1,氮端為經(jīng)修飾的化膿鏈球菌來源的類膠原蛋白Sc 12-M，Sc 12-M蛋白長度為327個氨基酸，其氨基酸序列為序列表中的SEQ N0.7，其基因序列為序列表中的SEQN0.8,碳端為人堿性成纖維細(xì)胞生長因子hbFGF，hbFGF蛋白長度為155個氨基酸，其氨基酸序列為序列表中的SEQ N0.2，其基因序列為序列表中的SEQ N0.3，類膠原蛋白Scl2-M和生長因子hbFGF這兩個肽段之間含有腸激酶酶切位點(diǎn)。
[0008]進(jìn)一步地，所述的腸激酶酶切位點(diǎn)的氨基酸序列為Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(序列表中SEQ N0.16。
[0009]本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供上述融合蛋白的制備方法，將含有功能位點(diǎn)的類膠原蛋白Scl2-M作為融合蛋白標(biāo)簽與hbFGF進(jìn)行融合表達(dá)，通過親和純化、腸激酶酶切和離子交換純化等步驟，分別獲得并對該兩者的生物活性進(jìn)行測定，為重組hbFGF和重組類膠原蛋白Scl2-M的高效制備奠定基礎(chǔ)。
[0010]為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:該制備方法包括以下步驟:
(I)人堿性成纖維細(xì)胞生長因子hbFGF和類膠原蛋白Scl2基因的全合成:
根據(jù)人堿性成纖維細(xì)胞生長因子hbFGF和化膿鏈球菌來源的類膠原蛋白Scl2的原始基因序列，按照大腸桿菌密碼子分析用表分別對原始基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并委托上海捷瑞生物科技有限公司，獲得pUCl 9-hbFGF和pET28a-Sc 12質(zhì)粒。優(yōu)化后的hbFGF基因序列如SEQ N0.2所示，氨基酸序列如SEQ N0.3所示;優(yōu)化后的Scl2基因序列如SEQ N0.4所示，氨基酸序列如SEQ N0.5所示。
[0011](2)類膠原蛋白SC12-M的獲取:通過PCR技術(shù)將整合素結(jié)合位點(diǎn)(GERGFPGERGVE)、肝素結(jié)合位點(diǎn)(GRPGKPGKQGQK)和RGD等位點(diǎn)整合到Scl2原始基因序列中，獲得基因Scl2-M并將該基因連接到載體pET28a上，獲得pET28a-Sc 12_M質(zhì)粒。Sc 12-M基因序列如SEQ N0.6所示，氨基酸序列如SEQ N0.7所示。
[0012](3)融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建:通過PCR擴(kuò)增和利用ClonExpress—步法定向克隆無縫克隆試劑盒，將hbFGF基因和Sc 12-M基因進(jìn)行融合，獲得表達(dá)載體pET28a_Sc 12-M-hbFGF，最后，將重組質(zhì)粒送去測序以最終確定基因序列的正確性。
[0013](4)融合蛋白的表達(dá):將重組質(zhì)粒pET28a-Scl2-M-hbFGF轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。挑取重組大腸桿菌單菌落接種至5 mL含有50 yg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37°C過夜培養(yǎng)。然后以1%接種量接種到裝有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中(含50 yg/mL卡那霉素)，37°C，200印111培養(yǎng)至00_到0.8左右。加入終濃度為0.1 mM IPTG，25°C下誘導(dǎo)8-10 h。
[0014](5)融合蛋白在10 L發(fā)酵罐上放大培養(yǎng):從新鮮LB平板上挑取重組菌BL21 (DE3)/pET28a-Scl2-M-hbFGF于裝有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中(含50 yg/mL卡那霉素)，37°C,200 rpm培養(yǎng)過夜。次日，于1%接種量接種于含有350 mL LB培養(yǎng)基的2.5 L搖瓶中(含50yg/mL卡那霉素)，37°C，200 rpm培養(yǎng)至0D600為1.0-1.5左右。以火焰接種法將二級種子液接種至含有7 L甘油培養(yǎng)基的10 L發(fā)酵罐中(含50 yg/mL卡那霉素)，培養(yǎng)溫度為37°C，通氣量30 L/min，最初攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm。當(dāng)OD6qq達(dá)到25左右時，加入終濃度0.1 mM IPTG并將培養(yǎng)溫度由37°C降至25°C進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。每隔兩小時取樣進(jìn)行OD600、甘油濃度和目標(biāo)蛋白表達(dá)情況的分析。
[0015](6)融合蛋白的親和純化:將發(fā)酵結(jié)束的培養(yǎng)液以5，000 rpm離心10 min，棄上清獲得重組菌體，用無菌水洗滌菌體三次，用2倍體積濃縮并懸浮于預(yù)冷的平衡緩沖液bufferA(20 mM咪唑，20 mMTris-HCl ,0.5 M NaCl，pH8.0)中，然后用超聲波破碎細(xì)胞。將所有破碎樣品12，000 rpm離心10 min以分離可溶和不可溶組分，上清即為待純化樣品。將待純化樣品上樣至預(yù)先平衡好的Ni2+填料上，上樣完畢后用平衡緩沖液buffer A沖洗Ni2+填料至平衡；沖洗過后，采用洗脫緩沖液 buffer B(70 mM 咪唑，20 mMTris-HCl，0.5 M NaCl, pH8.0)洗脫雜蛋白至平衡；然后采用洗脫緩沖液buffer C(250mM咪唑，20 mMTris-HCl ,0.5 MNaCl，pH8.0)洗脫目標(biāo)蛋白。
[0016](7)腸激酶酶切:使用密理博小型切向流超濾裝置去除親和層析獲得的融合蛋白Scl2-M-hbFGF洗脫液中的小分子雜質(zhì)，用腸激酶酶切反應(yīng)液(2mMTris-HCl，0.2 mM CaCl2,5mMNaCl，pH7.5)進(jìn)行融合蛋白緩沖液的置換。隨后在融合蛋白中加入一定量的腸激酶，30°C過夜酶切。
[0017](8)重組hbFGF的純化:用緩沖液D(20 mMTris-HCl，pH8.5)沖洗裝有CM SeparoseFF填料的層析柱至A280不再變化，流速為3 mL/min;脫鹽后的樣品以3 mL/min上樣；用緩沖液D沖洗柱子至A280不再變化;控制緩沖液D和E(20 mMTris-HCl ,1 M NaCl，pH8.5)比例，使NaCl濃度分別為0.25,0.5,0.75和I M進(jìn)行梯度洗脫，流速3 mL/min，出峰時用離心管進(jìn)行收集;最后，用緩沖液D沖洗柱子至A280不再變化。將各梯度收集的樣品進(jìn)行蛋白電泳分析，確定目標(biāo)蛋白的最佳洗脫濃度。
[0018](9 )hbFGF的生物活性測定:采用MTT法對純化后獲得的重組hbFGF的生物活性進(jìn)行測定。
【附圖說明】
[0019]圖1a是本發(fā)明構(gòu)建的重組融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pET28-Scl2_M的過程示意圖。
[0020]圖1b是本發(fā)明構(gòu)建的重組融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pET28-Scl2-M-hbFGF的過程示意圖。
[0021]圖2 是大腸桿菌 BL21(DE3)/pET28-Scl2-M 和 BL21(DE3)/pET28-Scl2-M-hbFGF 誘導(dǎo)表達(dá)后目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中，M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；泳道I為大腸桿菌BL21 (DE3)對照菌；泳道2為誘導(dǎo)后的重組大腸桿BL21 (DE3)/pET28-Scl2-M的上清液;泳道3為誘導(dǎo)后的重組大腸桿BL21 (DE3) /pET28-Sc 12-M的上清液。
[0022]圖3是重組Scl2-M-hbFGF在10 L發(fā)酵罐上的表達(dá)。
[0023]圖4是融合蛋白Sc12-M-hbFGF的親和純化，其中，M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；泳道I為重組融合蛋白粗蛋白；泳道2-3為純化后的重組融合蛋白。
[0024]圖5是重組Scl2_M和hbFGF的離子交換純化，其中』為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；泳道I為腸激酶酶切后的重組融合蛋白；泳道2為純化后的重組Sc 12-M ；泳道4-7為純化后的重組hbFGF。
[0025]圖6是重組hbFGF的生物活性測定。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下通過步驟進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行描述:
步驟1、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子hbFGF和類膠原蛋白Scl2基因的全合成:根據(jù)人堿性成纖維細(xì)胞生長因子hbFGF和化膿鏈球菌來源的類膠原蛋白Scl2的原始基因序列，按照大腸桿菌密碼子分析用表分別對原始基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并委托上海捷瑞生物科技有限公司，獲得pUC19-hbFGF和pET28a-Scl2質(zhì)粒。優(yōu)化后的hbFGF基因序列如SEQ N0.2所示，氨基酸序列如SEQ N0.3所示;優(yōu)化后的Scl2基因序列如SEQ N0.4所示，氨基酸序列如SEQ N0.5所示。
[0027]步驟2、類膠原蛋白Scl2-M的獲取:根據(jù)整合素結(jié)合位點(diǎn)(GERGFPGERGVE)、肝素結(jié)合位點(diǎn)(GRPGKPGKQGQK)和RGD位點(diǎn)以及Scl2基因序列，設(shè)計(jì)3對引物:
F Sci2: TTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCCATCACCATCACCATCACGC;(序列8)
R Sci2: CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCACTCGAGATATTTACCCGGTTTACCTGG;(序列9)
F heparin:TAAACGTGGTGATGCTGGTGCTCAAGGCAGGCCGGGTAAGCGGGGTAAACAGGGCCAGAAGGGTGAAAAAGGAGAACGTGGCGATCA;(序列 1 )
R heparin: TTGAGCACCAGCATCACCACGTTTACCTGGAAGACCTTGCG ；(序列 11)
F integrin: GGCCAAAACGGCCAAGATGGTCTTCCAGGTAAAGAC;(序列 12)
R integrin: GGAAGACCATCTTGGCCGTTTTGGCCCTCGACGCCCCTCTCACCCGGGAAACCACGTTCACCATCTTTTCCAGCGGGACCGGCATCGCCTCGCTCC 序列 13 )。
[0028]下劃線為編碼功能位點(diǎn)的堿基序列，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。修飾后的Scl2-M基因序列如SEQ N0.6所示，氨基酸序列如SEQ N0.7所示。
[0029]以載體pET28a-Scl2為模板，分別用引物FSci2和R heparin、F heparin和R integrin、FintegriJPR Scd2擴(kuò)增獲得三個目的基因片段。
[0030]PCR擴(kuò)增完成后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳并進(jìn)行割膠回收。用NcoI和XhoI對質(zhì)粒pET28a進(jìn)行酶切并回收大片段，隨后用ClonExpressTM II One Step Cloning Kit進(jìn)行目的載體的構(gòu)建。反應(yīng)體系為:5 XCE II Buffer 5.0 yL，ExnaseTM II 2.0 yL，線性化克隆載體6.0仙，目的基因片段各4.0仙，總體積為25 yL。
[0031 ]將各溶液進(jìn)行充分混勻，370C下反應(yīng)3-5 h后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)中，復(fù)蘇培養(yǎng)后并涂布50 yg/mL卡那霉素抗性平板上，37°C培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落到含有50 yg/mL卡那霉素抗性的5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C振蕩培養(yǎng)，收集菌體，提取質(zhì)粒，并對質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和測序鑒定，獲得重組質(zhì)粒pET28a-Scl2-M。
[0032]步驟3、融合蛋白質(zhì)粒pET28-Scl2-M-hbFGF的構(gòu)建:以載體pUC19-hbFGF為模板，利用引物F hbFGF: GGTAAACCGGGTAAATATCTCGAGGATGACGATGACAAGATGGCAGCCGGTAGCATTACCACGCTG(序列 14)和R hbFGF:CTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAG(序列 15)擴(kuò)增獲得hbFGF基因。
[0033]PCR擴(kuò)增完成后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳并進(jìn)行割膠回收。用XhoI對質(zhì)粒pET28a-Scl2-M進(jìn)行酶切并回收大片段，隨后用ClonExpress?II One Step Cloning Kit進(jìn)行目的載體的構(gòu)建。反應(yīng)體系為:5XCE II Buffer 4.0 yUExnase? II 2.0 yL，線性化克隆載體4.0 nL，目的基因4.0 PUddH2O 6.0 yL，總體積為20 yL。
[0034]將各溶液進(jìn)行充分混勻，37°C下反應(yīng)Ih后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)中，復(fù)蘇培養(yǎng)后并涂布50 yg/mL卡那霉素抗性平板上，37°C培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落到含有50 ug/mL卡那霉素抗性的5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C振蕩培養(yǎng)，收集菌體，提取質(zhì)粒，并對質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和測序鑒定，獲得重組質(zhì)粒pET28a-Scl2-M-hbFGF。
[0035]步驟4、融合蛋白Scl2-M-hbFGF的表達(dá):將重組質(zhì)粒pET28a-Scl2-M和pET28a-Scl2-M-hbFGF分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中。分別挑取重組大腸桿菌單菌落接種至5mL含有50 ug/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37°C過夜培養(yǎng)。然后以1%接種量接種到裝有50 mLLB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中(含50 yg/mL卡那霉素)，37°C，200 rpm培養(yǎng)至0D600到0.8左右。加入終濃度為0.1 mM IPTG，25°C下誘導(dǎo)8-10 h。從附圖2中可見重組融合蛋白Scl2_M_hbFGF獲得成功表達(dá)，在以LB為培養(yǎng)基時表達(dá)量可達(dá)0.15 g/L且全部可溶。
[0036]步驟5、融合蛋白Sc 12-M-hbFGF在1 L發(fā)酵罐中的放大培養(yǎng):在10 L發(fā)酵罐中對重組菌BL21 (DE3)/pET28a-Scl2-M-hbFGF進(jìn)行間歇發(fā)酵。菌體生長曲線、甘油消耗曲線及重組融合蛋白Sc 12-M-hbFGF的表達(dá)量曲線見附圖3。
[0037]由圖3可知，重組菌體的OD6qq最后可達(dá)102.8，重組Scl2_M_hbFGF的最高表達(dá)量可達(dá)11.32 g/L。重組Scl2-M的理論計(jì)算分子量為33.57 kDa，hbFGF的理論計(jì)算分子量為17.18 kDa，因而可知hbFGF的理論表達(dá)量可達(dá)3.83 g/L。
[0038]步驟6、融合蛋白的親和純化:收集發(fā)酵罐培養(yǎng)所獲得的菌體，細(xì)胞破碎并離心獲得上清液。利用Ni2+親和層析對融合蛋白Scl2-M-hbFGF進(jìn)行分離純化。待樣品上完后，先用Buffer A平衡柱子，再用含不同濃度咪唑的緩沖液Buffer B和Buffer C進(jìn)行洗脫，用SDS-PAGE進(jìn)行分析。
[0039]結(jié)果表明，經(jīng)Ni2+親和層析，可獲得融合蛋白Sc 12-M-hbFGF，純度為83.2%(附圖4)，回收率為70.1%。
[0040]步驟7、離子交換純化:用緩沖液D沖洗裝有CM Separose FF填料的層析柱至A280不再變化，流速為3 mL/min;脫鹽后的樣品以3 mL/min上樣；用緩沖液D沖洗柱子至A280不再變化;控制緩沖液D和E的比例，使NaCl濃度分別為0.25、0.5、0.75和I M進(jìn)行梯度洗脫，流速3 mL/min，出峰時用離心管進(jìn)行收集;最后，用緩沖液D沖洗柱子至A280不再變化。
[0041 ]將各梯度收集的樣品進(jìn)行蛋白電泳分析，確定目標(biāo)蛋白的最佳洗脫濃度，
由附圖5可知經(jīng)離子交換法分離后可獲得純的重組蛋白hbFGF以及融合標(biāo)簽Scl2-M，該步回收率分別為65%和90%左右。
[0042]經(jīng)親和層析、脫鹽、離子交換層析等步驟后，重組蛋白hbFGF的總回收率為38.3%，融合標(biāo)簽Scl 2-M的總回收率為53.4%。
[0043]步驟8、重組hbFGF生物活性測定:將成熟的hbFGF以O(shè)、2、5、10、20、40、60、100和200ng/mL的濃度加入到細(xì)胞維持液中，加入72 h之后經(jīng)MTT法測定發(fā)現(xiàn)2 ng/mL的hbFGF就可顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞株NIH3T3的增殖，當(dāng)hbFGF的加入量為20 ng/mL時，活細(xì)胞數(shù)比不加入hbFGF的陰性對照組的活細(xì)胞總數(shù)提升41.5%，但低于加入10%新生胎牛血清的陽性對照組，結(jié)果見附圖6。
[0044]步驟9、重組Scl2-M生物活性測定:將2 yg的純的重組蛋白Scl2和Scl2_M分別加入到含有細(xì)胞THP-1的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)1.5 h后于顯微鏡下觀測細(xì)胞的生長狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不含有整合素結(jié)合位點(diǎn)和RGD位點(diǎn)的Scl2蛋白對細(xì)胞THP-1的粘附作用不明顯，而含有整合素結(jié)合位點(diǎn)和RGD位點(diǎn)的蛋白Sc 12-M對細(xì)胞THP-1具有一定的粘附作用。
[0045]通過本發(fā)明的制備方法所獲得的類膠原蛋白-人堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白，全長488個氨基酸，如序列N0.1所示，其氮端為經(jīng)修飾的化膿鏈球菌來源的類膠原蛋白5(312^(:12-1蛋白長度為327個氨基酸，如序列^).7所示，碳端為人堿性成纖維細(xì)胞生長因子hbFGF，hbFGF蛋白長度為155個氨基酸，如序列N0.2所示，兩個肽段之間含有腸激酶酶切位點(diǎn)，腸激酶酶切位點(diǎn)序列為Asp-Asp-Asp-Asp-Lys。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種類膠原蛋白-人堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白，其特征在于:該融合蛋白全長488個氨基酸，其氨基酸序列為序列表中SEQ N0.1，氮端為經(jīng)修飾的化膿鏈球菌來源的類膠原蛋白Scl2-M，Scl2-M蛋白長度為327個氨基酸，其氨基酸序列為序列表中的SEQ N0.7，碳端為人堿性成纖維細(xì)胞生長因子hbFGF，hbFGF蛋白長度為155個氨基酸，其氨基酸序列為序列表中的SEQ N0.2，Sc 12-M蛋白和hbFGF蛋白這兩個肽段之間含有腸激酶酶切位點(diǎn)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的類膠原蛋白-人堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白，其特征在于:所述的腸激酶酶切位點(diǎn)序列為Asp-Asp-Asp-Asp-Lys。3.一種類膠原蛋白-人堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白的制備方法，其特征在于它包括下述步驟: (1)類膠原蛋白-人堿性成纖維細(xì)胞生長因子融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建: 1.1人堿性成纖維細(xì)胞生長因子和類膠原蛋白Scl2基因的全合成: 根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛性用表，對人堿性成纖維細(xì)胞生長因子和類膠原蛋白Scl2的基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化;分別獲得pUCl 9-hbFGF和pET28a-Sc 12質(zhì)粒； I.2類膠原蛋白Scl 2-M的獲取: 通過PCR技術(shù)將整合素結(jié)合位點(diǎn)(GERGFPGERGVE)、肝素結(jié)合位點(diǎn)(GRPGKPGKQGQK MPRGD等位點(diǎn)整合到Scl2原始基因序列中，獲得基因Scl2-M并將該基因連接到載體pET28a上，獲得pET28a-Scl2-M質(zhì)粒； 1.3融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建: 通過PCR擴(kuò)增和利用一步法定向克隆技術(shù)，將hbFGF基因和Scl2-M基因進(jìn)行融合，獲得融合蛋白表達(dá)載體pET28a-Sc 12-M-hbFGF ； (2)融合蛋白的表達(dá): 將表達(dá)載體pET28a-Scl2-M-hbFGF轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)并挑取重組子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)； (3)融合蛋白的發(fā)酵培養(yǎng): 對重組菌BL21 (DE3)/pET28a-Scl2-M-hbFGF進(jìn)行間歇發(fā)酵并測定細(xì)胞生物量和目標(biāo)蛋白含量； (4)融合蛋白的親和純化: 采用Ni2+親和層析對重組融合蛋白Scl2-M-hbFGF進(jìn)行分離純化； (5)離子交換層析: 對純的融合蛋白Scl2-M-hbFGF進(jìn)行脫鹽并置換成腸激酶緩沖液，腸激酶過夜酶切后采用離子交換法分別對重組蛋白Scl 2-M和hbFGF進(jìn)行分離純化； (6)生物活性測定:分別對重組蛋白Scl2-M和hbFGF進(jìn)行生物活性的測定。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蛋白hbFGF的活性測定采用MTT測定法，所用細(xì)胞為成纖維細(xì)胞株NIH3T3。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蛋白Scl2-M的活性測定所用細(xì)胞為人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1。
【文檔編號】C12N15/62GK105859892SQ201610401198
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】徐志南, 唐云平, 胡斌, 蔡謹(jǐn), 黃磊
【申請人】浙江大學(xué)