一株抗k亞群禽白血病病毒的細胞系及其應用
【專利摘要】本發(fā)明提供一株抗K亞群禽白血病病毒(ALV?K)的細胞系及其應用。將ALV?K env基因插入表達載體，將構建的轉移載體在雞胚成纖維細胞系DF?1中表達，通過Zeocin藥物篩選獲得有Zeocin抗性、穩(wěn)定表達ALV?K env基因的雞胚成纖維細胞系DF?1/K，該細胞系保藏編號為CCTCC No.C201610。對DF?1/K細胞系進行檢測和抗病毒感染分析，發(fā)現DF?1細胞系中表達的ALV?K env蛋白對ALV?K病毒具有超感染抗性，能抵抗滴度為104TCID50的病毒感染復制量，本發(fā)明的DF?1/K細胞系可用于不同亞群禽白血病病毒感染的鑒別診斷，臨床診斷價值顯著，應用前景廣闊。CCTCC NO:C20161020160121
【專利說明】
一株抗K亞群禽白血病病毒的細胞系及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學領域，具體地，涉及一株抗K亞群禽白血病病毒的細胞系及其應 用。
【背景技術】
[0002] 禽白血病病毒(ALV)屬于反轉錄病毒科禽α型反轉錄病毒群，。禽白血病病毒與肉 瘤病毒緊密相關，常統(tǒng)稱為禽白血病/肉瘤病毒。根據細胞感染范圍、干擾譜和囊膜抗原特 征，過去常將禽白血病/肉瘤病毒群進一步區(qū)分為A到J等10個亞群，其中A、B、C、D、E、J亞群 主要見于雞。A、B、J亞群是常見的外源性病毒，C、D亞群是極少報道的外源性病毒。近年來在 一些中國地方雞品系中新發(fā)現了K亞群禽白血病病毒。
[0003] 禽白血病病毒囊膜蛋白（env基因編碼的病毒糖基化蛋白）是該類病毒的主要表面 蛋白，它決定病毒感染的宿主范圍，能誘導產生中和抗體。該蛋白與靶細胞表面特異性受體 識別、結合，是病毒進入細胞，復制所必需的。感染特定亞群ALV后，細胞表面病毒受體能被 該病毒產生的env基因編碼的病毒糖基化蛋白封閉，表現出強大的超感染抗性，能限制相應 病毒的再次感染。
[0004] 目前禽白血病對我國養(yǎng)禽業(yè)的危害嚴重，并出現了髓細胞瘤型和血管瘤型等多種 病理表現型，在臨床表現上還容易與網狀內皮組織增生癥、馬立克氏病等腫瘤性疾病相混 淆。該病主要為垂直傳播，控制本病有效的措施是降低種雞群的感染率和建立無白血病的 種雞群，其主要手段是通過對雞群定期進行外源性ALV檢測，及時淘汰帶毒陽性雞，以凈化 和消除雞群中的ALV。在外源性ALV中，以J亞群、A亞群和B亞群禽白血病病毒對雞有明顯的 致病性，對養(yǎng)禽生產的危害也大，而新發(fā)現的K亞群也屬于外源性禽白血病病毒，可能一直 存在于我國地方品系雞群，且已在我國很多地方都分離到該亞群。
[0005] 國內外對于禽白血病病毒的檢測和鑒定方法主要有細胞培養(yǎng)、ELISA、間接免疫熒 光試驗、PCR等，其中ELI SA在臨床上應用最廣，其優(yōu)點是該法操作相對簡便，有商品化的檢 測試劑盒可以利用，其不足之處是不能區(qū)分內源性和外源性ALV;間接免疫熒光試驗比較直 觀，但是往往需要用到特異性抗體(單抗）。能夠區(qū)分不同ALV亞群的PCR引物及其工作體系 已經有報道，但由于K亞群禽白血病病毒為新發(fā)現亞群，其鑒別診斷技術還不完善，沒有特 異性單克隆抗體等，目前主要通過PCR技術，后送測序的方法區(qū)分亞群。
[0006] 在外源性禽白血病病毒的分離上，目前常用的細胞有雞胚成纖維細胞(CEF)和源 于0系雞的成纖維細胞系DF-I。美國ADOL實驗室基于DFl細胞系建立了抗J亞群禽白血病病 毒的DF-1/J細胞系。盡管美國ADOL實驗室有一些特定的雞品系，其產生的原代細胞可以分 別限制特定外源性禽白血病病毒生長，但是這些品系雞的稀有性限制了其效能的發(fā)揮。目 前國內外均沒有可特異性地限制K亞群禽白血病病毒的細胞系的相關報道。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一株特異性的抗K亞群禽白血病病毒的細胞系。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述抗K亞群禽白血病病毒的細胞系的應用。
[0009] 本發(fā)明的抗K亞群禽白血病病毒細胞系的構建方法，包括如下步驟：
[0010] (1)利用帶BamHI和Not頂每切位點的引物從ALV-K(GDFX0601毒株)基因組PCR擴增 enV片段，用限制性內切酶BamHI和No11分別對擴增的enV基因及真核表達質粒pcDNA3 · 1 / Zeo(+ )進行雙酶切，分別純化后將K亞群禽白血病病毒env基因片段連接到pcDNA3.1/Zeo (+ )真核表達質粒，構建成重組質粒pcDNA-env-K;
[0011] (2)轉移載體pcDNA-env-K在DF-I雞胚成纖維細胞系表達的基礎上，通過Zeocin藥 物多次篩選，得到具有Zeocin抗性、可穩(wěn)定表達ALV-K env蛋白的雞胚成纖維細胞系DF-I/ K，即抗K亞群禽白血病病毒的細胞系。
[0012] 本發(fā)明篩選得到的抗K亞群禽白血病病毒雞胚成纖維細胞，命名為DF-1/K，于2016 年1月21日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國武漢武漢大學，中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，簡稱CCTCC，郵編430072)保藏，保藏編號CCTCC No. C201610。
[0013] 本發(fā)明保藏編號為CCTCC No.C201610的細胞系可用于制備ALV-K單克隆抗體。 [0014]進一步，本發(fā)明提供一種ALV-K單克隆抗體，其由保藏編號為CCTCC No.C201610的 細胞系制備得到。
[0015] 本發(fā)明提供了保藏編號為CCTCC No.C201610的抗K亞群禽白血病病毒的細胞系在 制備K亞群禽白血病病毒診斷試劑中的應用。
[0016] 本發(fā)明提供了保藏編號為CCTCC No.C201610的抗K亞群禽白血病病毒的細胞系在 制備K亞群禽白血病病毒抗體檢測試劑中的應用。
[0017]本發(fā)明提供了保藏編號為CCTCC No.C201610的抗K亞群禽白血病病毒的細胞系在 制備K亞群禽白血病病毒生物制品中的應用。
[0018] 所述生物制品為疫苗。
[0019] 本發(fā)明提供了保藏編號為CCTCC No.C201610的抗K亞群禽白血病病毒的細胞系在 制備抗K亞群禽白血病轉基因雞中的應用。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測K亞群禽白血病病毒的試劑，含有保藏編號為CCTCC NO.C201610的抗K亞群禽白血病病毒的細胞系。
[0021] 本發(fā)明的抗K亞群禽白血病病毒的細胞系可應用于K亞群禽白血病病毒的診斷。
[0022] 本發(fā)明提供了一種用于檢測K亞群禽白血病病毒的試劑盒，含有K亞群禽白血病病 毒單克隆抗體，該單克隆抗體由保藏編號為CCTCC No.C201610的抗K亞群禽白血病病毒的 細胞系制備得到。
[0023]本發(fā)明提供了一種用于檢測K亞群禽白血病病毒抗體的試劑盒，含有K亞群禽白血 病病毒單克隆抗體，該單克隆抗體由保藏編號為CCTCC No.C201610的抗K亞群禽白血病病 毒的細胞系制備得到。
[0024] 本發(fā)明提供了用于檢測抗K亞群禽白血病病毒的細胞系的特異性引物對，其上下 游引物序列分別為：
[0025] 上游引物：CGCGGATCCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGATAC
[0026] 下游引物:AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTACACTGCTCCATTTTCG。
[0027]目標片段大小約1791bp。
[0028]含有上述特異性引物對的試劑盒屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0029] 本發(fā)明從ALV env蛋白超感染抗性出發(fā)，將K亞群禽白血病病毒env基因插入 pcDNA3.1/Zeo( + )真核表達載體構建成轉移載體pcDNA-env-K，然后將載體pcDNA-env-K轉 染雞胚成纖維細胞系DF-I，通過藥物Zeocin篩選，獲得抗Zeocin、穩(wěn)定表達ALV-K env蛋白 的抗K亞群禽白血病病毒的細胞系。所得到的抗K亞群禽白血病病毒的細胞系可以穩(wěn)定傳 代，長期保存;能抵抗滴度為IO 4TCID5q的病毒感染復制量，特異性強，本發(fā)明的DF-1/K細胞 系可用于K亞群禽白血病病毒的診斷以及ALV-K疫苗的研制。
【附圖說明】
[0030] 圖1為抗K亞群禽白血病病毒的細胞系構建的技術路線
[0031] 圖2為正常DF-I細胞狀態(tài):纖維狀，梭形，貼壁生長。
[0032]圖3為PCR檢測DF-1/K中env基因結果，用本發(fā)明設計的引物在DF-1/K中成功檢測 到1791bp的env基因，而DF-I中沒有。
[0033]圖4為間接免疫熒光（IFA)檢測env基因表達情況結果，其中圖4A為DF-I細胞（陰性 對照)無綠色熒光，圖4B為DF-1/K細胞有綠色熒光，說明外源env基因片段在DF-1/K中成功 表達。
[0034] 圖5為Western-blot檢測env基因的表達結果，DF-1/K中有env蛋白表達，而DF-I中 沒有，說明外源env片段在DF-1/K中成功表達。Actin為內參蛋白，env蛋白為目的蛋白。 [0035] 圖6為抗K亞群禽白血病病毒(ALV-K)實驗結果，GDFX0601毒株能在DF-I上正常繁 殖，但在DF-1/K上，⑶FX0601不能正常繁殖，只有在病毒滴度為IO5TCID5q時出現復制，但病 毒復制明顯受到抑制，極顯著低于在DF-I上的復制。結果說明，DF-1/K具有很強的抗ALV-K 侵染細胞的能力。
[0036] 圖7為抗J亞群禽白血病病毒(ALV-J CHN06)實驗結果，ALV-J在DF-1/K和DF-I上都 能正常繁殖，繁殖情況沒有顯著差別，說明DF-1/K對ALV-J沒有抗性。
[0037]圖8為臨床病毒分群診斷實例結果，DF-1/K的S/P值顯著低于DF-1，說明DF-1/K對 該ALV有抗性。
【具體實施方式】
[0038]以下實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0039] 本發(fā)明的DF-I細胞系為0系雞胚成纖維細胞，GDFX0601為K亞群禽白血病病毒， CHN06為ALV-J，均來自依托華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院的農業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室。本 發(fā)明所用的限制性內切酶BamHI和Not I購自NEB公司。LA Taq購自TaKaRa公司。pMD18-T載 體購自TaKaRa公司、真核表達質粒pcDNA3 · 1/Zeo( + )購自Invitrogen公司?？笰LV-K單因子 血清，由依托華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院的農業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室提供。FITC標記的 山羊抗鼠 IgG抗體及HRP標記的山羊抗鼠 IgG抗體均購自Simga公司。SQ Tissue組織DNA提取 試劑盒、膠回收試劑盒DNA Gel Extraction Kit、去內毒素質粒抽提試劑盒Plasmid Miniprep Kit為OMEGA公司產品。ALV抗原檢測試劑盒（Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit)為美國IDEXX公司產品。細胞培養(yǎng)物：高糖DMEM培養(yǎng)基粉、0.25 %胰酶(含EDTA)、 胎牛血清為美國GIBCO公司產品；二甲基亞砜(DMSO)為Si gma公司產品。POLOde I iverer3000 轉染試劑盒購自上海銳賽生物技術有限公司。
[0040] 實施例1抗K群禽白血病病毒(ALV-K)細胞系DF-1/K的建立
[0041] 本發(fā)明擴增ALV-K env基因的引物由發(fā)明人自行設計：
[0042] 上游引物：CGCGGATCCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGATAC
[0043] 下游引物：AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTACACTGCTCCAITTTCG
[0044] 反應體系（50yL):LA Taq 25yL、上下游引物各lyL、ddH2021yL、模板2yL。
[0045] 反應程序:94°C預變性3min; 94°C變性30s，55 °C退火Imin，72 °C延伸2min，30個循 環(huán);72°C后延伸8min。
[0046] 用自行設計的上述引物從ALV-K(GDFX0601)基因組中擴增出env片段，按照膠回收 試劑盒DNA Gel Extraction Kit說明書進行回收;按照NEB公司限制性內切酶BamHI、NotI 說明書分別對真核表達質粒pcDNA3.1/Zeo( + )及pMD18-T-env片段進行雙酶切;分別回收酶 切產物，并按照NEB公司T4連接酶說明書對回收產物進行連接，構建重組質粒pcDNA-env-K; 轉化感受態(tài)細胞DH5a，按照OMEGA公司去內毒素質粒抽提試劑盒說明書，進行重組質粒 pcDNA-env-K抽提。質粒送廣州英濰捷基（Invi trogen)公司測序。
[0047]測序正確的質粒按照上海銳賽生物技術有限公司POLOdelivererfOOO轉染試劑盒 說明書進行轉染。
[0048] 消化前期準備的DF-I細胞，鋪六孔細胞培養(yǎng)板，10 % FBS，5 %⑶2、37 °C培養(yǎng)。24h內 進行轉染，Corning公司六孔細胞培養(yǎng)板每孔轉染體系為:2yg pcDNA-e nv-K質粒和IOyL脂 質體分別用10(^L〇pti-lViFJVi@稀釋并孵育5min，然后再混合，共同孵育15min，將200yL質 粒-脂質體復合物加入到準備好的六孔細胞培養(yǎng)皿中。轉染后5h換細胞培養(yǎng)液(DMEM+10% FBS)，24h后將六孔板的一個孔的細胞消化下來，鋪24孔板，每孔500yL細胞培養(yǎng)液(DMEM+ 15%FBS+200yg/mL zeocin)，每隔3-4天換一次同樣體系的細胞培養(yǎng)液，10-15d形成單細胞 集落，三周左右，單細胞集落長大，消化下來置于6孔板內培養(yǎng)，貼壁長滿之后轉入25cm 2細 胞瓶中培養(yǎng)，此時細胞培養(yǎng)物為(DMEM+10%FBS+200yg/mL zeocin)。用藥物zeocin對細胞 連續(xù)篩選30代，從核酸及蛋白水平對細胞內的env進行檢測，并進行抗病毒實驗以及病毒類 型的應用。
[0049 ]細胞狀態(tài):纖維狀，梭形，貼壁生長。（如圖2所示）
[0050] PCR檢測DF-1 /K中env基因：抽提DF-1/K的DNA，按照前述擴增env基因的引物、體系 及反應程序擴增env基因，結果如圖3所示，env基因擴增片段大小為1791bp。
[00511間接免疫熒光（IFA)檢測env基因表達情況:鋪滿單層DF-1/K細胞的24孔板內，培 養(yǎng)5d后，底層細胞用PBS洗3次，用4 %多聚甲醛固定20min。再用PBS洗滌3次，加入1:100稀釋 的ALV-K單因子血清4°C孵育過夜。PBS洗滌3次，加上1:200稀釋的羊抗鼠 IgG-FITC熒光抗 體，37 °C作用Ih，PBS洗滌3次后，加1滴體積分數50 %甘油覆蓋細胞，在熒光顯微鏡下觀察實 驗結果。設立一個DMEM陰性對照。結果如圖4A和圖4B所示，在熒光顯微鏡下可觀察到DF-1/K 細胞的胞漿和表面有特異熒光，DF-I細胞沒有綠色熒光。說明外源env片段在DF-1/K中成功 表達。
[0052] Western-blot檢測env基因的表達:DF-1/K和對照DF-I培養(yǎng)5d后提細胞總蛋白，用 Bio-Rad垂直電泳儀進行電泳，濃縮膠電壓為80V，分離膠電泳電壓為100V，電泳緩沖液為1 XTris-甘氨酸電泳緩沖液，待溴酚藍指示劑達到分離膠底部后停止電泳。切膠轉膜后，將 NC膜用I X TBS洗滌3次，每次5min。將NC膜置于含5 %的脫脂奶粉的TBS中，室溫封閉2h，I X TBST洗滌3次，每次5min。加蛋白和Act in單抗，4 °C孵育12h?？贵w稀釋濃度為env(l: 500)， Actin(l: 1000)。一抗孵育之后，將膜用TBST洗滌3次，每次5min，將NC膜置于1:10000HRP標 記的山羊抗鼠 IgG二抗中，37 °C孵育Ih，I X TBST洗滌3次，每次5min。在暗室中，向NC膜上加 入ECL免疫化學發(fā)光液孵育5min，用保鮮膜包好NC膜置于感光膠片上，顯影，定影，晾干之后 圖片掃描，保存。結果如圖5所示，DF-1/K中有env蛋白表達，而DF-I中沒有。說明外源env片 段在DF-I/K中成功表達。
[0053]本發(fā)明篩選得到的抗K亞群禽白血病病毒雞胚成纖維細胞，命名為DF-1/K，于2016 年1月21日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國武漢武漢大學，中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，簡稱CCTCC，郵編430072)保藏，保藏編號CCTCC No. C201610。
[0054]實施例2抗K群禽白血病病毒(ALV-K)細胞系DF-1/K的生物學活性實驗 [0055] 抗病毒實驗:分別用DMEM將ALV-K毒株⑶FX0601從IOq到IO5進行倍比稀釋。分別消 化DF-1/K細胞和DF-I細胞，各接種于一塊24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種ImL細胞懸液，細胞 濃度為1 · 7 X 105cells/mL。
[0056] 將GDFX0601各病毒稀釋梯度的毒液分別接種于兩板細胞懸液中，每孔接種IOOyL 毒液，每個病毒稀釋梯度做三個重復，并做一個已知毒株的陽性對照和DMEM陰性對照，5% C02、10%FBS、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待接種毒液后第二天，細胞長滿單層后，換為1%FBS的細 胞維持液進行培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)6d，期間持續(xù)監(jiān)測細胞的生長情況，并在第6天收集細胞培養(yǎng) 物，凍融三次后離心收集細胞上清。收集的細胞上清液用同一個批次的ELISA試劑盒進行 P27抗原ELISA檢測。結果如圖6所示，GDFX0601能在DF-I上正常繁殖，但在DF-1/K上， GDFX0601不能正常繁殖，只有在病毒滴度為IO5TCID5q時出現復制，但病毒復制明顯受到抑 制，嚴重低于在DF-I上的復制。結果說明，DF-1/K具有很強的抗ALV-K侵染細胞的能力。 [0057] 用同樣的方法將ALV-J CHN06株接種DF-1/K細胞和DF-I細胞。結果如圖7顯示， ALV-J在DF-1/K和DF-I上都能正常繁殖，繁殖情況沒有顯著差別，說明DF-1/K對ALV-J沒有 抗性。
[0058]臨床病毒分群鑒別診斷實例：如圖8所示，將臨床分離的ALV同時接種DF-I和DF-I/ K，培養(yǎng)7天后，凍融三次后離心收集細胞上清，ELISA檢測，DF-1/K的S/P值明顯低于DF-U 明DF-1/K對該ALV有抗性，初步判斷該ALV為ALV-K。抽提接種該ALV的DF-I細胞DNA，擴增 gp85，回收后送測序，證明該毒株確為ALV-K。
[0059]雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 一株抗K亞群禽白血病病毒的細胞系，其為雞胚成纖維細胞，名為DF-l/K，其保藏編 號為CCTCC N〇.C201610。2. 權利要求1所述的抗K亞群禽白血病病毒的細胞系在制備K亞群禽白血病病毒診斷試 劑中的應用。3. 權利要求1所述的抗K亞群禽白血病病毒的細胞系在制備K亞群禽白血病病毒抗體檢 測試劑中的應用。4. 權利要求1所述的抗K亞群禽白血病病毒的細胞系在制備K亞群禽白血病病毒單克隆 抗體中的應用。5. -種K亞群禽白血病病毒單克隆抗體，其特征在于，由保藏編號為CCTCC No. C201610 的抗K亞群禽白血病病毒的細胞系制備得到。6. 權利要求1所述的抗K亞群禽白血病病毒的細胞系在制備K亞群禽白血病病毒生物制 品中的應用。7. 如權利要求6所的應用，其特征在于，所述生物制品為疫苗。8. 權利要求1所述的抗K亞群禽白血病病毒的細胞系在制備抗K亞群禽白血病轉基因雞 中的應用。9. 一種用于檢測K亞群禽白血病病毒的試劑，其特征在于，含有權利要求1所述抗K亞群 禽白血病病毒的細胞系。10. -種用于檢測抗K亞群禽白血病病毒的細胞系的特異性引物對，其特征在于，其上 下游引物序列為： 上游引物：CGCGGATCCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGCAITTCTGACTGGATAC 下游引物:AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTACACTGCTCCAITTTCG。
【文檔編號】C07K16/10GK105861445SQ201610219276
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月8日
【發(fā)明人】曹偉勝, 饒明章, 袁麗霞, 廖明
【申請人】華南農業(yè)大學