一種誘導(dǎo)內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的培養(yǎng)基及其方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種誘導(dǎo)內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的培養(yǎng)基及其方法。該培養(yǎng)基包括黃芪多糖、IGF?1、EGF和無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基。本發(fā)明培養(yǎng)基可顯著提高內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的能力；利用黃芪多糖培養(yǎng)內(nèi)耳干細胞，在促進細胞增殖的同時，還可維持內(nèi)耳干細胞的表型和特性；可減少動物血清應(yīng)用的風(fēng)險和免疫原性。
【專利說明】
一種誘導(dǎo)內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的培養(yǎng)基及其方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種誘導(dǎo)內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的培 養(yǎng)基及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 聽力障礙是指聽覺系統(tǒng)中的傳音、感音以及對聲音的綜合分析的各級神經(jīng)中樞發(fā) 生器質(zhì)性或功能性異常，而導(dǎo)致聽力出現(xiàn)不同程度的減退，習(xí)慣稱為耳聾。只有聽力嚴(yán)重減 退才稱之為聾，其表現(xiàn)為患者雙耳均不能聽到任何言語。聽力障礙是嚴(yán)重影響人類生活的 疾病之一。神經(jīng)性耳聾是最常見的耳聾之一，占耳聾患者總數(shù)的90%，患神經(jīng)性耳聾的患者 超過600萬人。目前只依靠人工耳蝸植入作為治療方法。但是，這些電子裝置并不能恢復(fù)所 有聽力。
[0003] 毛細胞為感受聲波刺激的感覺上皮細胞，其作用是把聲音轉(zhuǎn)化為送給大腦的電子 刺激。在聲波經(jīng)過的時候，這些看起來從細胞表面長出的小毛會動起來，這種運動會把電子 信號經(jīng)由神經(jīng)傳給大腦。內(nèi)耳毛細胞為分化終末細胞，其損傷不可逆，且不具有再生修復(fù)能 力。
[0004] 近年來，英國科學(xué)家在實驗室里用干細胞培育出了內(nèi)耳毛細胞，為耳聾患者恢復(fù) 聽力帶來了希望?？茖W(xué)家們希望使用這種細胞為耳聾患者進行細胞移植，取代神經(jīng)性耳聾 患者已受損的毛細胞和神經(jīng)細胞。目前還沒有恢復(fù)永久性聽力損失的療法，因此，這種方法 對數(shù)百萬失聰者來說有著潛在的重要性。還有研究利用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基加生長因子如表 皮生長因子或堿性纖維細胞生長因子從大鼠內(nèi)耳區(qū)域分離出的神經(jīng)細胞球，可分化為耳蝸 毛細胞。這些神經(jīng)細胞球即為內(nèi)耳干細胞，內(nèi)耳干細胞在體外和體內(nèi)具有分化為毛細胞樣 細胞的能力，擁有高度的增生潛能和自我更新能力。體外分離、擴增培養(yǎng)內(nèi)耳干細胞，為耳 蝸內(nèi)移植治療提供種子細胞，對利用多能干細胞移植治療損傷疾病具有重要應(yīng)用。
[0005] 將內(nèi)耳干細胞應(yīng)用于組織工程需要大量的種子細胞，但內(nèi)耳來源的間充質(zhì)干細胞 較骨髓來源的少，存在培養(yǎng)成功率低、體內(nèi)增殖率低等缺點。現(xiàn)通常采用添加了生長所需因 子的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基或胎牛血清作為培養(yǎng)用血清培養(yǎng)內(nèi)耳干細胞。無血清培養(yǎng)體系雖能 保證細胞批次的穩(wěn)定性，但無法解決異種蛋白內(nèi)在化問題;胎牛血清則存在異體血清排斥 反應(yīng)，生物危險性高，難以防止人與其他物種間病毒的感染和傳播，且現(xiàn)有的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系 中內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的能力較弱。因此，建立一套不含有動物血清，可利用于臨床 的、安全和效果明確的內(nèi)耳干細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，具有重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的培養(yǎng)基及其方法。 該培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法可顯著提高內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的能力。
[0007] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的培養(yǎng)基，包括黃芪多糖、IGF- I、EGF和無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0009]黃芪多糖是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根經(jīng)提取、濃縮、純化而成的水 溶性雜多糖，淡黃色，粉末細膩，均勻無雜質(zhì)，具引濕性。黃芪多糖由己糖醛酸、葡萄糖、果 糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等組成，可作為免疫促進劑或調(diào)節(jié)劑，同時 具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗應(yīng)激、抗氧化等作用。
[0010] IGF-I的全稱叫做類胰島素一號增長因子，IGF-I也被稱作"促生長因子"（即 somatomedin C)，是一種在分子結(jié)構(gòu)上與胰島素類似的多肽蛋白物質(zhì)。IGF-I在嬰兒的生長 和在成人體內(nèi)持續(xù)進行合成代謝作用上具有重要意義。
[0011] EGF，中文名為表皮細胞生長因子，又名寡肽-1，是人體內(nèi)的一種活性物質(zhì)，由53個 氨基組成的活性多肽，藉由刺激表皮細胞生長因子受體之酪氨酸磷酸化，達到修補增生肌 膚表層細胞。其最大特點是能夠促進細胞的增殖分化，從而以新生的細胞代替衰老和死亡 的細胞。EGF還能止血，并具有加速皮膚和粘膜創(chuàng)傷愈合，消炎鎮(zhèn)痛，防止?jié)兊墓π?。EGF的 穩(wěn)定性能極好，在常溫下不易失散流動，能與人體內(nèi)各種酶形成良好的協(xié)調(diào)效應(yīng)。最初的 EGF主要被運用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，主要用于促進受損表皮的修復(fù)與再生，如治療燒傷、燙傷等。 [0012]本發(fā)明將黃芪多糖、IGF-UEGF與無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基組合而成的培養(yǎng)體系可顯著 提高內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的能力。
[0013] 作為優(yōu)選，培養(yǎng)基中各組分的用量為：
[0014] 黃芪多糖：ι〇〇 ~loooyg/mL;
[0015] IGF-l:10~100ng/mL;
[0016] EGF:10~100ng/mL;
[0017] 無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基:補足。
[0018] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，培養(yǎng)基中各組分的用量為：
[0019] 黃芪多糖：HKK^g/mL;
[0020] IGF-I：50ng/mL；
[0021] EGF：20ng/mL；
[0022] 無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基:補足。
[0023] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中，培養(yǎng)基中各組分的用量為：
[0024]黃芪多糖：5〇〇yg/mL;
[0025] IGF-I：50ng/mL；
[0026] EGF：20ng/mL；
[0027] 無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基:補足。
[0028] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中，培養(yǎng)基中各組分的用量為：
[0029]黃芪多糖 dOOyg/mL;
[0030] IGF-I：50ng/mL；
[0031] EGF：20ng/mL；
[0032] 無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基:補足。
[0033] 作為優(yōu)選，無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。
[0034] 本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的方法，采用本發(fā)明提供的培 養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)內(nèi)耳干細胞，獲得毛細胞。
[0035] 作為優(yōu)選，誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為15~20天。
[0036] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為37°C、5%C02。
[0037] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中每3天換一次液。
[0038] 本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的培養(yǎng)基及其方法。該培養(yǎng)基包 括黃芪多糖、IGF-UEGF和無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢之一：
[0039] 1、該培養(yǎng)基可顯著提高內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的能力；
[0040] 2、本發(fā)明利用黃芪多糖培養(yǎng)內(nèi)耳干細胞，在促進細胞增殖的同時，還可維持內(nèi)耳 干細胞的表型和特性；
[0041 ] 3、本發(fā)明培養(yǎng)基可減少動物血清應(yīng)用的風(fēng)險和免疫原性。
【附圖說明】
[0042]圖1示PO代細胞形態(tài)，其中圖1-1為放大40倍的細胞圖片，圖1-2為放大200倍的細 胞圖片；
[0043] 圖2示內(nèi)耳干細胞的免疫熒光染色圖；
[0044] 圖3示黃芪多糖對內(nèi)耳干細胞的增殖作用。
【具體實施方式】
[0045] 本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的培養(yǎng)基及其方法，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改 動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng) 用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi) 對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0046] 本發(fā)明提供的誘導(dǎo)內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的培養(yǎng)基及其方法中所用生物材料 或試劑均可由市場購得。
[0047] 下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0048] 實施例1
[0049](一）內(nèi)耳干細胞原代分離
[0050] 取健康SD大鼠，于無菌操作條件下分離內(nèi)耳，取Corti器位置。Corti器用HBSS沖洗 后剪碎，加入胰蛋白酶于37 °C培養(yǎng)箱中消化30min。終止反應(yīng)，加入DNA酶，輕輕吹打成單細 胞懸液，加入普通培養(yǎng)基(DMEM+10 % FBS)，移入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)5~6天后細胞突起并交 織成網(wǎng)狀。細胞形態(tài)圖片見圖1。
[0051](二）內(nèi)耳干細胞的鑒定 [0052] l)Nestin蛋白表達的鑒定：
[0053]將分離的細胞種于培養(yǎng)板中，采用免疫熒光染色法檢測Nestin蛋白表達情況。由 圖2可知，細胞呈Nestin免疫熒光陽性，表明分離的細胞是具有自我更新能力的內(nèi)耳干細 胞。
[0054] 2)誘導(dǎo)分化鑒定：
[0055] 加入50ng/mL IGF-l、20ng/mL EGF至無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3天 換一次液，15天后收集細胞抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板，以上游引物： AACCTCCACAAATGTGCCCT、下游引物：AACATTGGTGTGCAATGACC(Myosin VI);上游引物： TATGCACTGCAAAGCAGACC、下游引物:GTTGGCCGATGCAGATAGAC(Pax-2)為引物進行免疫熒光定 量PCR，其中beta-actin作為內(nèi)參，檢測毛細胞標(biāo)志蛋白Myosin VI、Pax_2的基因表達量。最 后根據(jù)得到的C(t)值，以誘導(dǎo)前細胞中基因的表達量為參照，計算誘導(dǎo)后細胞中目的基因 相對于誘導(dǎo)前的表達量。結(jié)果見表1。
[0056] 表1 Myosin VI、Pax_2的基因表達量
[0058] 其中，和誘導(dǎo)前相比較，P〈0.05;#:和誘導(dǎo)前相比較，P〈0.01
[0059] 由表1中數(shù)據(jù)可知，誘導(dǎo)后Myosin VI、Pax_2的基因表達量高于誘導(dǎo)前，具有統(tǒng)計 學(xué)意義，因此說明分離培養(yǎng)的內(nèi)耳干細胞具有向毛細胞分化的潛能。
[0060] (三)黃芪多糖培養(yǎng)內(nèi)耳干細胞最佳濃度的摸索
[0061 ] 將黃芪多糖按不同終濃度(0、0.001、0.01、0.1、1、10、100mg/mL)加入無血清基礎(chǔ) 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，CCK8法測定0D450，檢測黃氏多糖對內(nèi)耳干細胞的增殖作用。結(jié)果見圖3。
[0062] 由圖3結(jié)果可知，當(dāng)濃度在0.1-lmg/mL范圍內(nèi)，黃氏多糖對內(nèi)耳干細胞具有較強的 增殖作用。
[0063] (四）含黃芪多糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞 [0064] 1)實驗分組為：
[0065] 對照組1:基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM+2%FBS);
[0066] 對照組2:基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入50ng/mL的IGF-I和20ng/mL的EGF;
[0067] 實驗組I :DMEM培養(yǎng)基中加入100yg/mL黃芪多糖；
[0068] 實驗組2:01^]?培養(yǎng)基中加入10(^8/11^黃芪多糖、50叫/11^的16?-1和20叫/11^的 EGF0
[0069] 2)將內(nèi)耳干細胞接種于培養(yǎng)板中，分別加入上述4組培養(yǎng)基，每3天換一次液，15天 后收集細胞抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以上游引物:AACCTCCACAAAT GTGCCCT、下游引物： AACATTGG TGTGCAATGACC(Myosin VI);上游引物：TATGCACTGCAAAGCAGACC、下游引物： GTTGGCCGATGCAGATAGAC(Pax-2)為引物進行免疫熒光定量PCR，其中beta-actin作為內(nèi)參基 因，檢測毛細胞標(biāo)志蛋白Myosin VI、Pax-2的基因表達量。最后根據(jù)根據(jù)得到的C(t)值，以 對照組中基因的表達量為參照，計算誘導(dǎo)后細胞中目的基因相對于誘導(dǎo)前的表達量?；?表達量如下表：
[0070] 表2 Myosin VI、Pax_2的基因表達量

[0072] 其中，和誘導(dǎo)前相比較，P〈0.05;#:和誘導(dǎo)前相比較，P〈0.01
[0073] 由上述試驗結(jié)果可以看出，和誘導(dǎo)前相比較，對照組IMy0s inVI和Pax-2的表達量 無明顯變化，而對照組2和實驗組中MyosinVI相對表達量和Pax-2相對表達量都有所升高， 但是實驗組2中基因的表達量比其他組都要高。由上述結(jié)果可知，黃芪多糖既可促進干細胞 的增殖，同時維持干細胞表型和分化潛能。
[0074] 實施例2:
[0075] 1)實驗分組為：
[0076] 對照組1:基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM+2%FBS);
[0077] 對照組2:基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入50ng/mL的IGF-I和20ng/mL的EGF;
[0078] 實驗組I :DMEM培養(yǎng)基中加入500yg/mL黃芪多糖；
[0079] 實驗組2:01^1培養(yǎng)基中加入50(^8/11^黃芪多糖、50叫/11^的16?-1和201^/11^的 EGF0
[0080] 2)將實施例1中獲得的內(nèi)耳干細胞接種于培養(yǎng)板中，分別加入上述4組培養(yǎng)基，每3 天換一次液，15天后收集細胞抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以上游引物：AACCTCCACAAAT GTGCCCT、下游引 物：AACATTGGTGTGCAATGACC(Myosin VI);上游引 物： TATGCACTGCAAAGCAGACC、下游引物:GTTGGCCGATGCAGATAGAC(Pax-2)為引物進行免疫熒光定 量PCR，其中beta-actin作為內(nèi)參基因，檢測毛細胞標(biāo)志蛋白Myosin VI、Pax_2的基因表達 量。最后根據(jù)根據(jù)得到的C(t)值，以對照組中基因的表達量為參照，計算誘導(dǎo)后細胞中目的 基因相對于誘導(dǎo)前的表達量?；虮磉_量如下表：
[0081] 表3 Myosin VI、Pax_2的基因表達量
[0083] 其中，*:和誘導(dǎo)前相比較，P〈0.05; #:和誘導(dǎo)前相比較，P〈0.01
[0084]由上述試驗結(jié)果可以看出，和誘導(dǎo)前相比較，對照組IMy 〇 s i nV I和Pax-2的表達量 無明顯變化，而對照組2和實驗組中MyosinVI相對表達量和Pax-2相對表達量都有所升高， 但是實驗組2中基因的表達量比其他組都要高；由實施例1、實施例2和實施例3中結(jié)果相比 較可以得出，當(dāng)黃芪多糖濃度為lOOOyg/mL時，誘導(dǎo)細胞分化為毛細胞的能力最強。由上述 結(jié)果可知，黃芪多糖既可促進干細胞的增殖，同時維持干細胞表型和分化潛能。
[0085] 實施例3:
[0086] 1)實驗分組為：
[0087] 對照組1:基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM+2%FBS);
[0088] 對照組2:基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入50ng/mL的IGF-I和20ng/mL的EGF;
[0089] 實驗組I :DMEM培養(yǎng)基中加入1000yg/mL黃芪多糖；
[0090] 實驗組2:01^]?培養(yǎng)基中加入100(^8/11^黃芪多糖、50叫/1^的16?-1和20叫/1^的 EGF0
[0091] 2)將實施例1中獲得的內(nèi)耳干細胞接種于培養(yǎng)板中，分別加入上述4組培養(yǎng)基，每3 天換一次液，15天后收集細胞抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以上游引物：AACCTCCACAAAT GTGCCCT、下游引 物：AACATTGGTGTGCAATGACC(Myosin VI);上游引 物： TATGCACTGCAAAGCAGACC、下游引物:GTTGGCCGATGCAGATAGAC(Pax-2)為引物進行免疫熒光定 量PCR，其中beta-actin作為內(nèi)參基因，檢測毛細胞標(biāo)志蛋白Myosin VI、Pax_2的基因表達 量。最后根據(jù)根據(jù)得到的C(t)值，以對照組中基因的表達量為參照，計算誘導(dǎo)后細胞中目的 基因相對于誘導(dǎo)前的表達量。
[0092] 基因表達量如下表：
[0093] 表4 Myosin VI、Pax_2的基因表達量
[0096] 其中，*:和誘導(dǎo)前相比較，P〈0.05;**:和誘導(dǎo)前相比較，P〈0.01 [0097]由上述試驗結(jié)果可以看出，和誘導(dǎo)前相比較，對照組IMy〇s inVI和Pax-2的表達量 無明顯變化，而對照組2和實驗組中MyosinVI相對表達量和Pax-2相對表達量都有所升高， 但是實驗組2中基因的表達量比其他組都要高。由上述結(jié)果可知，黃芪多糖既可促進干細胞 的增殖，同時維持干細胞表型和分化潛能。
[0098] 由實施例1、實施例2和實施例3中結(jié)果相比較可以得出，當(dāng)黃芪多糖濃度為ΙΟΟΟμ g/mL時，誘導(dǎo)細胞分化為毛細胞的能力最強。
[0099] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種誘導(dǎo)內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，包括黃芪多糖、IGF-1、 EGF和無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中各組分的用量為： 黃芪多糖：100~l〇〇〇yg/mL; IGF-1:10~100ng/mL; EGF:10~100ng/mL; 無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基:補足。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中各組分的用量為： 黃芪多糖:l〇〇〇yg/mL; IGF-l：50ng/mL； EGF：20ng/mL； 無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基:補足。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中各組分的用量為： 黃芪多糖:500yg/mL; IGF-l：50ng/mL； EGF：20ng/mL； 無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基:補足。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中各組分的用量為： 黃芪多糖：l〇〇yg/mL; IGF-l：50ng/mL； EGF：20ng/mL； 無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基:補足。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。7. -種誘導(dǎo)內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1至6中任一 項所述培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)內(nèi)耳干細胞，獲得毛細胞。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為15~20天。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為37 °C、5 % C02。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中每3天換一次液。
【文檔編號】C12N5/074GK105861420SQ201610338815
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】葛嘯虎, 陳海佳, 王飛, 王一飛, 馬巖巖
【申請人】廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司