谷氨酸棒桿菌fx69在凈化豬場(chǎng)污水厭氧出水中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了谷氨酸棒桿菌FX69在凈化豬場(chǎng)污水厭氧出水中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)對(duì)采集自福州某富營(yíng)養(yǎng)化河道底泥的樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)，利用溴百里酚藍(lán)(BTB)選擇性培養(yǎng)基和硝酸鹽還原試驗(yàn)初篩，模擬人工合成污水凈化試驗(yàn)復(fù)篩，獲得一株具有較好脫氮功效的谷氨酸棒桿菌FX69。該菌對(duì)豬場(chǎng)污水厭氧出水處理液中NH4+?N去除率為87％，NO2??N去除率為92％，COD降解率為71％，具有較好的除氮和降解COD的效果。本發(fā)明提供了谷氨酸棒桿菌的新的應(yīng)用方向，也為污水處理提供了新的菌種資源。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
谷氨酸棒桿菌FX69在凈化豬場(chǎng)污水厭氧出水中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)與污水處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及谷氨酸棒桿菌FX69在凈化豬 場(chǎng)污水厭氧出水中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的快速發(fā)展，人類(lèi)對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)帶來(lái)的影響日益加劇，尤其近年 來(lái)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)集約化和規(guī)?；焖侔l(fā)展，規(guī)?；i場(chǎng)排放的糞尿污水也在劇增，糞尿污水 經(jīng)厭氧發(fā)酵處理，大部分有機(jī)質(zhì)得到去除，但N、P和COD等指標(biāo)仍很高。過(guò)量氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)流入水體，使得藻類(lèi)和其它浮游動(dòng)物迅速繁殖，水體透明度和溶解氧發(fā)生變化，水質(zhì)不斷 惡化，從而使水體生態(tài)系統(tǒng)和水功能受到阻礙和破壞。富營(yíng)養(yǎng)化水體的治理成為急需解決 的問(wèn)題。目前富營(yíng)養(yǎng)化水體治理和修復(fù)有物理、化學(xué)和生物等手段。物理方法工程量大、耗 能高且不徹底。投加化學(xué)藥劑短期效果明顯，但容易發(fā)生水質(zhì)反彈并造成水體二次污染，會(huì) 對(duì)水體的整體生態(tài)環(huán)境造成一定的不良影響。微生物富營(yíng)養(yǎng)化水體修復(fù)技術(shù)通過(guò)微生物之 間的食物鏈關(guān)系建立相應(yīng)的微生態(tài)系統(tǒng)，加快水中的能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)，強(qiáng)化微生物對(duì) 水體中過(guò)量氮、磷的吸附、轉(zhuǎn)化和降解圈，以此修復(fù)水體自?xún)艄δ?，減輕水體富營(yíng)養(yǎng)化程度。 由于微生物修復(fù)技術(shù)的投入低于傳統(tǒng)環(huán)境工程技術(shù)，且具有環(huán)境友好，無(wú)二次污染，處理效 率高，處理時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，因而成為關(guān)注的焦點(diǎn)。不同種類(lèi)微生物對(duì)各類(lèi)物質(zhì)的 代謝和利用能力相差較大，所以從環(huán)境中尋找環(huán)境友好且治污能力強(qiáng)的微生物資源具有重 要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003] 谷氨酸棒桿菌（或稱(chēng)谷氨酸棒狀桿菌）（Corynebacterium glutamicum)是一種兼 性好氧、生長(zhǎng)快速的革蘭氏陽(yáng)性菌，自1957年被分離出來(lái)，便逐漸被廣泛應(yīng)用于氨基酸、核 苷酸、生物塑料及其它專(zhuān)用化學(xué)品的工業(yè)化生產(chǎn)，但未見(jiàn)其在污水處理方面的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)FX69在凈化 豬場(chǎng)污水厭氧出水中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)采集自福州某富營(yíng)養(yǎng)化河道底泥的樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)，利用溴百里 酚藍(lán)(BTB)選擇性培養(yǎng)基和硝酸鹽還原試驗(yàn)初篩，模擬人工合成污水凈化試驗(yàn)復(fù)篩，獲得一 株具有較好脫氮功效的菌株FX69。對(duì)擴(kuò)增到的菌株FX69的16S rRNA基因序列進(jìn)行測(cè)序，其 序列如SEQ ID NO.1所示，將該序列進(jìn)行比對(duì)分析確定該菌株FX69為谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum)，由此將其命名為谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)FX69。谷氨酸棒桿菌FX69對(duì)人工合成污水和養(yǎng)豬污水厭氧出水具有較好的除 氮和降解COD的效果。本發(fā)明的谷氨酸棒桿菌FX69具有易培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快和環(huán)境適應(yīng)能力 強(qiáng)的特點(diǎn)。本發(fā)明提供了谷氨酸棒桿菌的新的應(yīng)用方向，也為污水處理提供了新的菌種資 源。
[0006] 本發(fā)明的谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)FX69于2015年3月18日保 藏于福建省微生物研究所的保藏中心，其保藏號(hào)為:F頂-201503180069。該保藏中心的菌株 是對(duì)外銷(xiāo)售的，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自2015年03月18日之后從該保藏中心購(gòu)買(mǎi)到該菌 株。
[0007] 本發(fā)明的谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)FX69還于2015年5月19日 公開(kāi)于非專(zhuān)利文南犬中（網(wǎng)頁(yè)），其網(wǎng)址為：http://www.fjim.org.cn/kytd/ktz/ getNews.」8。?116￥81(1 = 220，該菌種
【申請(qǐng)人】本人也持有，并保證自申請(qǐng)日起20年內(nèi)向公眾提
【具體實(shí)施方式】
[0008] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0009] 實(shí)施例1:目標(biāo)菌種的分離、純化和鑒定
[0010] 1樣品米集
[0011] 細(xì)菌樣品采自福州某富營(yíng)養(yǎng)化河道底泥。使用自制底泥采樣器采取底泥放入無(wú)菌 袋，置于4°C冰箱保存。
[0012] 2菌種分離
[0013] 2.1 初篩
[0014]無(wú)菌條件下稱(chēng)取5g底泥，置于帶有磁力攪拌子的無(wú)菌帶塞錐形瓶中，加入質(zhì)量分 數(shù)0.8%無(wú)菌生理鹽水100mL，在磁力攪拌器上振蕩30min，打散底泥中的菌膠團(tuán)，制成菌懸 液。用已滅菌的移液管每次吸取5mL菌懸液，分別加入裝有IOOmL反硝化富集培養(yǎng)基的250mL 三角瓶中，于28°C、120r/min的搖床上振蕩富集培養(yǎng)5d得到培養(yǎng)液。從上述的每個(gè)三角瓶中 分別吸取〇. 5mL培養(yǎng)液，分別加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%無(wú)菌生理鹽水中，得到HT1，HT2，HT3， 1(T 4, UT5和UT6梯度的稀釋溶液，吸取不同濃度的稀釋溶液各0.2mL涂布于溴百里酚藍(lán) (BTB)選擇性培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)1~2d。從這幾個(gè)稀釋梯度中挑選出1個(gè)最合適的梯度，要求 平板上菌落分布清晰均勻(菌落數(shù)在20-200個(gè)），從平板上挑取藍(lán)色或周?chē)兴{(lán)色暈圈的單 菌落。單菌落經(jīng)重復(fù)3次涂布、挑種，至菌落特征一致，無(wú)異常菌落出現(xiàn)者，認(rèn)為是完全純化。 將純化的單菌落接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上挑取少量菌 體，接種至裝有IOmL無(wú)菌反硝化富集培養(yǎng)基的試管中，以膠塞密閉瓶口，置培養(yǎng)箱中28°C恒 溫培養(yǎng)。每隔一定時(shí)間取樣ImL，分別加入2只干凈試管中，分別滴加二苯胺試劑和格林斯試 劑0.2mL，根據(jù)溶液的顏色變化了解培養(yǎng)基中硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的含量變化。依據(jù)硝酸 鹽氮和亞硝酸鹽氮的含量變化定性判斷反硝化速率，選取數(shù)株反硝化速率較高的菌株，由 此得到初篩的反硝化菌。
[0015] 所述的反硝化富集培養(yǎng)基每升含有:KN03 2.0g、MgS〇4.7H20 0.2g、K2HP〇4 0.5g、 酒石酸鉀鈉 20g和CaCl2 0.02g，余量為H20,pH 7.2。配制方法是將所有成分混合均勻后，調(diào) pH，然后滅菌備用。
[0016] 所述的溴百里酚藍(lán)（BTB)選擇性培養(yǎng)基每升含有：瓊脂20g、KN03 lg、KH2P〇4 lg、 卩6<：12.6!12〇0.58、〇3(：12.7!12〇0.28、]\%5〇4.7!12〇18、琥珀酸鈉8.58和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的^^ 乙醇溶液mL，余量為蒸餾水，用Imol/LNaOH調(diào)節(jié)pH7.0-7.3。配制方法是將所有成分混合均 勻后，調(diào)pH，然后滅菌備用。
[0017] 所述的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基每升含有:蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉5g和瓊脂15 ~20g，余量為蒸餾水。配制方法是將所有成分混合均勻后，121°C高壓滅菌15min。
[0018] 2.2 復(fù)篩
[0019] 分別將初篩獲得的反硝化菌接入合成污水中，以不添加菌劑的合成污水為空白對(duì) 照組，均設(shè)立三個(gè)平行組，28°C、150rpm震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)96h后取樣測(cè)定合成污水中NH/-N、 NOiT-N和COD的含量。選取其中一株對(duì)合成污水處理效果最佳的菌株，將該菌株命名為FX69。 FX69菌株處理合成污水96h，其N(xiāo)H4+-N去除率為52%，N〇2--N去除率為92%，C0D降解率為 80% 〇
[0020] 合成污水的組成成份，每升含有：葡萄糖36〇11^、酵母膏80.〇11^、1(!12?〇4 14.〇11^、 MgSO4· 7H20 24.Omg^NH4Cl 60.Omg^CaCl2 18.Omg^NaHCO3 24.Omg^MnSO4· 7H20 6.Omg^ FeCl3 0 · 3mg、NaN02 30 ·Omg和KN0330 · Omg，余量為蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7 · 0。配制方法是將所有 成分混合均勻后，調(diào)pH，然后分裝于500mL三角瓶中，121°C高壓滅菌15min。
[0021] 3菌種的鑒定
[0022]取FX69在發(fā)酵培養(yǎng)基（與實(shí)施例2中的相同）培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液IOmU 8000r/min離心15min，傾去上清液，收集菌體。采用CTAB/NaCl法提取菌體基因組DNA。步驟 如下：菌體中加入500mL TE溶液(pH 8.0)，懸浮，加入60yL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫酸鈉 (SDS)和6yL 10mg/ml蛋白酶K，混勻，60°C水浴lh，加 IOOmL 5mol/L NaCl和80mL CTAB/NaCl 溶液(含有50g/L CTAB和0.5mol/L NaCl)，65°C水浴lOmin，以等體積的氯仿/異戊醇(體積 比24:1)和酚/氯仿/異戊醇(體積比25:24:1)各抽提1次，異丙醇沉淀DNA，得到FX69的基因 組DNA，將其溶于50yLTE溶液(pH 8.0)中，-20 °C保存?zhèn)溆?。利? %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽 提的基因組DNA完整性。采用16S rRNA基因的通用引物27F
[0023] (5,46厶61'1^6厶了〇^66(：1^厶6-3，）和14921?(5，-661^厶0：1^61^厶〇6厶(：1'1'-3，）對(duì)提取 的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序 擴(kuò)增到的16S rRNA基因的序列如SEQ ID NO. 1所示，將該序列用BLAST軟件與NCBI的 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)分析。FX69與Corynebacterium glutamicum strain ALK062和Corynebacterium glutamicum strain ALK063的16S rRNA 基因序列的相似性均為99%，因而確定菌株FX69屬于谷氨酸棒桿菌，并將該菌株命名為谷 氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)FX69。谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamiCum)FX69于2015年3月18日保藏于福建省微生物研究所的保藏中心，其保藏號(hào)為： F頂-201503180069。
[0024]實(shí)施例2:谷氨酸棒桿菌FX69的制備 [0025] (1)斜面培養(yǎng)：
[0026]將谷氨酸棒桿菌FX69接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2~3d。營(yíng) 養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基配方同實(shí)施例1。
[0027] (2)發(fā)酵培養(yǎng)：
[0028]用接種環(huán)挑起少量營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上的谷氨酸棒桿菌FX69菌體接入發(fā)酵培 養(yǎng)基中，于28 °C、150r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)2~3d。由此發(fā)酵培養(yǎng)得到谷氨酸棒桿菌FX69 菌液。
[0029]發(fā)酵培養(yǎng)基配方，每升含有:胰蛋白胨10.Og、酵母粉5.Og和氯化鈉10.Og，余量為 水，pH不調(diào)。配制方法是將上述成份混合均勻后，滅菌備用。
[0030]實(shí)施例3:谷氨酸棒桿菌FX69對(duì)豬場(chǎng)污水厭氧出水的凈化試驗(yàn) [0031 ] 取實(shí)施例2制備的谷氨酸棒桿菌FX69菌液5~10mL，8000r/min離心5min，棄上清液 得到菌體。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%生理鹽水洗去菌體上的培養(yǎng)基，用無(wú)菌水溶解，離心，重復(fù)3次 得濕菌體，菌體接入分裝于500mL三角瓶中的豬場(chǎng)污水厭氧出水處理液(具體組成為：20mL 豬場(chǎng)污水厭氧出水+180mL自來(lái)水，按0.4g/L的濃度添加葡萄糖）；以不添加谷氨酸棒桿菌 FX69的豬場(chǎng)污水厭氧出水處理液為空白對(duì)照組，均設(shè)立三個(gè)平行組，28°C、150rpm震蕩培 養(yǎng)。培養(yǎng)2d后取樣測(cè)定水體中NH4+-N、NO 2--N和COD的含量。
[0032]結(jié)果表明，與不添加谷氨酸棒桿菌FX69組相比，添加谷氨酸棒桿菌FX69組的豬場(chǎng) 污水厭氧出水處理液中NH/-N去除率為87%，N〇2_-N去除率為92%，C0D降解率為71%。谷氨 酸棒桿菌FX69對(duì)豬場(chǎng)污水厭氧出水的凈化效果顯著。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)FX69在凈化豬場(chǎng)污水厭氧出水中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK105861361SQ201610228509
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月13日
【發(fā)明人】陳宏 , 賈緯, 聶毅磊, 羅立津, 陳星偉
【申請(qǐng)人】福建省微生物研究所