一種以搔菌余料提取液為原料制備真姬菇液體菌種的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以搔菌余料提取液為原料制備真姬菇液體菌種的方法，包括以下步驟：制備搔菌余料提取液、配置搖瓶培養(yǎng)基、接種、菌球形態(tài)及菌絲含量測定、酶活力測試、發(fā)酵罐擴(kuò)培、制作栽培瓶；其中，搖瓶培養(yǎng)基的配方為：白砂糖36g、玉米粉3.0g、140目豆粕粉8.0g、KH2PO4分析純1.8g、MgSO4·7H2O分析純1.8g、搔菌余料提取液2000mL。本發(fā)明在傳統(tǒng)搖瓶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了搔菌余料作為原料，不僅降低了生產(chǎn)成本，還大幅度縮短了生產(chǎn)周期，使總產(chǎn)量顯著提高，符合農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略。
【專利說明】
一種以搔菌余料提取液為原料制備真姬菇液體菌種的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備真姬菇液體菌種的方法，尤其涉及一種以搔菌余料提取液為 原料制備真姬菇液體菌種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 真姬菇，又名玉蕈、斑玉蕈、荷葉離褶傘。真姬菇味比平菇鮮，肉比滑菇厚，質(zhì)比香 菇韌，口感極佳，還有獨(dú)特的蟹味香，在日本有"香在松口蘑、味在玉蕈"之說。真姬菇中氨基 酸種類齊全，包括8種人體必需氨基酸，其中賴氨酸、精氨酸含量更是高于一般菇類。此外， 從真姬菇子實(shí)體中提取的i3-l，3_D葡聚糖具有很高的抗腫瘤活性，從真姬菇中分離得到的 聚合糖酶的活性也比其他菇類要高很多，其子實(shí)體熱水提取物和有機(jī)溶劑提取物有清楚體 內(nèi)自由基作用，因此，真姬菇有防止便秘、抗癌、防癌、提高免疫力、預(yù)防衰老的多項(xiàng)功效。近 年來，隨著人們對真姬菇的倍受青睞，其產(chǎn)量也在逐漸上升。液體菌種的制作作為真姬菇生 產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，目前其在國內(nèi)的制作方法較為單一，并且原料成本較高，使得真姬菇菌球的 活力提升受到限制，并造成了大量的可回收資源的浪費(fèi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決上述技術(shù)所存在的不足之處，本發(fā)明提供了一種以搔菌余料提取液為原 料制備真姬菇液體菌種的方法。
[0004] 為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種以搔菌余料提取液為原 料制備真姬菇液體菌種的方法，包括以下步驟：
[0005] A、制備搔菌余料提取液：富集真姬菇搔菌后的廢棄余料，按照料水比1:25進(jìn)行配 置，配置完成后室溫下靜止24h，然后用八層紗布或過濾裝置過濾，過濾后的濾液即為搔菌 余料提取液；
[0006] B、配置搖瓶培養(yǎng)基:搖瓶培養(yǎng)基的配方為：
[0007] 白砂糖36g、玉米粉3.0g、
[0008] 140 目豆柏粉 8 · 0g、KH2P04 分析純 1 · 8g、
[0009] MgSO4 · 7H2〇分析純1.8g、搔菌余料提取液2000mL;
[0010] 調(diào)pH至6.0~6.9后，將上述培養(yǎng)基分裝至含轉(zhuǎn)子的三角燒瓶中；用棉塞塞緊三角 燒瓶瓶口，并用鋁箱紙包緊瓶口，121°C下高壓滅菌30~60min;滅菌結(jié)束后，冷卻至室溫；
[0011] C、接種:在無菌環(huán)境下，用接種環(huán)鉤取真姬菇母種菌塊8~10塊，轉(zhuǎn)接到冷卻后的 搖瓶培養(yǎng)基中，20~25 °C條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7天，搖床轉(zhuǎn)速150r/min;
[0012] D、菌球形態(tài)及菌絲含量測定:搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后，首先觀察培養(yǎng)瓶內(nèi)菌球形態(tài)及液 體澄清度，然后用PH計測試菌液的pH，判斷菌種的生長狀況;再隨機(jī)抽取三個搖瓶菌種，放 在磁力攪拌器上將菌種攪碎，用注射器吸取IOg菌液于已知質(zhì)量的離心管中，配平后離心棄 上清液，通過稱量沉淀和離心管的質(zhì)量，計算出菌絲的平均含量，并與常規(guī)方法制備的菌種 菌絲含量相對比；
[0013] E、酶活力測試:隨機(jī)抽取九個搖瓶菌種，平均分成三組;首先制備粗酶液并繪制葡 萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線;將三組搖瓶菌種在磁力攪拌器上攪拌破碎，分別取5mL破碎后的菌液于IOmL 離心管內(nèi)，3500r/min離心10min，取上清液做為粗酶液;得到的三組粗酶液分別進(jìn)行羧甲基 纖維素酶酶活、半纖維素酶酶活、漆酶酶活的測試，并與常規(guī)方法制備的粗酶液酶活進(jìn)行對 比；
[0014] F、發(fā)酵罐擴(kuò)培:發(fā)酵培養(yǎng)基按照搖瓶培養(yǎng)基配方進(jìn)行等比例配制；按每個發(fā)酵罐 700L進(jìn)行培養(yǎng)基的配制，調(diào)pH至6.0~6.9后高壓滅菌;將發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至室 溫，接種步驟C中搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后的菌液;20~25°C條件下發(fā)酵培養(yǎng)7天，通氣量0.1 MP;
[0015] G、制作栽培瓶:稱取玉米芯、米糠、麩皮、棉籽殼、玉米粉、木肩，將上述原材料攪拌 混合25min，然后邊加搔菌余料提取液邊繼續(xù)攪拌40~50min，調(diào)制成含水量為65% ± I、pH 為6.3~6.9的混合材料;在栽培瓶中種入上述混合材料，使每瓶標(biāo)重為1020 ± 20g;采用五 孔打眼法，使料面平整距離栽培瓶瓶口 2. Ocm，121°C高壓滅菌80~IOOmin，冷卻至室溫，最 后接種步驟F中發(fā)酵擴(kuò)培后的液體菌種。
[0016]葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法如下：
[00?7] I、精確稱取無水葡萄糖250.0 mg，溶于蒸餾水中并定容至250mL，得到1.0 mg/mL的 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液;將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至Omg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、 0·8mg/mL、I·Omg/mL;
[0018] Π 、通過DNS法測定上述不同濃度的葡萄糖溶液在540nm波長處的吸光度值，繪制 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。
[0019] 羧甲基纖維素酶酶活的測試方法為:在20ml具塞試管中加入0.5 %的羧甲基纖維 素鈉1.5mL，再加入稀釋10倍的粗酶液0.5mL，于50 °C恒溫水浴鍋中水浴30min，取出后立即 加入DNS試劑3mL，然后放入100°C熱水浴中5min，取出冷卻至室溫后用蒸餾水定容至20mL， 混勻；用分光光度計在540nm處測定OD值，以煮沸15min滅活酶液為對照，計算酶活力。
[0020] 半纖維素酶酶活的測試方法為:在20mL具塞試管中加入0.5%的小麥秸桿半纖維 素溶液1.5mL;小麥秸桿半纖維素溶液用pH為4.8，濃度為0. lmol/L的醋酸鹽緩沖液配置;再 加入稀釋10倍的粗酶液〇. 5mL，50 °C恒溫水浴鍋中水浴30min，取出后立即加入DNS試劑3mL， 然后放入l〇〇°C熱水浴中5min，取出冷卻至室溫后用蒸餾水定容至20mL，混勻；用分光光度 計在540nm處測定OD值，以煮沸15min滅活酶液為對照，計算酶活力。
[0021] 漆酶酶活的測試方法為:在20mL具塞試管中加入0.5mL 80mmol/L的愈創(chuàng)木酚，加 入0.1111〇1/1、？!1為4.8的醋酸緩沖液31^，加入粗酶液0.11^，于28°(：下反應(yīng)301^11，之后用分 光光度計在490nm波長處測定OD值，以煮沸15min的滅活酶液作為對照，計算酶活。
[0022] 本發(fā)明在傳統(tǒng)搖瓶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了搔菌余料作為原料，不僅降低了生產(chǎn)成 本，還大幅度縮短了生產(chǎn)周期，使總產(chǎn)量顯著提高，符合農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略。
【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明的整體流程圖。
[0024]圖2為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0026] 如圖1所示，本發(fā)明包括以下步驟：
[0027] A、制備搔菌余料提取液：富集真姬菇搔菌后的廢棄余料，按照料水比1:25進(jìn)行配 置，配置完成后室溫下靜止24h，然后用八層紗布或過濾裝置過濾，過濾后的濾液即為搔菌 余料提取液；
[0028] B、配置搖瓶培養(yǎng)基:搖瓶培養(yǎng)基的配方為：
[0029] 白砂糖36g、玉米粉3.0g、
[0030] 140 目豆柏粉8 · Og、KH2P〇4分析純 1 · 8g、
[0031] MgS〇4 · 7H20分析純1 · 8g、搔菌余料提取液2000mL;
[0032] 調(diào)pH至6.0~6.9后，將上述培養(yǎng)基分裝至含轉(zhuǎn)子的三角燒瓶中；用棉塞塞緊三角 燒瓶瓶口，并用鋁箱紙包緊瓶口，121°C下高壓滅菌30~60min;滅菌結(jié)束后，冷卻至室溫； [0033] C、接種:在無菌環(huán)境下，用接種環(huán)鉤取真姬菇母種菌塊8~10塊，轉(zhuǎn)接到冷卻后的 搖瓶培養(yǎng)基中，20~25 °C條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7天，搖床轉(zhuǎn)速150r/min;
[0034] D、菌球形態(tài)及菌絲含量測定:搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后，首先觀察培養(yǎng)瓶內(nèi)菌球形態(tài)及液 體澄清度，然后用PH計測試菌液的pH，判斷菌種的生長狀況;再隨機(jī)抽取三個搖瓶菌種，放 在磁力攪拌器上將菌種攪碎，用注射器吸取IOg菌液于已知質(zhì)量的離心管中，配平后離心棄 上清液，通過稱量沉淀和離心管的質(zhì)量，計算出菌絲的平均含量，并與常規(guī)方法制備的菌種 菌絲含量相對比；
[0035] E、酶活力測試:隨機(jī)抽取九個搖瓶菌種，平均分成三組;首先制備粗酶液并繪制葡 萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線;得到的三組粗酶液分別進(jìn)行羧甲基纖維素酶酶活、半纖維素酶酶活、漆酶酶 活的測試，并與常規(guī)方法制備的粗酶液酶活進(jìn)行對比；
[0036] F、發(fā)酵罐擴(kuò)培:發(fā)酵培養(yǎng)基按照搖瓶培養(yǎng)基配方進(jìn)行等比例配制；按每個發(fā)酵罐 700L進(jìn)行培養(yǎng)基的配制，調(diào)pH至6.0~6.9后高壓滅菌;將發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至室 溫，接種步驟C中搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后的菌液;20~25°C條件下發(fā)酵培養(yǎng)7天，通氣量0.1 MP;
[0037] G、制作栽培瓶:稱取玉米芯、米糠、麩皮、棉籽殼、玉米粉、木肩，將上述原材料攪拌 混合25min，然后邊加搔菌余料提取液邊繼續(xù)攪拌40~50min，調(diào)制成含水量為65% ± I、pH 為6.3~6.9的混合材料;在栽培瓶中種入上述混合材料，使每瓶標(biāo)重為1020 ± 20g;采用五 孔打眼法，使料面平整距離栽培瓶瓶口 2. Ocm，121°C高壓滅菌80~IOOmin，冷卻至室溫，最 后接種步驟F中發(fā)酵擴(kuò)培后的液體菌種。
[0038]本發(fā)明的具體發(fā)明過程如下：
[0039] (1)提取液成分的篩選
[0040] a、為了將真姬菇生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢棄物重新利用，選定三種提取液成分進(jìn)行篩 選，即滅菌后培養(yǎng)料提取液、菌絲滿瓶后菌絲培養(yǎng)料復(fù)合物提取液、真姬菇搔菌后的廢棄余 料;對滅菌后培養(yǎng)料、菌絲滿瓶后菌絲培養(yǎng)料復(fù)合物、搔菌余料分別按料水比1:15進(jìn)行配 置，室溫下靜止24h，八層紗布或過濾裝置過濾，過濾后的濾液即分別為上述三種提取液，同 時選用蒸餾水做對比實(shí)驗(yàn)；
[0041] b、配置分別含有上述三種提取液成分的液體培養(yǎng)基及對比培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方 為：
[0042] 白砂糖40g、玉米粉4.0g、
[0043] 140 目豆柏粉6 · Og、KH2P〇4分析純 I · 8g、
[0044] MgS〇4 · 7H20分析純 I · 8g、提取液或水2000mL;
[0045] 調(diào)pH至6.0~6.9，121 °C下高壓滅菌30~60min，冷卻至室溫；
[0046] c、將真姬菇母種菌塊分別轉(zhuǎn)接到上述四種液體培養(yǎng)基中，22°C搖瓶培養(yǎng)7~9天；
[0047] d、搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后，觀察四種液體培養(yǎng)基下的菌球形態(tài)、液體澄清度;搖瓶菌種靜 止IOmin后，若上清液澄清透明、表面無或有少量泡沫、菌球顆粒大小均勻一致、菌球表面菌 絲呈發(fā)散狀，則菌種生長良好，可以正常使用;若上清液渾濁、表面有大量泡沫、菌球表面光 滑、說明搖瓶菌種已經(jīng)污染或老化，不可使用;菌絲形態(tài)以菌球小、菌刺豐滿、菌球大小一致 為好；用pH計測定三種提取液的pH，pH在6~7之間較好;打碎搖瓶菌種后離心棄上清，計算 菌絲含量;通過菌球形態(tài)、澄清度、菌絲含量，確定出適合做液體種子的提取液，比較結(jié)果如 表1所示；
[0048] 表1、四種液體菌種的形態(tài)特征、菌絲含量
[0051 ]由表1可知，三種提取液跟普通蒸餾水培養(yǎng)基相比都適合真姬菇液體菌種的生長， 從菌絲形態(tài)及菌絲含量考慮，搔菌余料提取液制作的液體菌種，菌球大小一致，且菌絲含量 適中，因此選擇搔菌余料提取液為主要原料制備真姬菇液體菌種。
[0052] (2)正交試驗(yàn)
[0053] 對選定的以搔菌余料提取液為原料的液體培養(yǎng)基配方進(jìn)行五因素四水平的正交 試驗(yàn)，各因素及水平的設(shè)置如表2所示；
[0054] 表2、正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)置表
[0056]按照五因素四水平的正交試驗(yàn)配方，分別制備液體菌種;正交試驗(yàn)表如表3所示； [0057] 表3、正交試驗(yàn)表
[0060]搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后，對得到的16種液體菌種進(jìn)行菌種形態(tài)、菌絲含量的測定;確定出 最佳正交試驗(yàn)配方;正交試驗(yàn)結(jié)果如表4所示；
[0061 ] 表4、正交試驗(yàn)結(jié)果

[0064] 通過正交試驗(yàn)表可知，正交試驗(yàn)中得出的最優(yōu)組合為:A2B2C3D 3E3，即：
[0065] 白砂糖36g、玉米粉3.0g、
[0066] 140 目豆柏粉8 · 0g、KH2P04分析純 1 · 8g、
[0067] 料水比為1:25。
[0068] (3)酶活測試
[0069]對正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)培養(yǎng)基配方進(jìn)行羧甲基纖維素酶酶活、半纖維素酶酶活和 漆酶酶活的測定;首先制備粗酶液并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線;將三組搖瓶菌種在磁力攪拌器 上攪拌破碎，分別取5mL破碎后的菌液于IOmL離心管內(nèi)，3500r/min離心10min，取上清液做 為粗酶液，4°C低溫保藏;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法如下：
[0070] 精確稱取無水葡萄糖250.0 mg，溶于蒸餾水中并定容至250mL，得到1.0 mg/mL的葡 萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至〇mg/mL、0 · 2mg/mL、0 · 4mg/mL、0 · 6mg/mL、 0.8mg/mL、1.0 mg/mL;通過DNS法測定上述不同濃度的葡萄糖溶液在540nm波長處的吸光度 值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示;得出回歸方程:y = 1.766x-0.0002，R2 = 0.997。
[0071] 得到的三組粗酶液分別進(jìn)行羧甲基纖維素酶酶活、半纖維素酶酶活、漆酶酶活的 測試，并與常規(guī)培養(yǎng)基配方制備的粗酶液酶活進(jìn)行對比；定義OD值每分鐘改變0.001為一個 酶活力單位。常規(guī)培養(yǎng)基配方為：
[0072] 白砂糖40g、玉米粉4.0g、
[0073] 140 目豆柏粉6 · 0g、KH2P04分析純 1 · 8g、
[0074] MgSO4 · 7H2〇分析純 1.8g、蒸餾水2000mL;
[0075] 羧甲基纖維素酶酶活的測試方法為:在20ml具塞試管中加入0.5%的羧甲基纖維 素鈉1.5mL，再加入稀釋IO倍的粗酶液0.5mL，于50 °C恒溫水浴鍋中水浴30min，取出后立即 加入DNS試劑3mL，然后放入100°C熱水浴中5min，取出冷卻至室溫后用蒸餾水定容至20mL， 混勻；用分光光度計在540nm處測定OD值，以煮沸15min滅活酶液為對照，計算酶活力。
[0076] 半纖維素酶酶活的測試方法為:在20mL具塞試管中加入0.5%的小麥秸桿半纖維 素溶液1.5mL;小麥秸桿半纖維素溶液用pH為4.8，濃度為0. lmol/L的醋酸鹽緩沖液配置;再 加入稀釋10倍的粗酶液〇. 5mL，50 °C恒溫水浴鍋中水浴30min，取出后立即加入DNS試劑3mL， 然后放入l〇〇°C熱水浴中5min，取出冷卻至室溫后用蒸餾水定容至20mL，混勻；用分光光度 計在540nm處測定OD值，以煮沸15min滅活酶液為對照，計算酶活力。
[0077] 漆酶酶活的測試方法為:在20mL具塞試管中加入0.5mL 80mmol/L的愈創(chuàng)木酚，加 入0.1111〇1/1、？!1為4.8的醋酸緩沖液31^，加入粗酶液0.11^，于28°(：下反應(yīng)301^11，之后用分 光光度計在490nm波長處測定OD值，以煮沸15min的滅活酶液作為對照，計算酶活。各酶活的 結(jié)果如表5所不。
[0078] 表5、酶活測試結(jié)果
[0081]由表5可知，以搔菌余料提取液為主要原料制備的真姬菇液體菌種，與常規(guī)配方制 得的真姬菇液體菌種相比，羧甲基纖維素酶酶活、半纖維素酶酶活和漆酶酶活活力均得到 有效提尚。
[0082] (4)擴(kuò)培并制作栽培瓶
[0083]參照正交試驗(yàn)最優(yōu)結(jié)果進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的配制，即選用培養(yǎng)基配方為：
[0084] 白砂糖36g、玉米粉3.0g、
[0085] 140 目豆柏粉8 · 0g、KH2P04分析純 1 · 8g、
[0086] MgSO4 · 7H2〇分析純1 · 8g、搔菌余料提取液2000mL;
[0087] 其中，料水比按照1:25進(jìn)行配制；接種后發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)7天；配制栽培瓶材料，滅 菌、冷卻至室溫后接種上述發(fā)酵擴(kuò)培后的菌種。出菇試驗(yàn)結(jié)果如表6表示。
[0088] 表6、菌絲長勢及出菇情況
[0090] +++代表菌絲長速濃密。
[0091 ]由表6可知，搔菌余料提取液菌種制備的栽培瓶出菇產(chǎn)量更高、生產(chǎn)周期更短。 [0092]以每日生產(chǎn)20萬瓶栽培瓶的工廠為例，本發(fā)明的有益效果為：金針菇出菇后的每 瓶凈重由238g增加到242g，金針菇產(chǎn)量增加以及成本節(jié)約每日為公司帶來的直接利潤為三 萬元;此外，使用本發(fā)明制備的搖瓶培養(yǎng)周期由9d縮短至7d;接種栽培瓶后，出菇時間由原 來的100天縮短至96天，生產(chǎn)周期的縮短又可以給公司帶來額外利潤。
[0093]搔菌余料經(jīng)過微生物的發(fā)酵作用之后，粗纖維含量已大幅降低，粗蛋白含量則顯 著提高，并且含有較豐富的氨基酸、菌類多糖及微量元素，因此，在搖瓶培養(yǎng)基中添加搔菌 余料提取液可降低其它營養(yǎng)物質(zhì)的添加量，從而降低生產(chǎn)成本;此外，通過微生物的作用， 搔菌余料中可能產(chǎn)生一些提高菌球活力的次生代謝產(chǎn)物，使搖瓶周期、發(fā)酵周期均明顯縮 短;使用搔菌余料提取液制作栽培瓶，可以使真姬菇盡早的從營養(yǎng)生長期轉(zhuǎn)變到生殖生長 期，從而縮短了出菇周期，提高了產(chǎn)量。
[0094]上述實(shí)施方式并非是對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不僅限于上述舉例，本技術(shù)領(lǐng) 域的技術(shù)人員在本發(fā)明的技術(shù)方案范圍內(nèi)所做出的變化、改型、添加或替換，也均屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種以搔菌余料提取液為原料制備真姬菇液體菌種的方法，其特征在于:所述方法 包括以下步驟： A、 制備搔菌余料提取液:富集真姬菇搔菌后的廢棄余料，按照料水比1:25進(jìn)行配置，配 置完成后室溫下靜止24h，然后用八層紗布或過濾裝置過濾，過濾后的濾液即為搔菌余料提 取液； B、 配置搖瓶培養(yǎng)基:搖瓶培養(yǎng)基的配方為： 白砂糖36g、玉米粉3.0g、 140目豆柏粉8 · Og、KH2P〇4分析純1 · 8g、 MgS〇4 · 7H20分析純1.8g、搔菌余料提取液2000mL; 調(diào)pH至6.0~6.9后，將上述培養(yǎng)基分裝至含轉(zhuǎn)子的三角燒瓶中；用棉塞塞緊三角燒瓶 瓶口，并用鋁箱紙包緊瓶口，121°C下高壓滅菌30~60min;滅菌結(jié)束后，冷卻至室溫； C、 接種:在無菌環(huán)境下，用接種環(huán)鉤取真姬菇母種菌塊8~10塊，轉(zhuǎn)接到冷卻后的搖瓶 培養(yǎng)基中，20~25 °C條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7天，搖床轉(zhuǎn)速150r/min; D、 菌球形態(tài)及菌絲含量測定:搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后，首先觀察培養(yǎng)瓶內(nèi)菌球形態(tài)及液體澄 清度，然后用pH計測試菌液的pH，判斷菌種的生長狀況;再隨機(jī)抽取三個搖瓶菌種，放在磁 力攪拌器上將菌種攪碎，用注射器吸取l〇g菌液于已知質(zhì)量的離心管中，配平后離心棄上清 液，通過稱量沉淀和離心管的質(zhì)量，計算出菌絲的平均含量，并與常規(guī)方法制備的菌種菌絲 含量相對比； E、 酶活力測試:隨機(jī)抽取九個搖瓶菌種，平均分成三組;首先制備粗酶液并繪制葡萄糖 標(biāo)準(zhǔn)曲線;將三組搖瓶菌種在磁力攪拌器上攪拌破碎，分別取5mL破碎后的菌液于10mL離心 管內(nèi)，3500r/min離心10min，取上清液做為粗酶液;得到的三組粗酶液分別進(jìn)行羧甲基纖維 素酶酶活、半纖維素酶酶活、漆酶酶活的測試，并與常規(guī)方法制備的粗酶液酶活進(jìn)行對比； F、 發(fā)酵罐擴(kuò)培:發(fā)酵培養(yǎng)基按照搖瓶培養(yǎng)基配方進(jìn)行等比例配制；按每個發(fā)酵罐700L 進(jìn)行培養(yǎng)基的配制，調(diào)pH至6.0~6.9后高壓滅菌;將發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至室溫，接 種步驟C中搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后的菌液;20~25°C條件下發(fā)酵培養(yǎng)7天，通氣量0.1 MP; G、 制作栽培瓶:稱取玉米芯、米糠、麩皮、棉籽殼、玉米粉、木肩，將上述原材料攪拌混合 25min，然后邊加搔菌余料提取液邊繼續(xù)攪拌40~50min，調(diào)制成含水量為65% ± 1、pH為6.3 ~6.9的混合材料;在栽培瓶中種入上述混合材料，使每瓶標(biāo)重為1020 ± 20g;采用五孔打眼 法，使料面平整距離栽培瓶瓶口 2.0cm，121°C高壓滅菌80~lOOmin，冷卻至室溫，最后接種 步驟F中發(fā)酵擴(kuò)培后的液體菌種。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以搔菌余料提取液為原料制備真姬菇液體菌種的方法，其特 征在于:所述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法如下： I、精確稱取無水葡萄糖250.0 mg，溶于蒸餾水中并定容至250mL，得到1.0mg/mL的葡萄 糖標(biāo)準(zhǔn)溶液;將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至〇mg/mL、0 · 2mg/mL、0 · 4mg/mL、0 · 6mg/mL、0 · 8mg/ mL、1·Omg/mL; Π 、通過DNS法測定上述不同濃度的葡萄糖溶液在540nm波長處的吸光度值，繪制葡萄 糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以搔菌余料提取液為原料制備真姬菇液體菌種的方法，其特 征在于:所述羧甲基纖維素酶酶活的測試方法為:在20ml具塞試管中加入0.5%的羧甲基纖 維素鈉1.5mL，再加入稀釋10倍的粗酶液0.5mL，于50°C恒溫水浴鍋中水浴30min，取出后立 即加入DNS試劑3mL，然后放入100°C熱水浴中5min，取出冷卻至室溫后用蒸餾水定容至 20mL，混勻；用分光光度計在540nm處測定0D值，以煮沸15min滅活酶液為對照，計算酶活力。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以搔菌余料提取液為原料制備真姬菇液體菌種的方法，其特 征在于:所述半纖維素酶酶活的測試方法為:在20mL具塞試管中加入0.5 %的小麥秸桿半纖 維素溶液1.5mL;所述小麥秸桿半纖維素溶液用pH為4.8，濃度為0. lmol/L的醋酸鹽緩沖液 配置;再加入稀釋10倍的粗酶液〇. 5mL，50 °C恒溫水浴鍋中水浴30min，取出后立即加入DNS 試劑3mL，然后放入100°C熱水浴中5min，取出冷卻至室溫后用蒸餾水定容至20mL，混勾；用 分光光度計在540nm處測定0D值，以煮沸15min滅活酶液為對照，計算酶活力。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以搔菌余料提取液為原料制備真姬菇液體菌種的方法，其特 征在于:所述漆酶酶活的測試方法為:在20mL具塞試管中加入0.5mL 80mmol/L的愈創(chuàng)木酸， 加入0.1111〇1/1、？!1為4.8的醋酸緩沖液31^，加入粗酶液0.11^，于28°(：下反應(yīng)301^11，之后用 分光光度計在490nm波長處測定0D值，以煮沸15min的滅活酶液作為對照，計算酶活。
【文檔編號】C12N1/14GK105861328SQ201610346268
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】安雪
【申請人】沈陽德寶嘉泓農(nóng)業(yè)科技有限公司