一種透明質(zhì)酸分離純化的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種透明質(zhì)酸的分離純化方法，該方法主要包括以下步驟：發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)行乙醇沉淀、沉淀物溶解，溶解液進(jìn)行乙醇分級(jí)沉淀除雜，再經(jīng)活性炭脫色與乙醇沉淀，沉淀物干燥后即可得到透明質(zhì)酸成品。該方法工藝簡(jiǎn)單，特別能有效去除易造成堵膜現(xiàn)象的菌體懸浮殘?jiān)⒌鞍?、粘稠的大分子顆粒等雜質(zhì)，該工藝過程中無有毒害物引入，在透明質(zhì)酸工業(yè)化生產(chǎn)中具有很強(qiáng)的可行性。
【專利說明】
一種透明質(zhì)酸分離純化的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸的分離純化的方法，尤其涉及乙醇分級(jí)沉淀純化透明質(zhì)酸的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，簡(jiǎn)稱HA)又名玻璃酸，是一種線性大分子黏多糖，透 明質(zhì)酸廣泛存在于各種組織細(xì)胞間質(zhì)中，如皮膚，臍帶，關(guān)節(jié)滑液，軟骨，眼玻璃體，卵細(xì)胞， 血管壁等。在不同的組織中的HA的生理作用也有所不同，在皮膚中主要表現(xiàn)為保水作用，在 關(guān)節(jié)滑液中主要為潤滑作用，在血管壁中主要調(diào)節(jié)通透性，在結(jié)締組織中，透明質(zhì)酸可以與 蛋白結(jié)合成分子量更大的蛋白多糖分子，它是保持疏松結(jié)締組中水分的重要成分?；谕?明質(zhì)酸具有良好的保濕性和增強(qiáng)皮膚組織彈性功能，在國際上被公認(rèn)為是一種生物大分子 保濕劑，用于眼科顯微手術(shù)、關(guān)節(jié)炎治療、高檔化妝品、食品添加劑等領(lǐng)域（帕提古麗.透明 質(zhì)酸國內(nèi)外生產(chǎn)現(xiàn)狀及應(yīng)用前景分析，新疆石油科技，2012，22:66-68)。
[0003]目前，透明質(zhì)酸常用的制備技術(shù)主要有兩種。一種是利用天然原料，即動(dòng)物組織中 提取，主要的原料是人的臍帶，雞冠和牛眼玻璃體等。用丙酮或乙醇將原料脫脂、脫水、風(fēng)干 后，用蒸餾水浸泡、過濾，再以氯化鈉溶液和氯仿溶液處理，之后加以胰蛋白酶保溫后得到 混合液，最后以離子交換劑等方法進(jìn)行精制純化，得到精制透明質(zhì)酸。該方法的提取率極 低，僅為1%左右，另外，該方法利用動(dòng)物原料提取透明質(zhì)酸，由于原料資源有限，制備成本 較高。另一種是利用生物發(fā)酵法制備。生物發(fā)酵法制備透明質(zhì)酸具有產(chǎn)品不受原料資源限 制、生產(chǎn)成本低、工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，目前已得到廣泛使用，并已成為研究HA生產(chǎn)的主要方向， 正逐步取代從動(dòng)物組織中分離提取HA的傳統(tǒng)方法。目前，應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域的透明 質(zhì)酸主要由微生物發(fā)酵生產(chǎn)。
[0004] 從發(fā)酵液中分離純化透明質(zhì)酸是發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的關(guān)鍵步驟之一。透明質(zhì)酸 發(fā)酵液中的菌體殘?jiān)?、蛋白質(zhì)、大分子懸浮物、小分子雜多糖等雜質(zhì)的存在給透明質(zhì)酸的提 取和精制帶來極大的困難，同時(shí)也降低了透明質(zhì)酸的品質(zhì)，限制了其應(yīng)用范圍。目前報(bào)道的 去除HA發(fā)酵液中的菌體殘?jiān)?、大分子懸浮物和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的方法有膜過濾法、凝膠層析 法、離子交換層析法等。膜過濾法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但提取效 率相對(duì)較低，因?yàn)橥该髻|(zhì)酸發(fā)酵液通常比較粘稠，發(fā)酵液中懸浮雜質(zhì)、菌體殘?jiān)纫自斐啥?膜現(xiàn)象，影響提取效率和工藝成本。凝膠層析是基于分離組分之間的分子量大小不同而起 到分離效果，有利于分離去除發(fā)酵液中與透明質(zhì)酸性質(zhì)相似的小分子雜多糖、蛋白質(zhì)等雜 質(zhì)，但凝膠層析方法成本較高，且分離純化的透明質(zhì)酸的提取率也較低。離子交換層析法存 在操作不穩(wěn)定的問題，不易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。因此，開發(fā)高效的、過程簡(jiǎn)單的、容易操作的透明質(zhì) 酸分離純化方法十分必要。
[0005] 乙醇沉淀是分離各種多糖常用的一種方法，可以使HA有效脫水、脫色，從而提高HA 產(chǎn)品品質(zhì)。乙醇沉淀法工藝簡(jiǎn)單易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，目前國內(nèi)外大多數(shù)企業(yè)在透明質(zhì)酸 工業(yè)化生產(chǎn)工藝中均用到了乙醇沉淀方法。如公開號(hào)為CN 101633701A公開的《一種透明質(zhì) 酸的純化方法》采用的2倍乙醇沉淀透明質(zhì)酸，公開號(hào)為CN 101357955A公開的《一種發(fā)酵液 中提取透明質(zhì)酸的方法》采用的3倍乙醇沉淀透明質(zhì)酸。然而，乙醇沉淀不僅能夠沉淀透明 質(zhì)酸，也能夠沉淀透明質(zhì)酸發(fā)酵液中其他很多的雜質(zhì)組分如蛋白、懸浮雜質(zhì)、大分子顆粒， 雜多糖等，盲目的向發(fā)酵液中加入乙醇沉淀透明質(zhì)酸，只會(huì)使透明質(zhì)酸分離效果很差，不能 有效的分離發(fā)酵液中易堵膜的懸浮雜質(zhì)、大分子顆粒、菌體殘?jiān)?、蛋白等雜質(zhì)，增加了后續(xù) 透明質(zhì)酸精制純化的工藝操作。迄今為止，國內(nèi)外文獻(xiàn)與專利中報(bào)道的透明質(zhì)酸純化工藝 在乙醇沉淀步驟中均未實(shí)現(xiàn)透明質(zhì)酸與易堵膜的懸浮雜質(zhì)、大分子顆粒、菌體殘?jiān)?、蛋白?雜質(zhì)很好的分離。
[0006] 分級(jí)沉淀法是指在混合組分的溶液中加入與該溶液能互溶的溶劑，通過改變?nèi)軇?的極性而改變混合組分溶液中某些成分的溶解度，使其從溶液中析出。在透明質(zhì)酸發(fā)酵液 中分次加入乙醇，使含醇量逐步增高，可以達(dá)到逐級(jí)沉淀出分子量段由大到小的蛋白質(zhì)、多 糖、多肽，通過合理的控制乙醇加入量，實(shí)現(xiàn)易堵膜的懸浮雜質(zhì)、蛋白、粘稠的大分子顆粒、 小分子雜多糖等雜質(zhì)與透明質(zhì)酸的有效分離。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明根據(jù)上述技術(shù)背景的不足，提供了一種透明質(zhì)酸的分離純化工藝，該工藝 方法簡(jiǎn)單、成本低廉，可以有效去除易造成堵膜現(xiàn)象的菌體懸浮殘?jiān)?、大部分蛋白、粘稠?大分子顆粒等雜質(zhì)。
[0008] 本發(fā)明提供了一種透明質(zhì)酸的純化方法，包含以下步驟：
[0009] (1)發(fā)酵液中加入CaCl2進(jìn)行絮凝預(yù)處理；
[0010] (2)乙醇沉淀、沉淀物溶解；
[0011] (3)乙醇對(duì)溶解液進(jìn)行分級(jí)沉淀；
[0012] ⑷活性炭脫色除雜；
[0013] (5)乙醇沉淀、干燥。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，向發(fā)酵液中加入0.1~0.5 % (w/v)的CaCl2進(jìn)行絮凝預(yù)處理。 [0015] 在一些實(shí)施方案中，步驟(2)、步驟(3)和步驟(5)中使用的乙醇為95%乙醇或無水 乙醇。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，步驟(2)和步驟(5)加入乙醇至溶液的乙醇濃度為60%-70%。 [0017]在一些實(shí)施方案中，使用乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀，即先向預(yù)處理的發(fā)酵液中加入乙醇 至溶液的乙醇濃度為25%-50%進(jìn)行醇沉除雜，離心或過濾棄除沉淀物雜質(zhì)后，上清液或?yàn)V 液中加入0.5~1.5% (w/v)的無機(jī)鹽固體粉末，攪拌至溶解后，再向溶液中加入乙醇至溶液 的乙醇濃度為60 % -70 %進(jìn)行醇沉，收集透明質(zhì)酸沉淀物。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，步驟(4)中使用1~10% (w/v)的活性炭脫色除雜。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，步驟(2)中沉淀物溶解，即用純化水或無機(jī)鹽溶液溶解沉淀， 使溶解液的電導(dǎo)值為〇~I OmS/cm 〇
[0020] 在一些實(shí)施方案中，無機(jī)鹽為NaCUKCl或MgCl2。
[0021] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種透明質(zhì)酸的純化方法，包含以下步驟：
[0022] (a)向發(fā)酵液中加入0.1~0.5% (w/v)的CaCl2進(jìn)行絮凝預(yù)處理，棄除菌體殘?jiān)?，?清液；
[0023] (b)向清液中加入乙醇至溶液的乙醇濃度為60 % -70 %進(jìn)行醇沉，沉淀物使用純化 水溶解；
[0024] (c)向溶解液中加入乙醇至溶液的乙醇濃度為25 % -50 %進(jìn)行醇沉，離心或過濾棄 除沉淀物雜質(zhì)，上清液或?yàn)V液中加入0.5~1.5 % (w/v)的無機(jī)鹽固體粉末，攪拌至溶解后， 再向溶液中加乙醇至溶液的乙醇濃度為60%_70%進(jìn)行醇沉，收集透明質(zhì)酸沉淀物，沉淀物 使用純化水進(jìn)行溶解；
[0025 ] (d)沉淀溶解后，使用無機(jī)鹽調(diào)節(jié)溶解液的電導(dǎo)至15~30mS/cm;
[0026] (e)使用1~10%(w/v)的活性炭對(duì)溶解液進(jìn)行脫色，抽濾去除活性炭，得濾液；
[0027] (f)向?yàn)V液中加入乙醇至溶液的乙醇濃度為60%-70%進(jìn)行沉淀，棄去上清液，沉 淀物用乙醇洗滌；
[0028] (g)沉淀物在30~80°C條件下真空干燥即可。
[0029] 在一些實(shí)施方案中，向發(fā)酵液中加入0.1~0.5% (w/v)的CaCl2進(jìn)行絮凝預(yù)處理。
[0030] 在一些實(shí)施方案中，步驟(b)、步驟(c)和步驟(f)使用的乙醇為95%乙醇或無水乙 醇。
[0031] 在一些實(shí)施方案中，步驟(b)、步驟(f)加入乙醇至溶液的乙醇濃度為60%-70%。 [0032]在一些實(shí)施方案中，步驟(c)使用乙醇對(duì)溶解液進(jìn)行乙醇分級(jí)沉淀，即先向溶解液 中加入乙醇至溶液的乙醇濃度為25%-50%進(jìn)行醇沉除雜，離心或過濾棄除沉淀物雜質(zhì)后， 上清液或?yàn)V液中加入〇. 5~1.5 % (w/v)的無機(jī)鹽固體粉末，攪拌至溶解后，再向溶液中加入 乙醇至溶液的乙醇濃度為60 % -70 %進(jìn)行醇沉，收集透明質(zhì)酸沉淀物，沉淀物使用純化水進(jìn) 行溶解。
[0033] 在一些實(shí)施方案中，步驟(c)和步驟(d)使用的無機(jī)鹽為NaCUKCl或MgCl2。
[0034] 在一些實(shí)施方案中，步驟(d)使用無機(jī)鹽調(diào)節(jié)溶液的電導(dǎo)至15~30mS/cm。
[0035]在一些實(shí)施方案中，步驟(e)使用1~10% (w/v)的活性炭進(jìn)行脫色。
[0036]在一些實(shí)施方案中，步驟(g)的沉淀物在30~80°C條件下真空干燥。
[0037]本發(fā)明有益效果在于：
[0038]本發(fā)明提供的對(duì)透明質(zhì)酸發(fā)酵液分離純化方法，采用簡(jiǎn)單、易行的乙醇分級(jí)沉淀 處理，可以有效去除易造成堵膜現(xiàn)象的菌體懸浮殘?jiān)⒋蟛糠值鞍?、粘稠的大分子顆粒等雜 質(zhì)，同時(shí)，乙醇分級(jí)沉淀處理過程中通過調(diào)節(jié)發(fā)酵液的電導(dǎo)，又可保證較高的透明質(zhì)酸的收 率。
[0039] 本發(fā)明提供的透明質(zhì)酸發(fā)酵液分離純化方法為清潔生產(chǎn)工藝，無添加任何毒害物 質(zhì)，生產(chǎn)的成品因此更加安全、環(huán)保。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 以下所述的是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所保護(hù)的不限于以下優(yōu)選實(shí)施方 式。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說在此發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的基礎(chǔ)上，做出的若干變形和 改進(jìn)，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例中所用的原料均可以通過商業(yè)途徑獲得。
[0041] 本發(fā)明中使用的透明質(zhì)酸發(fā)酵液由東陽光研究院采用以枯草芽孢桿菌為宿主菌 構(gòu)建的工程菌株發(fā)酵罐發(fā)酵提供。
[0042]實(shí)施例中透明質(zhì)酸干燥物的純度采用咔唑顯色法測(cè)定（參考2015年玻璃酸鈉藥 典），蛋白含量照蛋白含量測(cè)定法（中國藥典2010年版二部附錄WM第二法），透明質(zhì)酸的分 子量采用凝膠色譜法測(cè)定(參考2015年玻璃酸鈉藥典），純化收率的計(jì)算公式為：
[_]透明麵收率=發(fā)。
[0044] 下面簡(jiǎn)寫詞的使用貫穿本發(fā)明：
[0045] CaCl2 氯化鈣
[0046] NaCl 氯化鈉
[0047] MgCl2 氯化鎂
[0048] % 百分比
[0049] w/v 質(zhì)量/體積，或質(zhì)量相對(duì)于體積的含量
[0050] Γ 攝氏度
[0051] g 克
[0052] L 升
[0053] mL 毫升
[0054] g/L 克/升
[0055] min 分鐘
[0056] h 小時(shí)
[0057] rpm 轉(zhuǎn) / 分鐘
[0058] 實(shí)施例1.
[0059] (1)取透明質(zhì)酸發(fā)酵液500mL，加0 · 5% (w/v)CaCl2，充分溶解后3900rpm、20min離 心去除菌體殘?jiān)?，得上清液?br>[0060] (2)向上清液中加入無水乙醇至溶液的乙醇濃度為60 %進(jìn)行醇沉，沉淀物使用等 體積純化水溶解；
[0061 ] (3)先向溶解液中緩慢加入無水乙醇至溶液的乙醇濃度為25 %，邊加邊攪拌， 3900rpm、20min離心棄除沉淀物，上清液中加入1.5% (w/v)的NaCl固體粉末，攪拌至完全溶 解;再緩慢加入無水乙醇至溶液的乙醇濃度為60%，邊加邊攪拌，4°C下靜置2h后分離沉淀 物，用等體積水溶解沉淀物；
[0062] (4)向溶解液中加 NaCl調(diào)節(jié)溶解液電導(dǎo)至30mS/cm;
[0063] (5)再向溶解液中加入10% (w/v)303A活性炭攪拌IOmin，抽濾棄去活性炭；
[0064] (6)向?yàn)V液中緩慢加入無水乙醇至溶液的乙醇濃度為60 %，邊加邊攪拌，4 °C下靜 置2h后分離沉淀物，沉淀物加入IOOmL無水乙醇進(jìn)行洗滌；
[0065] (7)在30°C下用真空干燥箱真空干燥沉淀物至恒重。
[0066]第(5)步抽濾過程中沒有堵塞現(xiàn)象，得到的HA干燥物的純度、蛋白含量、透明質(zhì)酸 分子量及工藝收率的測(cè)定與計(jì)算結(jié)果如表1所示。
[0067] 實(shí)施例2.
[0068] (1)取透明質(zhì)酸發(fā)酵液500mL，加0.1 % (w/v)CaCl2，充分溶解后，抽濾去除菌體殘 渣，得濾液；
[0069] (2)向?yàn)V液中加入95 %乙醇至溶液的乙醇濃度為70 %進(jìn)行醇沉，沉淀物使用等體 積純化水溶解；
[0070] (3)先向溶解液中緩慢加入95 %乙醇至溶液的乙醇濃度為50 %，邊加邊攪拌，抽濾 去除沉淀物雜質(zhì)，濾液中加入1.5 % (w/v)的KCl固體粉末，攪拌至完全溶解;再加入95 %乙 醇至溶液的乙醇濃度為70%，邊加邊攪拌，4°C下靜置2h后分離沉淀物，用等體積水溶解沉 淀物；
[0071] (4)向溶解液中加 KCl調(diào)節(jié)溶解液電導(dǎo)至15mS/cm;
[0072] (5)再向溶解液中加入1 % (w/v)303A活性炭攪拌處理IOmin，抽濾棄去活性炭；
[0073] (6)向?yàn)V液中緩慢加入95%乙醇至溶液酒精度為70%，邊加邊攪拌，4°C下靜置2h 后分離沉淀物，沉淀物用IOOmL 95%乙醇進(jìn)行洗滌；
[0074] (7)在80°C下用真空干燥箱真空干燥沉淀物至恒重。
[0075] 得到的HA干燥物的純度、蛋白含量、透明質(zhì)酸分子量及工藝收率的測(cè)定與計(jì)算結(jié) 果如表1所示。
[0076] 實(shí)施例3.
[0077] (1)取透明質(zhì)酸發(fā)酵液IL，加0 · 5% (w/v)CaCh，充分溶解后，3900rpm、20min離心 去除菌體殘?jiān)?，得上清液?br>[0078] (2)向上清液中加入95 %乙醇至溶液的乙醇濃度為65 %進(jìn)行醇沉，沉淀物使用等 體積純化水溶解；
[0079] (3)先向溶解液中緩慢加入95 %乙醇至溶液的乙醇濃度為40 %，邊加邊攪拌， 3900rpm、20min離心去除沉淀物雜質(zhì)，上清液中加入1.5% (w/v)的MgCh固體粉末，攪拌至 完全溶解;再向過濾后的濾液中緩慢加入95 %乙醇至溶液的乙醇濃度為65 %，邊加邊攪拌， 4 °C下靜置2h后分離沉淀物，用等體積水溶解沉淀物；
[0080] (4)向溶解液中加 MgCl 2調(diào)節(jié)溶解液電導(dǎo)至25mS/cm;
[0081 ] (5)再向溶解液中加入6% (w/v)303A活性炭攪拌處理lOmin，抽濾棄去活性炭；
[0082] (6)向?yàn)V液中緩慢加入95 %乙醇至溶液的乙醇濃度為65 %，邊加邊攪拌，4°C下靜 置2h后分離沉淀物，沉淀物用IOOmL 95 %乙醇進(jìn)行洗滌；
[0083] (7)在50 °C下用真空干燥箱真空干燥沉淀物至恒重。
[0084] 得到的HA干燥物的純度、蛋白含量、透明質(zhì)酸分子量及工藝收率的測(cè)定與計(jì)算結(jié) 果如表1所示。
[0085] 對(duì)比實(shí)施例1.
[0086]如實(shí)施例1所述透明質(zhì)酸分離純化方法，考察乙醇分級(jí)沉淀除雜時(shí)發(fā)酵液的電導(dǎo) 對(duì)乙醇分級(jí)沉淀及終產(chǎn)品的影響，其區(qū)別在于加入乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀前，分別用NaCl調(diào)節(jié) 發(fā)酵液的電導(dǎo)至2mS/cm、5mS/cm、10mS/cm、15mS/cm及25mS/cm。得到的干燥物的純度、蛋白 含量、透明質(zhì)酸分子量及工藝收率的測(cè)定與計(jì)算結(jié)果如表2所示。
[0087]結(jié)果表明，發(fā)酵液的電導(dǎo)對(duì)透明質(zhì)酸的收率有一定的影響。當(dāng)加入乙醇至溶液的 乙醇濃度為25%-50%進(jìn)行沉淀分離雜質(zhì)時(shí)，如果發(fā)酵液電導(dǎo)過高，發(fā)酵液中部分的透明質(zhì) 酸也隨大分子顆粒、雜多糖等懸浮雜質(zhì)一起沉淀下來，造成收率下降，而發(fā)酵液低電導(dǎo)條件 下，透明質(zhì)酸不易沉淀下來，透明質(zhì)酸保持較高的收率。
[0088] 對(duì)比實(shí)施例2.
[0089]如實(shí)施例1所述透明質(zhì)酸分離純化方法，考察不使用乙醇分級(jí)沉淀對(duì)終產(chǎn)品品質(zhì) 的影響，其區(qū)別在于向第⑵步得到的溶解液中加入1.5% (w/v)的NaCl固體粉末，第⑶步 的乙醇分級(jí)沉淀改為直接加入無水乙醇至溶液乙醇濃度為60%沉淀。得到的干燥物的純度 僅為56.32 %、蛋白含量為0.67 %、透明質(zhì)酸分子量為1.3 X 106及工藝收率為70.86%。操作 過程中第(5)步抽濾速度很慢，膜堵塞嚴(yán)重，主要原因是發(fā)酵液中未去除的懸浮雜質(zhì)堵膜造 成。 「00901 丟1播昍席釀純麼、令子量乃蛋白僉量涮宙結(jié)里
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種透明質(zhì)酸的分離純化方法，其特征在于，包含以下步驟： (1) 發(fā)酵液中加入CaCl 2進(jìn)行絮凝預(yù)處理； (2) 乙醇沉淀、沉淀物溶解； (3) 乙醇對(duì)溶解液進(jìn)行分級(jí)沉淀； (4) 活性炭脫色除雜； (5) 乙醇沉淀、干燥。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，向發(fā)酵液中加入0.1~0.5% (w/ v)的CaCl2進(jìn)行絮凝預(yù)處理。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，步驟(2)和步驟(5)加入乙醇至溶 液的乙醇濃度為60%-70%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，步驟(3)中乙醇對(duì)溶解液進(jìn)行分 級(jí)沉淀，即先向溶解液中加入乙醇至溶液的乙醇濃度為25 % -50 %進(jìn)行醇沉除雜，離心或過 濾棄除沉淀物雜質(zhì)后，上清液或?yàn)V液中加入〇. 5~1.5% (w/v)的無機(jī)鹽固體粉末，攪拌至溶 解后，再加入乙醇至溶液的乙醇濃度為60%-70%進(jìn)行醇沉，收集透明質(zhì)酸沉淀物。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，步驟(4)中使用1~10% (w/v)的 活性炭脫色除雜。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的分離純化方法，其特征在于，步驟(2)中沉淀物溶 解，即用純化水或無機(jī)鹽溶液溶解沉淀，使溶解液的電導(dǎo)值為0~10mS/cm。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離純化方法，其特征在于，其中的無機(jī)鹽為NaCl、KCl或 MgCbo8. 根據(jù)權(quán)利要求1任意一項(xiàng)所述的分離純化方法，其特征在于，包含以下步驟： (a) 向發(fā)酵液中加入0.1~0.5%(w/v)的CaCl2進(jìn)行絮凝預(yù)處理，棄除菌體殘?jiān)们逡海? (b) 向清液中加入乙醇至溶液的乙醇濃度為60 % -70 %進(jìn)行醇沉，沉淀物使用純化水溶 解； (c) 向溶解液中加入乙醇至溶液的乙醇濃度為25 % -50 %進(jìn)行醇沉，離心或過濾棄除沉 淀物雜質(zhì)后，上清液或?yàn)V液中加入0.5~1.5% (w/v)的無機(jī)鹽固體粉末，攪拌至溶解后，再 加入乙醇至溶液的乙醇濃度為60 % -70 %進(jìn)行醇沉，收集透明質(zhì)酸沉淀物，沉淀物使用純化 水進(jìn)彳丁溶解； (d) 沉淀溶解后，使用無機(jī)鹽調(diào)節(jié)溶解液的電導(dǎo)至15~30mS/cm; (e) 使用1~10%(w/v)的活性炭對(duì)溶解液進(jìn)行脫色，抽濾去除活性炭，得濾液； (f) 向?yàn)V液中加入乙醇至溶液乙醇濃度為60 % -70 %進(jìn)行沉淀，棄去上清液，沉淀物用 乙醇洗滌； (g) 沉淀物在30~80°C條件下真空干燥即可。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離純化方法，其特征在于，步驟(c)和步驟(d)中的無機(jī)鹽為 NaCl、KCl 或 MgCh。
【文檔編號(hào)】C08B37/08GK105859911SQ201610228235
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月12日
【發(fā)明人】石江水, 王海剛, 林小鵲, 趙裕棟, 張鴻
【申請(qǐng)人】廣東東陽光藥業(yè)有限公司