奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌及其分離方法
【專利摘要】一種奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌及其分離方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是在奶牛糞便中分離出甲烷氧化菌的奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌及其分離方法。本發(fā)明的菌株，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏號(hào)為CGMCC No.11836。本發(fā)明的有益效果是：甲烷氧化菌能夠以溫室氣體甲烷作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，對(duì)于減少甲烷產(chǎn)生即減少溫室效應(yīng)具有一定作用。甲烷氧化菌能降解鹵化碳?xì)浠衔?，在自然界碳循環(huán)和工業(yè)生物技術(shù)以及環(huán)境治理中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。以甲烷氧化菌為主要成分制備益生菌制劑應(yīng)用于臨床，對(duì)于由反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵引起的甲烷廢氣排放及動(dòng)物攝入能量的浪費(fèi)起到至關(guān)重要的作用。CGMCC No. 1183620151207
【專利說明】
奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著溫室效應(yīng)的日益加劇，溫室氣體研究已引起各國學(xué)者的廣泛關(guān)注。甲烷是一 種僅此于二氧化碳的溫室氣體。研究表明，甲烷(CH 4)的溫室效應(yīng)是二氧化碳(CO2)的20~ 30倍，對(duì)全球氣候變暖的影響作用占15%~20%。在全球家畜的甲烷排放量中，反芻動(dòng)物占 97%，而牛類(除水牛外）約占75%。在我國，動(dòng)物胃腸道發(fā)酵排放甲烷量占甲烷總排放量的 29.7%。研究認(rèn)為，通常奶牛生產(chǎn)中有6%~10%的攝入總能被轉(zhuǎn)化為甲烷，以噯氣的形式排 放到大氣中。反芻動(dòng)物甲烷的排放不僅造成了攝入量的巨大損失，同時(shí)也造成了對(duì)環(huán)境得 污染。因此，如何減少反芻動(dòng)物甲烷排放，對(duì)減緩氣候變暖和高效利用飼料具有重要現(xiàn)實(shí)意 義。
[0003] 反芻動(dòng)物排放甲烷與其特有的消化生理特點(diǎn)有關(guān)。反芻動(dòng)物可通過瘤胃和后腸發(fā) 酵產(chǎn)生甲烷。據(jù)估測(cè)，約94%的甲烷是由瘤胃產(chǎn)生的。反芻動(dòng)物瘤胃中有大量纖維分解菌、 產(chǎn)甲烷菌和其他厭氧微生物，飼料進(jìn)入瘤胃后首先進(jìn)行厭氧發(fā)酵，微生物將碳水化合物和 其他植物纖維發(fā)酵分解成揮發(fā)性脂肪酸、氫氣和二氧化碳等，而產(chǎn)生的二氧化碳、甲酸、乙 酸、甲胺和次甲胺等在甲烷生成菌的作用下合成甲烷。甲烷很難被自身消化利用，產(chǎn)生的甲 烷主要以噯氣的方式通過其口腔和鼻孔釋放，腸道產(chǎn)生的甲烷約90%通過血液循環(huán)到肺部， 也是通過口腔排出，而其余10%的甲烷則由肛門排出。
[0004] 瘤胃內(nèi)甲烷的調(diào)控主要通過鹵代物及其衍生物、微生物調(diào)控和飼料添加劑的調(diào) 控。其中々化物及其類似化合物是反會(huì)動(dòng)物體內(nèi)CH4生成的有效抑制劑，如三氯乙烷、三氯 乙炔、溴氯甲烷等，均對(duì)產(chǎn)甲烷菌有毒害抑制作用，可抑制20%~80%的CH4產(chǎn)生。水合氯醛 在瘤胃中轉(zhuǎn)化成氯仿，氯仿可以降低CH4的生成，但是水合氯醛損壞肝臟、長(zhǎng)期飼喂會(huì)引起 動(dòng)物中毒，甚至死亡，所以不運(yùn)用于實(shí)際生產(chǎn)中。飼料添加劑則多含抗生素，在畜產(chǎn)品中產(chǎn) 生大量殘留，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重威脅，越來越多的消費(fèi)者反對(duì)其在日糧中的使用。最為安 全與高效的則是微生物調(diào)控，瘤胃內(nèi)微生物主要包括原蟲、乙酸菌、甲烷氧化菌等。大量研 究表明甲烷氧化細(xì)菌能夠以甲烷作為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)，將甲烷(或甲基化合物）同 化為細(xì)胞碳，并在此過程中獲得生長(zhǎng)所需的碳源和能量。甲烷氧化菌氧化瘤胃內(nèi)甲烷的途 徑有兩條，一條是通過由乙醛酸到絲氨酸的途徑，另一條是甲醛結(jié)合在磷酸核糖上生成6- 磷酸阿洛酮糖的途徑。通過甲烷氧化菌利用甲烷生長(zhǎng)是減少反芻動(dòng)物瘤胃及胃腸道甲烷排 放的一個(gè)重要途徑。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是在奶牛糞便中分離出甲烷氧化菌的奶牛糞便中分離的甲烷氧化 菌及其分離方法。
[0006] 本發(fā)明的菌株，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏號(hào)為CGMCC No.11836。
[0007] 本發(fā)明的菌劑，其活性成分為奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌表達(dá)菌株，CGMCC No.11836。
[0008] 本發(fā)明的奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌，其培養(yǎng)基組成成分重量份為： 八液：1012?〇4〇.8~1.1、恥2冊(cè)〇4.12!12〇2.8~3.0、]\%5〇4.7112〇0.30~0.34、（順4)23〇4 2 2.8~ 3.2； 微量元素 B液：MgS〇4.7H20 2.8~3.2、MnS〇4.2H20 0.3~0.6、Nacl 0.8~1.2、FeS〇4.7H20 0.08~1.02、CaCl2_2H200.08~1.02、ZnS04_7H200.08~1.02、CuS04_5H200.008~0.012、AlK (SO4)2 0.008-0.012^H3BO3 0.008-0.012^Na2MoO4-2H20 0.008-0.012； 將A液、B液按99:1的比例進(jìn)行混合，作為甲烷氧化菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基。
[0009 ]本發(fā)明的奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌，其分離方法是： a、 樣本采集:取奶牛場(chǎng)營養(yǎng)狀況良好、無患病健康奶牛的新鮮糞便20g于含有200 ml 匪S培養(yǎng)基的無菌瓶中，充分震蕩、混勻轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)室備用； b、 取步驟a獲得的混合液體充分振蕩，用紗布過濾，以10%接種量接種，一次培養(yǎng):取濾 液20 ml于含有200 ml滅菌NMS液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，用橡膠塞塞緊密封，每天向培養(yǎng)瓶 中加入甲醇200 ul;搖床條件：170r/min、37°C空氣搖床培養(yǎng);二次培養(yǎng):取上述菌液2 ml以 1%的接種量接種于新的含有200 ml滅菌NMS培養(yǎng)基的錐形瓶中，每天向培養(yǎng)瓶中加入甲醇 200 U1，用橡膠塞塞緊密封，空氣搖床170r/min、37 °C以甲醇為唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng);三次培 養(yǎng):培養(yǎng)4-5天到達(dá)菌液對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取上述變粉菌液2 ml以1%的接種量接種于新的含有 200 ml滅菌NMS培養(yǎng)基的錐形瓶中，每天向培養(yǎng)瓶中加入甲醇200 ul，用橡膠塞塞緊密封， 空氣搖床170r/min、37°C以甲醇為唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng)； c、 甲烷氧化菌的純化培養(yǎng)： ⑴匪S固體培養(yǎng)基的制備:取配制好的匪S液體培養(yǎng)基與瓊脂粉以1.5%~2%比例進(jìn)行混 合，121°C高壓蒸汽滅菌20min，將滅菌好的培養(yǎng)基在超凈工作臺(tái)中倒入玻璃平皿中，待平皿 中培養(yǎng)基凝固即為NMS固體培養(yǎng)基； ⑵甲烷氧化菌平板劃線分離:取步驟b經(jīng)過三次富集培養(yǎng)過程中處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的甲 烷氧化菌菌液轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5ml離心管中，封蓋備用；打開離心管，將無菌接種環(huán)伸入菌 液中，沾取一環(huán)菌液，打開平皿，將沾有菌液的接種環(huán)在固體培養(yǎng)基的第一區(qū)域上劃三至五 條平行線;取新的無菌接種環(huán)，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域劃三至五條平行線； 如此重復(fù)以上操作在第三、第四、第五區(qū)域進(jìn)行劃線；劃線完畢后將甲醇加至平皿蓋，倒置 平皿放入37 °C恒溫箱中培養(yǎng)，底部甲醇揮發(fā)為甲烷氧化菌生長(zhǎng)提供碳源； d、 24小時(shí)候即生長(zhǎng)出甲烷氧化菌。
[0010] 本發(fā)明的奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌，菌液基因組DNA序列為SEQ ID N0:1。
[0011]本發(fā)明的奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌，菌液基因組DNA的提取： ①取1~3 mL細(xì)菌培養(yǎng)液，12000g離心2分鐘；倒掉培養(yǎng)基，加入180 yLTE緩沖液懸浮菌 體，加入18 yL 50mg/mL溶菌酶和5 yL RNA酶，30°C中靜置15~30分鐘；5000g離心5分鐘，倒 掉上清，預(yù)留10 yL上清液；加入25 mg GlassBeads和200 yL Buffer TL，懸浮細(xì)胞，最大速 度渦漩5分鐘，靜置，使玻璃珠沉淀于管底，轉(zhuǎn)移上清至1.5 mL離心管中；加入25 yL蛋白酶 K，渦漩10秒，瞬時(shí)離心；將混合液置于50°C振蕩培養(yǎng)箱中溫浴30分鐘，如果沒有振蕩培養(yǎng) 箱，期間每隔2~3分鐘瞬時(shí)渦漩一次以混勻；加入220 yL Buffer BL，渦漩混勻，65°C溫浴10 分鐘;加入220 yL無水乙醇，渦漩20秒混勻;將DNA吸附柱插入收集管中，轉(zhuǎn)移所有混合液到 吸附柱中，1000 Og離心1分鐘結(jié)合DNA，丟棄收集管和廢液;將吸附柱放入另一收集管中，加 入500 yLBuffer KB，10000g離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中；加入650 μ LDNAWashBuf f er，1000 Oxg離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中；加入450 μ LDNAWashBuffer，1000 Og離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱放入新的收集管中；1000 Og開蓋離 心2分鐘以干燥吸附膜;將吸附柱放入1.5 mL離心管，加入50~100 yL預(yù)熱的洗脫液(65°C)， 使吸附膜于65°C靜置5分鐘；1000 Oxg離心1分鐘洗脫DNA;再次加入50~100 yL洗脫液，第2次 洗脫； ②聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):用已提取的目的菌基因組總DNA為模板，用16S rDNA通用引物對(duì)目 的菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 引物16SrDNA設(shè)計(jì)： 上游引物:5 ' ~AGAGTTTGATCATGGCTCAG~3 ' 下游引物：5 ' ~TACGGTTACCTTGTTACGACTT~3 ' PCR反應(yīng)體系如下： 模板DNA Iul 上游引物 Iul 下游引物 Iul 2XTaq plus 12.5ul ddH20 9.5ul PCR反應(yīng)條件： 95 °C 預(yù)變性 7min; 94 °C 變性 30s，58 °C 退火 30s，72 °C 延伸 40s; 30 個(gè)循環(huán)；72 °C 延伸 5min; PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外分析儀檢測(cè);利用凝膠回收試劑盒回收 純化目的片段后與載體PGM-T連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，挑取單克隆，使用快速小提試 劑盒提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后送檢測(cè)序。
[0012] 奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌，系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建:將所測(cè)得的序列在NCBI上進(jìn) 行比對(duì)，選取相關(guān)序列以ClustalW軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)后，用MGE 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是： 1.甲烷氧化菌能夠以溫室氣體甲烷作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，對(duì)于減少甲烷產(chǎn)生即減少溫室 效應(yīng)具有一定作用。
[0014] 2.甲烷氧化菌能降解鹵化碳?xì)浠衔铮谧匀唤缣佳h(huán)和工業(yè)生物技術(shù)以及環(huán)境 治理中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0015] 3.以甲烷氧化菌為主要成分制備益生菌制劑應(yīng)用于臨床，對(duì)于由反芻動(dòng)物瘤胃發(fā) 酵引起的甲烷廢氣排放及動(dòng)物攝入能量的浪費(fèi)起到至關(guān)重要的作用。
【附圖說明】
[0016] 圖1是菌落形態(tài)圖； 圖2是革蘭氏染色圖； 圖3是M17 16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖； 圖4是系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建圖； 圖5是溫度對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響曲線圖； 圖6是pH對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響曲線圖； 圖7是不同底物對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響柱狀圖； 圖8是菌株在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)規(guī)律曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明菌株，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏號(hào)為CGMCC No.11836。
[0018] 保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào) 保藏日期:2015年12月7日 保藏編號(hào):CGMCC No. 11836 分類命名：甲基桿菌Methylobacterium sp. 〇
[0019] 本發(fā)明菌劑，其活性成分為奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌表達(dá)菌株，CGMCC No.11836。
[0020] 本發(fā)明奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌，其培養(yǎng)基組成成分重量份為： 八液：1012?〇4〇.8~1.1、恥2冊(cè)〇4.12!12〇2.8~3.0、]\%5〇4.7112〇0.30~0.34、（順4)23〇4 2 2.8~ 3.2； 微量元素 B液：MgS〇4.7H20 2.8~3.2、MnS〇4.2H20 0.3~0.6、Nacl 0.8~1.2、FeS〇4.7H20 0.08~1.02、CaCl2_2H200.08~1.02、ZnS04_7H200.08~1.02、CuS04_5H200.008~0.012、AlK (SO4)2 0.008-0.012^H3BO3 0.008-0.012^Na2MoO4-2H20 0.008-0.012； 將A液、B液按99 : 1的比例進(jìn)行混合，作為甲烷氧化菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基（Higgens nitrate minimal salt ，NMS)〇
[0021 ]本發(fā)明奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌，其分離方法是： a、 樣本采集:取奶牛場(chǎng)營養(yǎng)狀況良好、無患病健康奶牛的新鮮糞便20g于含有200 ml 匪S培養(yǎng)基的無菌瓶中，充分震蕩、混勻轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)室備用； b、 取步驟a獲得的混合液體充分振蕩，用紗布過濾，以10%接種量接種，一次培養(yǎng):取濾 液20 ml于含有200 ml滅菌NMS液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，用橡膠塞塞緊密封，每天向培養(yǎng)瓶 中加入甲醇200 u 1 (甲醇的最佳添加量為0.05~0.1%，V/V)，確保培養(yǎng)瓶中甲醇的量能夠維 持甲烷氧化菌對(duì)于甲醇的消耗，即以甲醇為唯一碳源進(jìn)行富集培養(yǎng)。搖床條件：170r/min、 37 °C空氣搖床培養(yǎng);培養(yǎng)4-5天時(shí)菌液變渾池，因?yàn)榈谝淮谓臃N時(shí)還殘留樣本中的雜質(zhì)，所 以并沒有很明顯的顏色變化。二次培養(yǎng):取上述菌液2 ml以1%的接種量接種于新的含有200 ml滅菌匪S培養(yǎng)基的錐形瓶中，每天向培養(yǎng)瓶中加入甲醇200 ul，用橡膠塞塞緊密封，空氣 搖床170r/min、37°C以甲醇為唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng);培養(yǎng)1天后菌液變渾濁，培養(yǎng)2-3天后菌液 由渾濁變?yōu)闇\粉色，當(dāng)培養(yǎng)4-5天時(shí)甲烷氧化菌達(dá)到對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，菌液由淺粉變?yōu)樯罘凵?三次培養(yǎng):培養(yǎng)4-5天到達(dá)菌液對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且菌液顏色變?yōu)樯罘凵珪r(shí)，取上述變粉菌液2 ml以1%的接種量接種于新的含有200 ml滅菌NMS培養(yǎng)基的錐形瓶中，每天向培養(yǎng)瓶中加入 甲醇200 ul，用橡膠塞塞緊密封，空氣搖床170r/min、37°C以甲醇為唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng)； C、甲烷氧化菌的純化培養(yǎng)： ⑴匪S固體培養(yǎng)基的制備:取配制好的匪S液體培養(yǎng)基與瓊脂粉以1.5%~2%比例進(jìn)行混 合，121°C高壓蒸汽滅菌20min，將滅菌好的培養(yǎng)基在超凈工作臺(tái)中倒入玻璃平皿中，待平皿 中培養(yǎng)基凝固即為NMS固體培養(yǎng)基； ⑵甲烷氧化菌平板劃線分離:取步驟b經(jīng)過三次富集培養(yǎng)過程中處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的甲 烷氧化菌菌液轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5ml離心管中，封蓋備用；打開離心管，將無菌接種環(huán)伸入菌 液中，沾取一環(huán)菌液，打開平皿，將沾有菌液的接種環(huán)在固體培養(yǎng)基的第一區(qū)域上劃三至五 條平行線。取新的無菌接種環(huán)，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域劃三至五條平行線。 如此重復(fù)以上操作在第三、第四、第五區(qū)域進(jìn)行劃線。劃線過程中注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基，從 上一區(qū)域劃線末端向下一新的區(qū)域劃線時(shí)需更換新的無菌接種環(huán)且最后一個(gè)區(qū)域的劃線 不能與第一區(qū)域相連。劃線完畢后將甲醇加至平皿蓋，倒置平皿放入37°C恒溫箱中培養(yǎng)，底 部甲醇揮發(fā)為甲烷氧化菌生長(zhǎng)提供碳源。
[0022] d、24小時(shí)候即生長(zhǎng)出甲烷氧化菌。
[0023]甲烷氧化菌的鑒定： 形態(tài)學(xué)觀察 將分離得到的甲烷氧化菌菌株用平板劃線的方法在平板上37°C恒溫培養(yǎng)96 h左右，觀 察平板上的菌落形態(tài)、顏色、透明度、菌落邊緣隆起情況等。
[0024] 理化性質(zhì)鑒定 革蘭氏染色：首先將經(jīng)過適當(dāng)培養(yǎng)的菌液進(jìn)行涂片和固定。用草酸銨結(jié)晶紫染液染 Imin，水洗，滴加盧氏碘液沖去殘水并覆蓋約Imin，水洗并吸干水分。滴加95%的酒精，脫色， 至流下的酒精剛剛不出現(xiàn)紫色為止，立即水洗。再用番紅復(fù)染液染色1~2min，水洗。干燥后 油鏡。
[0025]甲基紅試驗(yàn):將菌株接種于甲基紅試驗(yàn)培養(yǎng)基，于37 °C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48~72h后 取培養(yǎng)液加入干凈試管，然后加入甲基紅試劑1~2滴，觀察培養(yǎng)液顏色變化，呈現(xiàn)紅色為陽 性，淡紅色為弱陽性，黃色為陰性。
[0026]產(chǎn)H2S試驗(yàn)：將菌株接種于硫化氫試驗(yàn)培養(yǎng)基，于37 °C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48~72h。觀 察培養(yǎng)基顏色變化，若變黑色為陽性反應(yīng)，反之為陰性反應(yīng)。
[0027]接觸酶試驗(yàn)：將菌種用接種環(huán)取少許涂于已滴有3%過氧化氫的玻片上，如有氣泡 產(chǎn)生則 為陽性，無氣泡為陰性。
[0028]檸檬酸鹽利用試驗(yàn):將菌株接種于檸檬酸鹽培養(yǎng)基，于37 °C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48h 后觀察結(jié)果，若培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌苔且培養(yǎng)基變藍(lán)色即為陽性;無菌生長(zhǎng)、培養(yǎng)基為綠色則為 陰性。
[0029] 靛基質(zhì)（吲哚)試驗(yàn):將菌株接種于吲哚試驗(yàn)培養(yǎng)基，于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h 后取培養(yǎng)液加入干凈試管，然后加入乙醚，充分振蕩后沿管壁緩緩滴加吲哚試劑5~10滴，有 紅色環(huán)出現(xiàn)則為陽性，反之則為陰性。
[0030] 淀粉水解試驗(yàn):取適當(dāng)培養(yǎng)的菌種點(diǎn)接于淀粉水解培養(yǎng)基平板上，于37°C恒溫培 養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出平板打開平皿蓋，在平板上滴加盧氏碘液，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板。 若菌落周圍出現(xiàn)無色透明圈，則說明淀粉已經(jīng)被水解，表示該菌具有分解淀粉的能力，即為 陽性;若仍然為蘭黑色則說明淀粉沒被水解，為陰性。
[0031]明膠液化試驗(yàn):將菌株穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，20°C培養(yǎng)7天，逐日觀察明膠液化 現(xiàn)象。若室溫較高導(dǎo)致明膠液化則觀察前將培養(yǎng)基置于4°C冰箱30 min后取出觀察。若培養(yǎng) 基仍呈液化狀態(tài)則為陽性，反之則是陰性。
[0032] 本發(fā)明奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌，菌液基因組DNA序列為SEQ ID NO: 1。
[0033]由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司完成目的菌株的16SrDNA部分序列測(cè)序，釆用 BLAST軟件在GeneBank上進(jìn)行同源性比較。
[0034]本發(fā)明奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌，菌液基因組DNA的提?。?① 取1~3 mL細(xì)菌培養(yǎng)液，12000g離心2分鐘；倒掉培養(yǎng)基，加入180 yLTE緩沖液懸浮菌 體，加入18 yL 50mg/mL溶菌酶和5 yL RNA酶，30°C中靜置15~30分鐘；5000g離心5分鐘，倒 掉上清，預(yù)留10 yL上清液；加入25 mg GlassBeads和200 yL Buffer TL，懸浮細(xì)胞，最大速 度渦漩5分鐘，靜置，使玻璃珠沉淀于管底，轉(zhuǎn)移上清至1.5 mL離心管中；加入25 yL蛋白酶 K，渦漩10秒，瞬時(shí)離心；將混合液置于50°C振蕩培養(yǎng)箱中溫浴30分鐘，如果沒有振蕩培養(yǎng) 箱，期間每隔2~3分鐘瞬時(shí)渦漩一次以混勻；加入220 yL Buffer BL，渦漩混勻，65°C溫浴10 分鐘;加入220 yL無水乙醇，渦漩20秒混勻;將DNA吸附柱插入收集管中，轉(zhuǎn)移所有混合液到 吸附柱中，1000 Og離心1分鐘結(jié)合DNA，丟棄收集管和廢液;將吸附柱放入另一收集管中，加 入500 yLBuffer KB，10000g離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中；加入650 μ LDNAWashBuf f er，1000 Oxg離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中；加入450 μ LDNAWashBuffer，1000 Og離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱放入新的收集管中；1000 Og開蓋離 心2分鐘以干燥吸附膜;將吸附柱放入1.5 mL離心管，加入50~100 yL預(yù)熱的洗脫液(65°C)， 使吸附膜于65°C靜置5分鐘；1000 Oxg離心1分鐘洗脫DNA;再次加入50~100 yL洗脫液，第2次 洗脫； ② 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):用已提取的目的菌基因組總DNA為模板，用16S rDNA通用引物對(duì)目 的菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 引物16SrDNA設(shè)計(jì)： 上游引物:5 ' ~AGAGTTTGATCATGGCTCAG~3 ' 下游引物：5 ' ~TACGGTTACCTTGTTACGACTT~3 ' PCR反應(yīng)體系如下： 模板DNA Iul 上游引物 Iul 下游引物 Iul 2XTaq plus 12.5ul ddH20 9.5ul PCR反應(yīng)條件： 95 °C 預(yù)變性 7min; 94 °C 變性 30s，58 °C 退火 30s，72 °C 延伸 40s; 30 個(gè)循環(huán)；72 °C 延伸 5min; PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外分析儀檢測(cè);利用凝膠回收試劑盒回收 純化目的片段后與載體PGM-T連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，挑取單克隆，使用快速小提試 劑盒提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后送檢測(cè)序。
[0035]本發(fā)明奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌，系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：將所測(cè)得的序列在 NCBI上進(jìn)行比對(duì)，選取相關(guān)序列以ClustalW軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)后，用MAGE 5.1構(gòu)建系 統(tǒng)發(fā)育樹。
[0036]不同溫度、PH、底物對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響： 溫度對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響： 將甲烷氧化菌Ml7接種于液體培養(yǎng)基，設(shè)定溫度在20 °045 °C之間，每5 °C為一個(gè)梯度進(jìn) 行培養(yǎng)，96 h后測(cè)定各個(gè)溫度梯度內(nèi)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的OD值。
[0037] pH對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響： 將甲烷氧化菌Ml 7接種于液體培養(yǎng)基，設(shè)定pH分別為4、5、6、7、8、9、10，37 °C恒溫培養(yǎng)箱 培養(yǎng)96 h后，測(cè)定各個(gè)PH梯度內(nèi)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的OD值。
[0038]不同底物對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響 分別用麥芽糖，蔗糖，葡萄糖，淀粉，甲醇作為碳源，每天加入定量上述碳源于液體培養(yǎng) 基，37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)96h后測(cè)定不同底物培養(yǎng)條件下甲烷氧化菌的OD值。
[0039]菌株在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)規(guī)律： 在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)菌體培養(yǎng)液的OD值。以1%的接種量把甲烷氧化菌接入到培養(yǎng)瓶中， 通入I: I (v/v)的空氣和甲烷氣體。37°C搖床培養(yǎng)，每隔24 h在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)菌液的OD值。
[0040] 試驗(yàn)結(jié)果 1、甲烷氧化菌的篩選 將純化培養(yǎng)得到的不同單一菌株接種到液體培養(yǎng)基中，通入10%甲烷氣體，37°C氣浴搖 床培養(yǎng)，分別在3天和7天后測(cè)定培養(yǎng)瓶中甲烷氣體含量，根據(jù)其對(duì)甲烷的消耗率從而得到 氧化甲燒能力最強(qiáng)的目的菌株，命名為Ml 7。
[0041] 2、甲烷氧化菌的鑒定 2.1生理生化鑒定 菌株在平板培養(yǎng)基上形成隆起的短矩形菌落，表面光滑，灰白色半透明狀，較濕潤(rùn)，直 徑較小約0.5~Imm左右。在顯微鏡下觀察，其個(gè)體形態(tài)呈短桿狀，革蘭氏染色陰性（圖1和圖 2)。產(chǎn)H2S試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)為陰性；甲基紅試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、淀粉水解試 驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)為陽性。
[0042] 表1甲院氧化菌M17的生理生化特征
2.2分子生物學(xué)鑒定 (1)菌株M17的16SrDNA的序列擴(kuò)增及測(cè)定 提取菌株M17的基因組DNA，以細(xì)菌16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊 脂糖電泳分析，結(jié)果如圖3所示。
[0043] PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化目的片段后與載體PGM-T連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿 菌DH5a中，挑取單克隆，使用快速小提試劑盒提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后送檢測(cè)序，共 IlOlbp，SEQ ID NO:1。
[0044] 采用BLAST軟件在GeneBank上對(duì)菌株M17的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)M17 的 16SrDNA序列與甲基桿菌屬（Methylobacterium radiotolerans JCM plasmid pMRAD)關(guān) 系最緊密。
[0045] (2)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 將所測(cè)得的序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，調(diào)出GenBank中已鑒定菌株的相似種屬16S rDNA 序列，以ChistalW進(jìn)行序列多重比對(duì)后，用MGE 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。
[0046]不同溫度、PH、底物對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響 溫度對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響： 將甲烷氧化菌M17接種于液體培養(yǎng)基，分別于溫度為20°O45°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每5°C 為一個(gè)梯度，96 h后測(cè)定其OD值，如圖5所示，甲烷氧化菌Ml7的最適生長(zhǎng)溫度在35°〇40°C 之間。
[0047] pH對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響： 將甲烷氧化菌Ml 7接種pH分別為4、5、6、7、8、9、10的液體培養(yǎng)基，于37 °C恒溫培養(yǎng)96 h 后，測(cè)定甲烷氧化菌OD值，如圖6所示，結(jié)果表明菌株在PH =7.0時(shí)生長(zhǎng)最為良好。
[0048]不同底物對(duì)甲烷氧化菌生長(zhǎng)的影響 分別用麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、甲醇作為碳源，每天加入定量上述碳源于液體培養(yǎng) 基，37°C培養(yǎng)96 h后測(cè)其OD值，如圖7所示，甲烷氧化菌能夠以甲醇、麥芽糖、蔗糖和葡萄糖 為碳源較好的生長(zhǎng)，其中對(duì)于甲醇的利用效果最為明顯，而以淀粉作為碳源時(shí)生長(zhǎng)緩慢或 不生長(zhǎng)。
[0049]菌株在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)規(guī)律:（圖8) 在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)菌體培養(yǎng)液的OD值。以1%的接種量把甲烷氧化菌接入到培養(yǎng)瓶中， 通入I: I (v/v)的空氣和甲烷氣體。37°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每隔24 h在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)菌體的 OD值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌菌株，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心保藏號(hào)為CGMCC No.11836。2. -種菌劑，其活性成分為奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌表達(dá)菌株，CGMCC No. 11836。3. 權(quán)利要求1所述奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌，其特征在于:其培養(yǎng)基組成成分重量 份為： 八液：1012?〇4〇.8~1.1、似2冊(cè)〇4.12!12〇2.8~3.0、]\%5〇4.7112〇0.30~0.34、（順4)23〇4 2 2.8~ 3.2； 微量元素 B液：MgS〇4.7H20 2.8~3.2、MnS〇4.2H20 0.3~0.6、Nacl 0.8~1.2、FeS〇4.7H20 0.08~1.02、CaCl2_2H20 0.08~1.02、ZnS〇4_7H20 0.08~1.02、CuS〇4_5H20 0.008~0·012、Α1Κ (S〇4)2 0.008~0·012、Η3Β〇3 0.008~0.012、Na2Mo〇4_2H2〇 0.008~0.012; 將A液、B液按99:1的比例進(jìn)行混合，作為甲烷氧化菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基。4. 權(quán)利要求1所述奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌，其特征在于:其分離方法是： a、 樣本采集：取奶牛場(chǎng)營養(yǎng)狀況良好、無患病健康奶牛的新鮮糞便20g于含有200 ml 匪S培養(yǎng)基的無菌瓶中，充分震蕩、混勻轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)室備用； b、 取步驟a獲得的混合液體充分振蕩，用紗布過濾，以10%接種量接種，一次培養(yǎng):取濾 液20 ml于含有200 ml滅菌NMS液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，用橡膠塞塞緊密封，每天向培養(yǎng)瓶 中加入甲醇200 ul;搖床條件：170r/min、37°C空氣搖床培養(yǎng);二次培養(yǎng):取上述菌液2 ml以 1%的接種量接種于新的含有200 ml滅菌NMS培養(yǎng)基的錐形瓶中，每天向培養(yǎng)瓶中加入甲醇 200 U1，用橡膠塞塞緊密封，空氣搖床170r/min、37 °C以甲醇為唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng);三次培 養(yǎng):培養(yǎng)4-5天到達(dá)菌液對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取上述變粉菌液2 ml以1%的接種量接種于新的含有 200 ml滅菌NMS培養(yǎng)基的錐形瓶中，每天向培養(yǎng)瓶中加入甲醇200 ul，用橡膠塞塞緊密封， 空氣搖床170r/min、37°C以甲醇為唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng)； c、 甲烷氧化菌的純化培養(yǎng)： ⑴匪S固體培養(yǎng)基的制備：取配制好的匪S液體培養(yǎng)基與瓊脂粉以1.5%~2%比例進(jìn)行混 合，121°C高壓蒸汽滅菌20min，將滅菌好的培養(yǎng)基在超凈工作臺(tái)中倒入玻璃平皿中，待平皿 中培養(yǎng)基凝固即為NMS固體培養(yǎng)基； ⑵甲烷氧化菌平板劃線分離：取步驟b經(jīng)過三次富集培養(yǎng)過程中處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的甲 烷氧化菌菌液轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5ml離心管中，封蓋備用；打開離心管，將無菌接種環(huán)伸入菌 液中，沾取一環(huán)菌液，打開平皿，將沾有菌液的接種環(huán)在固體培養(yǎng)基的第一區(qū)域上劃三至五 條平行線;取新的無菌接種環(huán)，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域劃三至五條平行線； 如此重復(fù)以上操作在第三、第四、第五區(qū)域進(jìn)行劃線；劃線完畢后將甲醇加至平皿蓋，倒置 平皿放入37 °C恒溫箱中培養(yǎng)，底部甲醇揮發(fā)為甲烷氧化菌生長(zhǎng)提供碳源； d、 24小時(shí)候即生長(zhǎng)出甲烷氧化菌。5. 權(quán)利要求1所述奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌，其特征在于:菌液基因組DNA序列為 SEQ ID N0:1。6. 權(quán)利要求5所述奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌，其特征在于:菌液基因組DNA的提?。?①取1~3 mL細(xì)菌培養(yǎng)液，12000g離心2分鐘；倒掉培養(yǎng)基，加入180 yLTE緩沖液懸浮菌 體，加入18 yL 50mg/mL溶菌酶和5 yL RNA酶，30°C中靜置15~30分鐘；5000g離心5分鐘，倒 掉上清，預(yù)留10 yL上清液；加入25 mg GlassBeads和200 yL Buffer TL，懸浮細(xì)胞，最大速 度渦漩5分鐘，靜置，使玻璃珠沉淀于管底，轉(zhuǎn)移上清至1.5 mL離心管中；加入25 yL蛋白酶 K，渦漩10秒，瞬時(shí)離心；將混合液置于50°C振蕩培養(yǎng)箱中溫浴30分鐘，如果沒有振蕩培養(yǎng) 箱，期間每隔2~3分鐘瞬時(shí)渦漩一次以混勻；加入220 yL Buffer BL，渦漩混勻，65°C溫浴10 分鐘;加入220 yL無水乙醇，渦漩20秒混勻;將DNA吸附柱插入收集管中，轉(zhuǎn)移所有混合液到 吸附柱中，l〇〇〇〇g離心1分鐘結(jié)合DNA，丟棄收集管和廢液;將吸附柱放入另一收集管中，加 入500 yLBuffer KB，10000g離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中；加入650 μ LDNAWashBuf f er，lOOOOxg離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中；加入450 μ LDNAWashBuffer，10000g離心1分鐘，倒掉廢液，將吸附柱放入新的收集管中；10000g開蓋離 心2分鐘以干燥吸附膜;將吸附柱放入1.5 mL離心管，加入50~100 yL預(yù)熱的洗脫液(65°C)， 使吸附膜于65°C靜置5分鐘；lOOOOxg離心1分鐘洗脫DNA;再次加入50~100 yL洗脫液，第2次 洗脫； ②聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：用已提取的目的菌基因組總DNA為模板，用16S rDNA通用引物對(duì)目 的菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 引物16SrDNA設(shè)計(jì)： 上游引物:5 ' ~AGAGTTTGATCATGGCTCAG~3 ' 下游引物：5 ' ~TACGGTTACCTTGTTACGACTT~3 ' PCR反應(yīng)體系如下： 模板DNA lul 上游引物 lul 下游引物 lul 2 XTaq plus 12.5ul ddH20 9.5ul PCR反應(yīng)條件： 95°C 預(yù)變性 7min;94°C 變性 30s，58°C 退火 30s，72°C 延伸 4〇8;30個(gè)循環(huán)；72°(：延伸51^11; PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外分析儀檢測(cè);利用凝膠回收試劑盒回收 純化目的片段后與載體PGM-T連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，挑取單克隆，使用快速小提試 劑盒提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后送檢測(cè)序。7.權(quán)利要求5所述奶牛糞便中分離的甲烷氧化菌，其特征在于：系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建:將 所測(cè)得的序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，選取相關(guān)序列以ClustalW軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)后，用 MAGE 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK105861353SQ201610012765
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年1月11日
【發(fā)明人】劉國文, 劉歡, 李心慰, 王哲, 李小兵, 趙晨旭
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)