一種紫花苜蓿原生質體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種紫花苜蓿原生質體的制備方法，涉及生物技術領域，包括選擇生長狀況良好未開花的紫花苜蓿葉片作為制備原生質體的材料；將制備原生質體的材料進行預處理，得到具有多個葉條的葉片；將所述具有多個葉條的葉片進行酶解處理，得到原生質體酶解液；對所述原生質體酶解液進行純化處理，得到紫花苜蓿原生質體。本發(fā)明制備原生質體成本低、活力高。
【專利說明】
一種紫花苜蓿原生質體的制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種紫花苜蓿原生質體的制備方法。
【背景技術】
[0002] 原生質體指去掉細胞壁的裸露活細胞，是進行各種細胞及遺傳操作的理想材料， 已廣泛地應用于體細胞雜交、遺傳轉化、種質資源保存、基因瞬間表達、蛋白質互作、信號轉 導等方面。因此原生質體技術可為紫花苜蓿的種質資源創(chuàng)新和遺傳改良提供新的技術途 徑，而實現上述應用的前提是制備高產量和高活力的紫花苜蓿原生質體。
[0003] 目前，紫花苜蓿原生質體的制備一般采用發(fā)芽不久的紫花苜蓿幼株的下胚軸，而 且其制備過程需要8h以上，例如王娟等發(fā)表在《草地學報》第18卷第2期的"苜蓿愈傷組織原 生質體游離與培養(yǎng)"中，采用了下胚軸作為材料;陶茸等發(fā)表在《中國草地學報》第22卷第1 期的"隴東野生紫花苜蓿愈傷組織原生質體游離條件的篩選"中，采用了紫花苜蓿子葉作為 原生質體材料，且其酶解時間為I Oh。
[0004] 可見，現有技術對紫花苜蓿原生質體的材料來源要求較高，且酶解時間過長。

【發(fā)明內容】

[0005] 為了解決現有技術中存在的材料來源要求較高，酶解效率低的技術問題，本發(fā)明 提供一種紫花苜蓿原生質體的制備方法，該方法可以高效的提取紫花苜蓿中的原生質體， 對材料要求低。
[0006] 為了實現本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種紫花苜蓿原生質體的制備方法，包括：
[0007] 選擇生長狀況良好未開花的紫花苜蓿葉片作為制備原生質體的材料；
[0008] 將制備原生質體的材料進行預處理，切割成具有多個葉條的葉片；
[0009] 將所述具有多個葉條的葉片進行酶解處理，得到原生質體酶解液；
[0010] 對所述原生質體酶解液進行純化處理，得到紫花苜蓿原生質體。
[0011] 特別是，所述將制備原生質體的材料進行預處理包括：
[0012] 剪去紫花苜蓿葉片的邊緣部分，以除去葉片上較小的細胞；
[0013] 從葉梢處沿著葉中脈平行的方向對所述剪去邊緣部分的葉片進行局部剪切，得到 具有多個葉條的葉片。
[0014]尤其是，將所述具有多個葉條的葉片進行酶解處理包括：
[0015] 將所述具有多個葉條的葉片平鋪在已配制好的酶解液中，真空抽濾后，使酶解液 充分進入葉片內；
[0016] 將含有葉片的酶解液在黑暗條件下震蕩處理，使原生質體釋放，得到原生質體粗 酶解液。
[0017] 其中，所述純化處理包括：
[0018] 向所述原生質體粗酶解液中加入W5溶液進行懸浮，再使用尼龍膜將其進行過濾， 以除去沒有降解的細胞和組織，得到濾液；
[0019] 離心處理所述濾液，去除上清液；
[0020] 重復上述步驟1-2次，得到原生質體。
[0021] 特別是，所述酶解液中包括:纖維素酶、果膠酶、離析酶和甘露醇，以及KCUMES溶 液、CaCl2 和 BSA。
[0022] 尤其是，所述酶解液中各成分的最終濃度為： 纖維素酶 1.6-2.4% 果膠酶 0.4-0.6% 離析酶 Q.24-Q.36%
[0023] KCI 20m M MES 20mM CaCh IOmM BSA 0.1%-0.15%.
[0024] 優(yōu)選地，所述酶解液中各成分的最終濃度為： 纖維素酶 2% 果膠酶 0,5%
[0025] 離析酶 0.3% KCI 20mM MES 20m M CaCh IOmM
[0026] BSA 0·1%-0_!5%。
[0027]尤其是，所述酶解液使用終濃度為0.3-0.6Μ的甘露醇進行滲透壓的調節(jié)。
[0028]優(yōu)選地，所述酶解液使用終濃度為0.4M的甘露醇進行滲透壓的調節(jié)。
[0029] 特別是，所述MES的pH為5.7。
[0030] 特別是，所述酶解液的配制包括如下步驟：
[0031] 預先配制酶解液，加入纖維素酶、果膠酶、離析酶，再加入KCl、MES溶液，最后使用 濃度為〇. 3-0.6M的甘露醇調節(jié)其滲透壓，得到混合物；
[0032] 將混合物在55°C下進行水浴加熱IOmin，自然冷卻至室溫后，加入CaCldPBSAJg 合均勻，得到酶解液，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0033]尤其是，滲透壓的調節(jié)采用終濃度為0.4M的甘露醇。
[0034] 其中，所述酶解液中各成分的最終濃度為：纖維素酶1.6-2.4 %、果膠酶0.4-0.6%、離析酶0.24-0.36%、KC1 20mM、MES 20mM、CaCh 10mM、BSA 0·1%-0· 15%。
[0035] 優(yōu)選地，所述所述酶解液中各成分的最終濃度為:纖維素酶2%、果膠酶0.5%、離 析酶0.3%、1((：120111]\1、]\^3 20111]\^&(：12 101111、85厶0.1%-0.15%。
[0036] 其中，所述W5溶液為終濃度包括：154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mM MES。
[0037] 其中，所述MES的pH為5.7。
[0038] 特別是，所述具有多個葉條的葉片的葉條寬度為0.5-lmm。
[0039] 其中，所述真空抽濾的處理時長為20min。
[0040] 特別是，所述在黑暗條件下震蕩處理溫度為25°C，處理時間為4-5h，轉速為40rpm。 [0041 ] 尤其是，所述離心處理的離心力為100g，處理時間為3min，
[0042] 特別是，所述離心處理過程中，加速及減速時的加速度全部為lm/S2。
[0043] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0044] 1、本發(fā)明采用的是未開花前的紫花苜蓿葉片作為制備原生質體的材料來源，不再 僅限于現有技術中使用的發(fā)芽不久的紫花苜蓿幼株的下胚軸，可見，使用本發(fā)明的方法制 備的原生質體材料來源廣泛，降低了原料成本。
[0045] 2、由于本發(fā)明方法對制備原生質體的材處理時先去除葉邊緣部分，后進行了局部 剪切，因此酶解時不會出現葉條粘連的情況，提高了原生質體提取率。
[0046] 3、由于本發(fā)明使用了包含2%的纖維素酶、0.5%的果膠酶、0.3%的離析酶制備的 酶解液、滲透壓的調節(jié)選擇0.4M濃度的甘露醇、且黑暗條件下在轉速為40rpm的搖床中進行 酶解等技術特征，使得紫花苜蓿的酶解時間由原來的8h縮短至4-5h，時間成本降低了一倍 左右，而且由于配制酶解液的成分少，配制簡單，進一步的減低了試劑成本，并且利用本發(fā) 明制得的原生質體完整率高，質量好，如圖2所示。
【附圖說明】
[0047]圖1是實施例1材料預處理之后的葉片形態(tài)圖；
[0048] 圖2是實施例2觀察到的原生質體狀態(tài)圖。
【具體實施方式】
[0049] 下面結合具體實例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明所講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0050] 實施例1
[00511 1、酶解液的配制
[0052]進行原生質體提取前，先行配制酶解液母液，終濃度包括2%纖維素酶、0.5%果膠 酶、0.3%離析酶及0.4M甘露醇、20mM KCl、20mM MES，其中，MES的pH為5.7，在55°C條件下水 浴加熱IOmin，然后冷卻至室溫，加入終濃度為IOmM CaCl2和0.1 %-0.15%BSA，4°C下保存 備用。
[0053] 2、材料的準備
[0054]選擇生長狀況良好、未開花的紫花苜蓿，剪取其葉片作為制備紫花苜蓿原生質體 的材料。
[0055] 3、材料的預處理
[0056]將紫花苜蓿葉片的邊緣部分剪去，以除去形態(tài)較小、生長狀態(tài)不佳的細胞，然后從 葉梢處沿著葉中脈平行的方向進行不完全切割，使切割后得到的葉條為一個整體，切割寬 度為0.5-1_，切割后的形態(tài)如圖1所示。
[0057] 經多次試驗論證發(fā)現，采用除去葉邊緣及局部切割的方式對葉片進行預處理，解 決現有技術中采用對葉片全部切割或對葉片切碎處理后進行酶解處理時發(fā)生的粘連現象， 較大幅度的提高了原生質體的提取率。
[0058] 4、材料的酶解處理
[0059] 4.1、按照I Oml酶解液處理10-15片苜蓿葉片的比例，根據葉片數量將切割后的葉 片平鋪在相應體積的酶解液中，并利用真空抽濾處理20min，使酶解液進入細胞中，加速葉 片酶解，使細胞發(fā)生質壁分離，得到初原生質體酶解液。
[0060] 4.2、將初原生質體酶解液放入搖床中，設置其溫度為25°C，在轉速為40rpm的條件 下，處理4-5h，為了避免光照刺激原生質體，本處理過程在黑暗條件下進行，原生質體在轉 速為40rpm的搖床中進一步釋放，得到原生質體酶解液。
[0061] 經多次試驗論證發(fā)現，采用終濃度包括2%纖維素酶、0.5%果膠酶、0.3%離析酶； 0.4M濃度的甘露醇進行滲透壓調節(jié)的酶解液處理具有多個葉條的葉片，才使得紫花苜蓿原 生質體在一個較佳的穩(wěn)態(tài)環(huán)境中發(fā)生質壁分離，不但提高了原生質體的提取效率，而且保 證了原生質體的完整度，因而本發(fā)明方法提取的紫花苜蓿原生質體活力高。
[0062]經多次試驗論證，采用最終濃度范圍為纖維素酶1.6-2.4%、果膠酶0.4-0.6%、離 析酶0.24-0.36%、KC1 20mM、MES 20mM、CaCl2 10mM、BSA 0·1%-0· 15% 內任意比例配制的 酶解液同樣可以達到相同的效果，
[0063] 例如，酶解液最終成分配比為纖維素酶1.6%、果膠酶0.6%、離析酶0.36%、KC1 20mM、MES 20mM、CaCl2 10mM、BSA 0.1%-0.15%;又例如，酶解液最終成分配比為纖維素酶 2.4%、果膠酶0.4%、離析酶0.24%、KC1 20mM、MES 20mM、CaCl2 10mM、BSA 0·1%-0·15%; 又例如，酶解液最終成分配比為纖維素酶1.6%、果膠酶0.4%、離析酶0.36%、KCl 20mM、 MES 20mM、CaCl2 10mM、BSA 0.1%-0.15%;又例如，酶解液最終成分配比為纖維素酶 2.4%、果膠酶0.6%、離析酶0.24%、KC1 20mM、MES 20mM、CaCl2 10mM、BSA 0·1%-0·15% 等。
[0064] 5、原生質體的純化
[0065] 向原生質體酶解液中加入與原生質體酶解液等體積的W5溶液進行混合后，再使用 尼龍膜將其過濾至干凈的培養(yǎng)皿中，除去沒有降解的細胞和組織，得到濾液;使用移液器將 濾液轉移到圓底離心管中，設置離心力為l〇〇g，對裝有原生質體酶解液的離心管進行離心， 時間為2min，需要特別說明是，離心處理的過程中，離心加速時和離心減速時的加速度均為 WS20
[0066] 重復上述步驟1~2次，得到純化后的原生質體。
[0067] 需要說明的是，每次離心后，都是用W5溶液懸浮，再進行下一次離心處理。
[0068] 需要說明的是，W5溶液為終濃度包括：154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mM MES，其中，MES 的 pH 為 5.7。
[0069] 實施例2原生質體產活力的測定
[0070] 向得到的原生質體中加入W5溶液對原生質體進行重懸，使原生質體的濃度為1~2 X IO5，冰浴30min(也可以在冰上放置24h)，顯微鏡觀察原生質體狀態(tài)，觀察圖如圖2所示。
[0071] 從圖2中可以看出，原生質體呈完整球形狀態(tài)，破碎率較少，可見，使用本發(fā)明方法 不但可以在短時間內獲得紫花苜蓿原生質體，而且其活力較高。
[0072]盡管上述對本發(fā)明做了詳細說明，但不限于此，本技術領域的技術人員可以根據 本發(fā)明的原理進行修改，因此，凡按照本發(fā)明的原理進行的各種修改都應當理解為落入本 發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種紫花苜蓿原生質體的制備方法，其特征在于，包括： 選擇生長狀況良好未開花的紫花苜蓿葉片作為制備原生質體的材料； 將制備原生質體的材料進行預處理，得到具有多個葉條的葉片； 將所述具有多個葉條的葉片進行酶解處理，得到原生質體酶解液； 對所述原生質體酶解液進行純化處理，得到紫花苜蓿原生質體。2. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述將制備原生質體的材料進行預處理 包括： 剪去紫花苜蓿葉片的邊緣部分，以除去葉片上較小的細胞； 從葉梢處沿著葉中脈平行的方向對所述剪去邊緣部分的葉片進行局部剪切，得到具有 多個葉條的葉片。3. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述將具有多個葉條的葉片進行酶解處 理包括： 將所述具有多個葉條的葉片平鋪在已配制好的酶解液中，真空抽濾后，使酶解液充分 進入葉片中； 將含有葉片的酶解液在黑暗條件下震蕩處理，使原生質體釋放，得到原生質體酶解液。4. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述純化處理包括： 向所述原生質體酶解液中加入W5溶液進行懸浮，再使用尼龍膜將其進行過濾，以除去 沒有降解的細胞和組織，得到濾液； 離心處理所述濾液，去除上清液； 重復上述步驟1-2次，得到原生質體。5. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述酶解液的MES溶液pH為5.7。6. 如權利要求3-4所述的制備方法，其特征在于，所述酶解液的配制包括如下步驟： 預先配制酶解液，包括纖維素酶、果膠酶、離析酶，并加入KC1、MES溶液，使用0.3-0.6M 濃度的甘露醇調節(jié)其滲透壓； 將其水浴加熱，自然冷卻至室溫后，加入CaCl2和BSA，混合均勻，得到酶解液，4°C保存?zhèn)? 用。7. 如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述酶解液中各成分的最終濃度為： 纖維素酶 1.6-2,4% 果膠酶 0.4-0.6% 離析酶 0.24-0.36% KCi 20m Μ MES 20mM CaCb 2〇mM BSA 0·1%-0_15%。8. 如權利要求1-3所述的制備方法，其特征在于，所述具有多個葉條的葉片的葉條寬度 為0·5_lmm〇9. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述在黑暗條件下震蕩處理溫度為25 °C，處理時間為4_5h，轉速為40rpm。10.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述離心處理的過程中，加速時和減速 時的加速度全部為lm/S2。
【文檔編號】C12N5/04GK105861414SQ201610424213
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】王贊, 龔攀, 賈聰俊, 王學敏, 高洪文
【申請人】中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所