一種豬icsi受精卵制備用操作皿的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明設(shè)計(jì)一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法，包括在Φ60mm的一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿上依次制作設(shè)定尺寸的操作液微滴、用于制動(dòng)的PVP微滴、注射針處理微滴、和精液培養(yǎng)微滴，所述精液培養(yǎng)微滴包括呈H型結(jié)構(gòu)的第一精液培養(yǎng)微滴、精液篩選橋和第二精液培養(yǎng)微滴，利用精液篩選橋的作用，選取大量高質(zhì)量精子。達(dá)到在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大量豬ICSI操作目的，減少豬ICSI操作過程選擇精子的時(shí)間，減少卵母細(xì)胞在空氣中暴露的時(shí)間，提高豬ICSI胚胎的存活率。
【專利說明】
一種豬I CS I受精卵制備用操作皿的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]單精子卵胞楽內(nèi)注射技術(shù)(IntracytoplasmicSperm Inject1n，簡(jiǎn)稱:ICSI，也有稱之為:胞質(zhì)內(nèi)單精子注射技術(shù))，對(duì)于轉(zhuǎn)基因豬和克隆豬的研究，以及用于研究異種器官移植的供體具有廣闊的應(yīng)用前景，豬作為生物技術(shù)研究和應(yīng)用中的一個(gè)理想動(dòng)物模型，日益受到眾多研究者的青睞。然而，僅僅依靠通過采集體內(nèi)胚胎是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因此，建立合理的體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)是非常必要的，而長期困擾豬體外胚胎生產(chǎn)體系改進(jìn)的一個(gè)主要因素是多精入卵的發(fā)生率較高。作為一種家畜胚胎工程新技術(shù)，采用ICSI可以解決豬的多精入卵問題。ICSI是在操作皿上，通過顯微操作系統(tǒng)，將選取的精子直接注射入體外培養(yǎng)成熟且已經(jīng)消化掉顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞內(nèi)完成。因此，操作皿的制作方法直接關(guān)系到豬ICSI受精卵制備的效率及ICSI胚胎的早期發(fā)育。
[0003]實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行豬ICSI的受精卵制備過程中，種豬精子人工采集并經(jīng)過初步稀釋后，在17°C環(huán)境中大約可保存一周時(shí)間，但精子在采集、運(yùn)輸、保存的過程中，受不可避免的種豬質(zhì)量、外界環(huán)境溫度微量變化、運(yùn)輸過程中的晃動(dòng)等多種不利因素影響，儲(chǔ)存的精子中，都會(huì)有一定比例的死亡精子，且隨著保存時(shí)間的延長，死亡精子所占比率會(huì)快速遞增，在此期間質(zhì)量好的精子還會(huì)主動(dòng)吸附到死亡精子而形成一團(tuán)，這就給ICSI操作帶來非常不利影響，為了解決這個(gè)問題，傳統(tǒng)方法是操作者ICSI之前，耗費(fèi)大量時(shí)間對(duì)精子進(jìn)行預(yù)處理;或者是ICSI過程中對(duì)精子進(jìn)行選擇。然而不管采用哪種方法，其處理過程均會(huì)耗費(fèi)大量時(shí)間和人力物力，比如對(duì)精子預(yù)處理時(shí)，需耗用大量液體進(jìn)行死精子的篩選處理，一旦處理不夠徹底，將造成死精子及精液中雜質(zhì)黏進(jìn)注射針管壁現(xiàn)象，從而大大降低了 ICSI成功率，增加了受精卵制備成本。
[0004]常規(guī)ICSI操作皿包括:ICSI皿、PVP圓形微滴、PVP條形微滴和緩沖培養(yǎng)基微滴，進(jìn)行ICSI操作的過程是吸取一定量含有精子的培養(yǎng)基加到PVP條形微滴中制動(dòng)后即完成ICSI。現(xiàn)代技術(shù)中，在制備轉(zhuǎn)基因豬時(shí)，由于需要注射大量的豬ICSI胚胎，若采用傳統(tǒng)ICSI方法，勢(shì)必大大增加操作者選擇優(yōu)良精子的時(shí)間，從而定增加了操作人員的工作強(qiáng)度且降低了工作效率。中國發(fā)明專利《一種ICSI操作皿制作方法KCN104480063A)所公開的，是專門針對(duì)部分男性人類嚴(yán)重少精、梗阻性無精癥患者的ICSI操作皿制作方法，該方法所依據(jù)的原理是:將精子培養(yǎng)基條形微滴由傳統(tǒng)方法的1.0yL，增量100倍為0.1mL，培養(yǎng)基內(nèi)極少數(shù)質(zhì)量好的精子會(huì)向長寬各為(1.8?2.2)cm、(0.4?0.6)cm的條形微滴邊緣移動(dòng)，再從移動(dòng)中的質(zhì)量好的精子中選取一個(gè)，并用帶精子的顯微穿刺針將精子注射至卵子內(nèi)即完成ICSI操作皿制作，采用該方法雖能在短時(shí)間內(nèi)找到并吸取質(zhì)量較好精子完成ICSI操作，減少卵子在培養(yǎng)箱外暴露時(shí)間，最大限度的減少溫度、濕度和CO2濃度變化對(duì)卵子紡錘體等超微結(jié)構(gòu)的損傷。但并不能簡(jiǎn)單的將該方法移植到豬ICSI的受精卵制備用操作皿制作中，其原因是:豬ICSI的目的是用來進(jìn)行轉(zhuǎn)基因豬制備，而制備轉(zhuǎn)基因豬所需要移植的胚胎數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于人，因此，豬ICSI時(shí)，需要操作者制備大量ICSI胚胎，需要同時(shí)選取大量高質(zhì)量的精子，若采用《一種ICSI操作皿制作方法》(CN104480063A)所公開的方案，同樣存在效率低下問題;其二是《一種ICSI操作皿制作方法》(CN104480063A)所公開的方案中，培養(yǎng)基內(nèi)僅有極少數(shù)質(zhì)量好的精子向條形微滴邊緣移動(dòng)，同時(shí)需要依靠熟練操作者細(xì)心的觀察才能發(fā)現(xiàn)其中質(zhì)量最好精子，而豬ICSI操作過程中需要一次注入大量含精子培養(yǎng)基，再讓培養(yǎng)基中的高質(zhì)量精子自動(dòng)分選出來，方能達(dá)到縮短操作者選擇精子的時(shí)間，提高豬ICSI操作質(zhì)量，并從一定程度上降低了操作人員的工作強(qiáng)度，提高了工作者的工作效率，達(dá)到省時(shí)省力即可篩選優(yōu)質(zhì)精子的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明是針對(duì)【背景技術(shù)】所提出問題，設(shè)計(jì)一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法，達(dá)到在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大量豬ICSI操作目的，減少豬ICSI操作過程選擇精子的時(shí)間，減少卵母細(xì)胞在空氣中暴露的時(shí)間，提高豬ICSI胚胎的存活率。
[0006]為了達(dá)到所述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法，其特征在于:所述制作步驟及制作條件如下:
步驟一:用6118011200微升移液器吸取150仙的1^-199，在0 60111111的一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿的圓心沿X軸正負(fù)向做一個(gè)長2 ± 0.2cm、寬0.5 ± 0.1?11的長方形^11-199操作液微滴(4)，所述操作液微滴(4)用于放置豬卵母細(xì)胞并進(jìn)行ICSI操作;設(shè)定所述一次細(xì)胞培養(yǎng)皿的圓心為原點(diǎn)；
步驟二:在按步驟一完成的操作液微滴(4)的上側(cè)和下側(cè)平行位置，各做一個(gè)與操作液微滴(4)平行且長寬尺寸相等的濃度為7%?9%的PVP微滴，其中:位于操作液微滴(4)上側(cè)的是上PVP微滴(3 )、位于位于操作液微滴(4)下側(cè)的是下PVP微滴(5 )，所述上PVP微滴(3 )和下PVP微滴(5)均用于精子的制動(dòng)操作；
步驟三:分別在按步驟二中完成的上PVP微滴(3)的上側(cè)和下PVP微滴(5)的下側(cè)，各做三個(gè)10 土 1.0yL的濃度為7%?9%的PVP注射針處理微滴，其中:位于上PVP微滴(3)上側(cè)的三個(gè)微滴是上注射針處理微滴(2)、位于下PVP微滴(5)下側(cè)的三個(gè)微滴是下注射針處理微滴
(6)，所述上注射針處理微滴(2)和下注射針處理微滴(6)均用于顯微注射針注射前的潤洗以及，豬ICSI操作過程中管壁粘有精子時(shí)的注射針處理；
步驟四:在按步驟一完成的操作液微滴(4)的X軸負(fù)向緊靠培養(yǎng)皿的邊緣部位，沿Y軸正負(fù)方向做一個(gè)高I 土 I.0cm、寬0.4 ±0.1cm的第一精液培養(yǎng)微滴(1.1)，所述第一精液培養(yǎng)微滴(1.1)用于放置精子;再在所述第一精液培養(yǎng)微滴(I.I)的中部沿X軸正向，用受精液做一長I ± 0.lcm、寬0.1 ± 0.05cm的用于精子游動(dòng)的精液篩選橋(1.2)；最后在所述精液篩選橋(1.2 )的右端，沿Y軸正負(fù)方向做一高2 ± 0.2cm、寬0.5 ± 0.1 cm的第二精液培養(yǎng)微滴(1.3)。其有益效果是:大量位于第一精液培養(yǎng)微滴(1.1)的精子，經(jīng)沿又窄又長的精液篩選橋
(1.2)正向游動(dòng)，最后能夠順利到達(dá)第二精液培養(yǎng)微滴(1.3)的部分精子即為高質(zhì)量的可用備選精子。
[0007]步驟五:將石蠟油覆蓋在按步驟一?步驟四制作完成的所有微滴及精液篩選橋
(1.2)上; 步驟六:用顯微注射針直接在第二精液培養(yǎng)微滴(1.3)中吸取質(zhì)量較好的精子，再注射在上PVP微滴(3 )或下PVP微滴(5 )中進(jìn)行制動(dòng)，再在上PVP微滴(3 )或下PVP微滴(5 )中吸取制動(dòng)后的精子，在操作液微滴(4)中進(jìn)行注射，注射操作之前，先將注射針置于上注射針處理微滴(2)或下注射針處理微滴(6)共六個(gè)微滴中的任一個(gè)微滴中進(jìn)行潤洗，注射時(shí)，用固定針將卵母細(xì)胞的極體處于12點(diǎn)或者6點(diǎn)鐘位置，注射針從卵母細(xì)胞的3點(diǎn)鐘方向進(jìn)去，注入精子后，輕輕反復(fù)回吸胞質(zhì)，保證精子注射卵母細(xì)胞內(nèi)，注射完成后輕輕退針，完成一個(gè)豬ICSI胚胎的制備。其有益效果是:注射操作之前，先將注射針置于六個(gè)10tiL8%PVP微滴中的任一微滴中進(jìn)行潤洗，以保證注射時(shí)注射針管壁的平滑，避免精子粘在注射針的管壁不能夠順暢的注射入卵母細(xì)胞中。
[0008]所述步驟一中TCM-199操作液微滴(4)的配方為:添加7.Syg/mL細(xì)胞松弛素和4mg/mL牛血清白蛋白的HEPES緩沖的TCM-199 ；
所述步驟四中受精液的配方為:113.1mM NaCL，3mM KCL,7.5mM CaCL2.2H20 ,20mMTri s, I ImM Glucose ,5mM Sodium pyruvate,lOOIU/mL Penicillin,100yg/mLStreptomycin Sulphate，按此配方稱重后，溶于純水中。
[0009]本發(fā)明一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法所依據(jù)的原理是:本發(fā)明中豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法中所做的精子微滴由第一精液培養(yǎng)微滴(1.1)、精液篩選橋(1.2)和第二精液培養(yǎng)微滴(1.3)三部分組成，其中精液篩選橋(1.2)可以作為活力較強(qiáng)精子篩選的通道，活力較強(qiáng)的精子通過精液篩選橋(1.2)較窄的通道快速游出到第二精液培養(yǎng)微滴(1.3)中并很快移動(dòng)至微滴邊緣，操作者在微滴邊緣即可快速吸取大量質(zhì)量較好的精子用于制動(dòng)并進(jìn)行注射，減少了篩選死精子的時(shí)間，同時(shí)避免死精子及精液中雜質(zhì)黏進(jìn)注射針管壁的危險(xiǎn)。
[0010]采用本發(fā)明中提供的技術(shù)方案可以得到如下的效果:
本發(fā)明提供了一種新的豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法，使用過程中，操作者能夠快速、方便的吸取質(zhì)量較好的精子，減少了操作者選擇精子的時(shí)間，提高操作者的注射效率，減少卵母細(xì)胞在空氣中暴露的時(shí)間，提高注射后豬ICSI受精卵的存活率和卵裂率。
[0011]在制備轉(zhuǎn)基因豬時(shí)，由于需要注射大量的豬ICSI胚胎，采用本發(fā)明中提供的方法制作豬ICSI操作皿，可以大大縮短操作者選擇精子的時(shí)間，從一定程度上降低了操作人員的工作強(qiáng)度，提高了工作者的工作效率。
【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法示意圖。
[0013]圖1中標(biāo)記:1.1一第一精液培養(yǎng)微滴，1.2—精液篩選橋，1.3—第二精液培養(yǎng)微滴，2—上注射針處理微滴，6—下注射針處理微滴，3—上PVP微滴，5—下PVP微滴，4 一操作液微滴。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合附圖對(duì)技術(shù)方案的實(shí)施作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換或改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)，本技術(shù)方案中未詳細(xì)述及的，均為公知技術(shù)。
[0015]參見圖1，本發(fā)明一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法，其制作步驟及制作條件如下:
步驟一:用6118011200微升移液器吸取150仙的1^-199，在0 60111111的一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿的圓心沿X軸正負(fù)方向做一個(gè)長2cm、寬0.5cm的長方形TCM-199操作液微滴4，所述操作液微滴4用于放置豬卵母細(xì)胞并進(jìn)行ICSI操作;設(shè)定所述一次細(xì)胞培養(yǎng)皿的圓心為原點(diǎn)；
步驟二:在按步驟一完成的操作液微滴4的上側(cè)和下側(cè)平行位置，各做一個(gè)與操作液微滴4平行且長寬尺寸相等的濃度為8%的PVP微滴，其中:位于操作液微滴4上側(cè)的是上PVP微滴3、位于位于操作液微滴4下側(cè)的是下PVP微滴5，所述上PVP微滴3和下PVP微滴5均用于精子的制動(dòng)操作；
步驟三:分別在按步驟二中完成的上PVP微滴3的上側(cè)和下PVP微滴5的下側(cè)，各做三個(gè)1yL的濃度為8%的PVP注射針處理微滴，其中:位于上PVP微滴3上側(cè)的三個(gè)微滴是上注射針處理微滴2、位于下PVP微滴5下側(cè)的三個(gè)微滴是下注射針處理微滴6，所述上注射針處理微滴2和下注射針處理微滴6均用于顯微注射針注射前的潤洗以及，豬ICSI操作過程中管壁粘有精子時(shí)的注射針處理；
步驟四:在按步驟一完成的操作液微滴4的X軸負(fù)向緊靠培養(yǎng)皿的邊緣部位，沿Y軸正負(fù)方向做一個(gè)高lcm、寬0.4cm的第一精液培養(yǎng)微滴1.1，所述第一精液培養(yǎng)微滴1.1用于放置精子;再在所述第一精液培養(yǎng)微滴1.1的中部沿X軸正向，用受精液做一長lcm、寬0.1cm的用于精子游動(dòng)的精液篩選橋I.2;最后在所述精液篩選橋1.2的右端，沿Y軸正負(fù)方向做一尚2cm、寬0.5cm的第二精液培養(yǎng)微滴1.3。這時(shí)大量位于第一精液培養(yǎng)微滴1.1中的精子，經(jīng)沿又窄又長的精液篩選橋1.2正向游動(dòng)，最后能夠到達(dá)第二精液培養(yǎng)微滴1.3的精子即為高質(zhì)量的可用備選精子。
[0016]步驟五:將石蠟油覆蓋在按步驟一?步驟四制作完成的所有微滴及精液篩選橋1.2 上；
步驟六:用顯微注射針直接在第二精液培養(yǎng)微滴1.3中吸取質(zhì)量較好的精子，再注射在上PVP微滴3或下PVP微滴5中進(jìn)行制動(dòng)，再在上PVP微滴3或下PVP微滴5中吸取制動(dòng)后的精子，在操作液微滴4中進(jìn)行注射，注射操作之前，先將注射針置于上注射針處理微滴2或下注射針處理微滴6共六個(gè)微滴中的任一個(gè)微滴中進(jìn)行潤洗，注射時(shí)，用固定針將卵母細(xì)胞的極體處于12點(diǎn)或者6點(diǎn)鐘位置，注射針從卵母細(xì)胞的3點(diǎn)鐘方向進(jìn)去，注入精子后，輕輕反復(fù)回吸胞質(zhì)，保證精子注射卵母細(xì)胞內(nèi)，注射完成后輕輕退針，完成一個(gè)豬ICSI胚胎的制備。注射操作之前，先將注射針置于其中任意一個(gè)10uL8%PVP微滴中進(jìn)行潤洗，以保證注射時(shí)注射針管壁的平滑，避免精子粘在注射針的管壁不能夠順暢的注射入卵母細(xì)胞中。
[0017]所述步驟一中TCM-199操作液微滴4的配方為:添加7.Syg/mL細(xì)胞松弛素和4mg/mL牛血清白蛋白的HEPES緩沖的TCM-199 ；
所述步驟四中受精液的配方為:113.1mM NaCL，3mM KCL,7.5mM CaCL2.2H20 ,20mMTri s, I ImM Glucose ,5mM Sodium pyruvate,lOOIU/mL Penicillin,100yg/mLStreptomycin Sulphate，按此配方稱重后，溶于純水中。
[0018]本發(fā)明一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法所依據(jù)的原理是:本發(fā)明中豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法中所做的精子微滴由第一精液培養(yǎng)微滴1.1、精液篩選橋1.2和第二精液培養(yǎng)微滴1.3三部分組成，其中精液篩選橋1.2可以作為活力較強(qiáng)精子篩選的通道，活力較強(qiáng)的精子通過精液篩選橋1.2較窄的通道快速游出到第二精液培養(yǎng)微滴1.3中并很快移動(dòng)至微滴邊緣，操作者在微滴邊緣即可快速吸取大量質(zhì)量較好的精子用于制動(dòng)并進(jìn)行注射，減少了篩選死精子的時(shí)間，同時(shí)避免死精子及精液中雜質(zhì)黏進(jìn)注射針管壁的危險(xiǎn)。
[0019]本發(fā)明所用操作皿為美國NEST公司生產(chǎn):型號(hào)705001。
[0020]本發(fā)明中所用顯微注射針為美國Sunlight Medical公司生產(chǎn)，型號(hào)H07047BH。
[0021]在本發(fā)明的描述中，需要理解的是，術(shù)語“中心”、“縱向”、“橫向”、“長度”、“寬度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底” “內(nèi)”、“外”、“順時(shí)針”、“逆時(shí)針”、“軸向”、“徑向”、“周向”等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是為了便于描述本發(fā)明和簡(jiǎn)化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0022]此外，術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括至少一個(gè)該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個(gè)”的含義是至少兩個(gè)，例如兩個(gè)，三個(gè)等，除非另有明確具體的限定。
[0023]在本發(fā)明中，除非另有明確的規(guī)定和限定，術(shù)語“安裝”、“相連”、“連接”、“固定”、“固連”等術(shù)語應(yīng)做廣義理解，例如，可以是固定連接，也可以是可拆卸連接，或成一體;可以是機(jī)械連接，也可以是電連接;可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，可以是兩個(gè)元件內(nèi)部的連通或兩個(gè)元件的相互作用關(guān)系，除非另有明確的限定。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以根據(jù)具體情況理解上述術(shù)語在本發(fā)明中的具體含義。
[0024]在本發(fā)明中，除非另有明確的規(guī)定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接觸，或第一和第二特征通過中間媒介間接接觸。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或僅僅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或僅僅表示第一特征水平高度小于第二特征。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法，其特征在于:所述制作步驟及制作條件如下: 步驟一:用Gilson200微升移液器吸取150yL的TCM-199，在Φ60πιπι的一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿的圓心沿X軸正負(fù)向做一個(gè)長2 ± 0.2cm、寬0.5 ± 0.1 cm的長方形TCM-199操作液微滴⑷，所述操作液微滴(4)用于放置豬卵母細(xì)胞并進(jìn)行ICSI操作;設(shè)定所述一次細(xì)胞培養(yǎng)皿的圓心為原點(diǎn)； 步驟二:在按步驟一完成的操作液微滴(4)的上側(cè)和下側(cè)平行位置，各做一個(gè)與操作液微滴(4)平行且長寬尺寸相等的濃度為7 %?9%的PVP微滴，其中:位于操作液微滴(4)上側(cè)的是上PVP微滴(3)、位于位于操作液微滴(4)下側(cè)的是下PVP微滴(5)，所述上PVP微滴(3)和下PVP微滴(5)均用于精子的制動(dòng)操作； 步驟三:分別在按步驟二中完成的上PVP微滴(3)的上側(cè)和下PVP微滴(5)的下側(cè)，各做三個(gè)10 土 I.0yL的濃度為7 %?9 %的PVP注射針處理微滴，其中:位于上PVP微滴(3)上側(cè)的三個(gè)微滴是上注射針處理微滴(2)、位于下PVP微滴(5)下側(cè)的三個(gè)微滴是下注射針處理微滴(6)，所述上注射針處理微滴(2)和下注射針處理微滴(6)均用于顯微注射針注射前的潤洗以及，豬ICSI操作過程中管壁粘有精子時(shí)的注射針處理； 步驟四:在按步驟一完成的操作液微滴(4)的X軸負(fù)向緊靠培養(yǎng)皿的邊緣部位，沿Y軸正負(fù)方向做一個(gè)高I ± I.0cm、寬0.4 ±0.1 cm的第一精液培養(yǎng)微滴(1.1)，所述第一精液培養(yǎng)微滴(1.1)用于放置精子;再在所述精液培養(yǎng)微滴(1.1)的中部沿X軸正向，用受精液做一長I±0.lcm、寬0.1 ±0.05 cm的用于精子游動(dòng)的精液篩選橋(1.2)；最后在所述精液篩選橋(I.2)的右端，沿Y軸正負(fù)方向做一高2 ±0.2cm、寬0.5 ±0.Icm的第二精液培養(yǎng)微滴(1.3)；步驟五:將石蠟油覆蓋在按步驟一?步驟四制作完成的所有微滴及精液篩選橋(1.2)上； 步驟六:用顯微注射針直接在第二精液培養(yǎng)微滴(1.3)中吸取質(zhì)量較好的精子，再注射在上PVP微滴(3)或下PVP微滴(5)中進(jìn)行制動(dòng)，再在上PVP微滴(3)或下PVP微滴(5)中吸取制動(dòng)后的精子，在操作液微滴(4)中進(jìn)行注射，注射操作之前，先將注射針置于上注射針處理微滴(2)或下注射針處理微滴(6)共六個(gè)微滴中的任一個(gè)微滴中進(jìn)行潤洗，注射時(shí)，用固定針將卵母細(xì)胞的極體處于12點(diǎn)或者6點(diǎn)鐘位置，注射針從卵母細(xì)胞的3點(diǎn)鐘方向進(jìn)去，注入精子后，輕輕反復(fù)回吸胞質(zhì)，保證精子注射卵母細(xì)胞內(nèi)，注射完成后輕輕退針，完成一個(gè)豬ICSI胚胎的制備； 所述步驟一中TCM-199操作液微滴(4)的配方為:添加7.5yg/mL細(xì)胞松弛素和4mg/mL牛血清白蛋白的HEPES緩沖的TCM-199 ； 所述步驟四中受精液的配方為:113.1mM NaCL，3mM KCL,7.5mM CaCL2.2H20 , 20mMTri s, I ImM Glucose ,5mM Sodium pyruvate,lOOIU/mL Penicillin,100yg/mLStreptomycin Sulphate，按此配方稱重后，溶于純水中。
【文檔編號(hào)】C12N5/073GK105861423SQ201610242170
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月19日
【發(fā)明人】張立蘋, 鄭新民, 肖紅衛(wèi), 劉西梅, 畢延震, 李莉, 華再東, 華文君, 任紅艷
【申請(qǐng)人】湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所