AtPrx64基因在提高植物鋁耐受性上的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了AtPrx64基因在提高植物鋁耐受性上的應(yīng)用，將AtPrx64基因重組到植物表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化野生型煙草，通過篩選獲得轉(zhuǎn)AtPrx64基因煙草；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在鋁脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草的根相對生長量、可溶性蛋白含量隨著鋁濃度的增加而逐漸降低，轉(zhuǎn)基因煙草比野生型降低得少；轉(zhuǎn)基因煙草的H2O2、MDA含量則隨著鋁濃度的增加而逐漸升高，升高的幅度比野生型煙草低；無論有沒有鋁脅迫，在轉(zhuǎn)基因煙草中質(zhì)膜H+?ATPase活性及檸檬酸分泌量均比野生型煙草高；對不同濃度鋁脅迫下的根中鋁含量的測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草根中的鋁含量顯著低于野生型煙草；轉(zhuǎn)AtPrx64煙草能顯著提高煙草對鋁脅迫的耐受性。
【專利說明】
At Pr x64基因在提局植物鍋耐受性上的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及AtPrx64基因在提高植物鋁耐受性上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在植物不同組織器官中每時(shí)每刻進(jìn)行的各種代謝反應(yīng)均會產(chǎn)生活性氧(reactiveoxygen species，R0S)。在正常的生長條件下，植物體內(nèi)的ROS含量較低，不會對植物造成損傷，但是在環(huán)境脅迫如土壤酸化或鹽堿化、干旱、低溫或光照不足以及病菌侵染、損傷時(shí)，植物在形態(tài)、生理、生化等方面會發(fā)生多種變化，致使胞內(nèi)代謝紊亂并產(chǎn)生大量的活性氧。這些ROS對植物有兩方面的作用，一方面活性氧對植物細(xì)胞有很強(qiáng)的毒害作用，能夠引發(fā)植物細(xì)胞組分的氧化，即“氧爆發(fā)”，主要有過氧化氫(H202)、羥基自由基(.0Η)、超氧陰離子自由基(O2-)和單線態(tài)氧、脂類過氧化物等類型。逆境條件下，ROS的產(chǎn)生與清除失衡，自由基在體內(nèi)過量積累，導(dǎo)致膜脂過氧化和膜透性增大，正常生理功能受到破壞，細(xì)胞代謝紊亂，致使植物受到傷害。另一方面ROS作為氧化脅迫過程中的信號分子，在有些代謝過程以及在逆境脅迫感應(yīng)、病原菌應(yīng)答以及植物生長發(fā)育過程中起到重要作用。如，植物受到病原體侵染后，細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS水平會迅速升高從而引起被感染的細(xì)胞死亡；同時(shí)，活性氧參與細(xì)胞壁中糖蛋白交聯(lián)過程，有利于抵御病原體侵入細(xì)胞。然而，大多數(shù)脅迫情況下產(chǎn)生的過量ROS對植物都是有害的，為了適應(yīng)這些非生物脅迫，植物在進(jìn)化過程中，特別是長期生長的逆境環(huán)境中的植物，已經(jīng)形成了一些保護(hù)機(jī)制去感應(yīng)外界不良環(huán)境的信號，并通過形態(tài)和生理上的變化來適應(yīng)逆境。這些保護(hù)機(jī)制主要包括由過氧化物酶(P0D)、過氧化氫酶(CAT)以及抗壞血酸過氧化物酶(APX)等構(gòu)成的酶促脫毒機(jī)制以及由生育酚、胡蘿卜素和甘露醇等非酶類抗氧化劑構(gòu)成的非酶促脫毒機(jī)制。這兩種機(jī)制共同清除逆境脅迫下植物體內(nèi)積累的過量R0S從而緩解逆境脅迫對植物造成的傷害。因此，利用基因工程手段提高植物體內(nèi)抗氧化酶類在植物中的表達(dá)及酶活性，是增強(qiáng)植物抗逆性的有效途徑之一。已有大量研究利用基因工程手段獲得過表達(dá)APX、S0D、CAT植株并顯著提高了植株對氧化脅迫的抗性。如在苜蓿中過量表達(dá)煙草的Mn-SOD顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因苜蓿中的SOD活性，且大田試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株越冬存活率也大大提高。在植物中過量表達(dá)水稻中與POD活性有關(guān)的RCI3冷誘導(dǎo)基因顯著增強(qiáng)了植物對低溫及鹽脅迫的耐受性。此外，一些冷誘導(dǎo)基因、抗凍蛋白基因、滲透調(diào)節(jié)相關(guān)酶基因、脂肪酸去飽和酶基因的過量表達(dá)都可以提高植物的耐低溫能力。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，對抗氧化脅迫的分子機(jī)理的認(rèn)識不斷加深，人們開始采用基因工程手段培育各種抗性新品種。而過氧化物酶對H2O2的親和力極強(qiáng)，在清除植物體內(nèi)活性氧方面起著重要的作用，因此受到人們的廣泛關(guān)注。
[0003]在對擬南芥響應(yīng)鋁脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)有多種第m類過氧化物酶的參與，其中有10種第ΙΠ類過氧化物酶的表達(dá)上調(diào)，包括4七？^2、4七？^27、4七？^49、4七？^62、4七？^64、AtPrx69等。因?yàn)榈讦│邦愡^氧化物酶是一類功能多樣的蛋白，他們在植物中的不同表達(dá)方式可能代表著他們對鋁脅迫過程中的不同響應(yīng)過程，所以對它們的功能分別進(jìn)行研究是非常必要的。在對AtPrx64基因的研究中發(fā)現(xiàn)，其主要在分化的維管束、木質(zhì)部薄壁組織和厚壁組織中表達(dá)，并和厚壁組織的木質(zhì)化相關(guān)，主要定位在下胚軸和根中，并與凱氏帶的形成相關(guān)。但對AtPrx64基因在鋁脅迫過程中的作用還未見報(bào)道，我們將該基因轉(zhuǎn)入煙草中，對轉(zhuǎn)AtPrx64基因煙草的耐鋁能力進(jìn)行了檢測，并對其可能的機(jī)制進(jìn)行了探討。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種基因的新用途，S卩AtPrx64基因在提高植物鋁耐受性上的應(yīng)用，AtPrx64基因?yàn)閿M南芥第三類過氧化物酶基因，GenBank登錄號為:145358744;獲得鋁耐受性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物，可以用于對該基因的進(jìn)一步研究，也可以用于鋁污染土壤的種植。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
(1)選擇了研究較多的一種擬南芥第三類過氧化物酶基因AtPrx64及易于栽培的煙草作為材料，進(jìn)行了以下試驗(yàn)；
(2)采用Gateway技術(shù)構(gòu)建AtPrx64基因的植物表達(dá)載體
用TRIzol Reagent試劑按照說明書提取擬南芥總RNA;參照Fermentas試劑公司說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得AtPrx64的cDNA，使用AtPrx64基因引物[上游弓丨物5'-GGATCCATGAATGCACACATGCTCAATCTCC(含 BamHI 酶切位點(diǎn))，下游為3'-CTCGAGCTAGCGAACCCTTCTGCAGTTAAGT (含Xhc^酶切位點(diǎn))]進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得AtPrx64編碼區(qū)全長DNA片段;通過酶切連接到pMD 18-T載體上，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，通過抗性篩選及測序獲得含正確序列的TA克??；再進(jìn)行酶切連接將片段連接到pENTR-2B載體上，通過抗性篩選及測序獲得入門載體pENTR- AtPrx64;根據(jù)LR反應(yīng)試劑盒LR Clonase? plusEnzyme Mix(購于美國Invitrogen公司)說明書，通過LR反應(yīng)將AtPrx64重組到目的載體PK2GW7上，獲得植物表達(dá)載體pK-35S- AtPrx64;用電轉(zhuǎn)化法將pK_35S_ AtPrx64轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，用篩選檢測正確的農(nóng)桿菌通過葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化野生型煙草，并進(jìn)行以下篩選及檢測；
(3)通過抗性篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株，再進(jìn)行基因組、mRNA水平、蛋白表達(dá)水平及POD活性的檢測，獲得多株轉(zhuǎn)AtPrx64基因煙草(AtPrx64-l至AtPrx64-6)，選取POD活性最高的AtPrx64_6 并擴(kuò)繁；
(4)將野生型煙草和AtPrx64-6煙草在Hongland’s營養(yǎng)液中培養(yǎng)兩周后，選擇長勢一致的健壯植株，用含0.5 mM CaCl2的Hongland’s營養(yǎng)液(pH4.3)預(yù)處理過夜，然后添加0、50、100、200、400 μΜ AlCl3處理，收集根尖，液氮速凍，-80 °(:凍存?zhèn)溆茫詫Ω黜?xiàng)鋁抗性指標(biāo)進(jìn)行檢測;每個(gè)組做6個(gè)重復(fù)，以未加A1C13(0 μΜ)處理的作為對照組。
[0006]本發(fā)明選擇將AtPrx64基因轉(zhuǎn)入煙草中，提高了煙草對鋁的耐受性，將為我們對該基因的功能做進(jìn)一步研究提供材料，也為研究其他相關(guān)基因提供了思路。此外，還可將該轉(zhuǎn)基因煙草用作鋁污染土壤中的栽培品種。
[0007]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所述轉(zhuǎn)AtPrx64基因煙草(AtPrX64-6 )，容易通過無性繁殖的方式保存種質(zhì)資源，可以通過栽培獲得種子進(jìn)行保存，容易推廣種植。此外還可以通過對AtPrx64-6煙草和野生型煙草的結(jié)構(gòu)及生理生化指標(biāo)的比較對AtPrx64基因的功能及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。
【附圖說明】
[0008]圖1是本發(fā)明中對轉(zhuǎn)AtPrx64基因煙草基因組中AtPrx64基因整合情況的檢測；
圖2是本發(fā)明中對轉(zhuǎn)AtPrx64基因煙草AtPrx64 mRNA水平的檢測；
圖3是本發(fā)明中對轉(zhuǎn)AtPrx64基因煙草AtPrx64基因的蛋白表達(dá)水平的檢測；
圖4是本發(fā)明中對轉(zhuǎn)AtPrx64基因煙草中總POD活性的檢測；
圖5是本發(fā)明中不同濃度鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-2、AtPrx64-4、AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根相對生長量變化的比較；
圖6是本發(fā)明中不同濃度鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根中H2O2含量變化的比較；
圖7是本發(fā)明中不同濃度鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根中H2O2的熒光共聚焦圖；
圖8是本發(fā)明中不同濃度鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根中可溶性蛋白含量變化的比較；
圖9是本發(fā)明中不同濃度鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根中丙二醛(MDA)含量變化的比較；
圖10是本發(fā)明中不同濃度鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根中H+-ATPas e活性的比較；
圖11是本發(fā)明中不同濃度鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根中檸檬酸分泌量的比較；
圖12是本發(fā)明中不同濃度鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根中鋁含量的比較。
【具體實(shí)施方式】
[0009]下面通過實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容。實(shí)施例中方法如無特殊說明，按常規(guī)操作進(jìn)行，如無特殊說明使用試劑均為常規(guī)購試劑或按常規(guī)方法配制的試劑，如無特殊說明方法中百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0010]實(shí)施例1:AtPrx64基因CDNA片段的獲得
用TRIzol Reagent試劑按照說明書提取擬南芥總RNA。具體操作步驟如下:取植物嫩葉約0.1g放入加有液氮的研缽中，充分研磨成粉末;加入I mL TRIzoL試劑在研缽中繼續(xù)研磨成溶液狀，室溫靜置5 min后移入2 mL離心管;然后加入200 pL氯仿，振蕩15 s混勻，4°C、12000 rpm離心15min;將上清液轉(zhuǎn)移至新2 mL EP管，加入500 pL異丙醇，混勾，-20。<3放置 10 min；4 °C ^ 12000 rpm離心 10 min;棄上清，沉淀用75% 乙醇0.8-1 mL 清洗；4°C、12000 rpm離心I min，棄75%乙醇；重復(fù)洗I次以徹底出去鹽雜質(zhì)；真空干燥沉淀或自然晾干，用20 UL焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解RNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0011]取2 UL上述DEPC水溶解的RNA進(jìn)行電泳檢測，檢測到RNA提取完好后，再取2 yL總RNA進(jìn)行M-MLV反轉(zhuǎn)錄，方法參照Fermentas試劑公司說明書。反轉(zhuǎn)錄過程如下:2 pL RNA、9pL DEPC處理水、4 pL 01igo(dT)，72 °C金屬浴10 min后立即冰浴5 min，再添加2 pL dNTP和I yL的RNA酶抑制劑，1.5 pL的反轉(zhuǎn)錄酶、5 pL反轉(zhuǎn)錄buffer，42 °C保溫60 min后迅速置于70 °C中使反轉(zhuǎn)錄酶變性，5 min后取出，即獲得擬南芥cDNA。
[0012]根據(jù)GenBank(登錄號為:145358744)上發(fā)表的擬南芥AtPrx64基因序列全長，設(shè)計(jì)POD基因上游引物為5-GGATCCATGAATGCACACATGCTCAATCTCC(含BamHI酶切位點(diǎn))，下游為3-CTCGAGCTAGCGAACCCTTCTGCAGTTAAGT (含XhoI酶切位點(diǎn))。以提取的擬南芥cDNA為模板，以設(shè)計(jì)的AtPrx64引物用Ex Taq酶mix進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，膠回收獲得AtPrx64基因編碼區(qū)全長，即目的片段。
[0013]實(shí)施例2:AtPrx64基因植物表達(dá)載體pK-35S- AtPrx64的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草
將AtPrx64基因的cDNA片段連接到pMD-18T載體上，熱激轉(zhuǎn)化DH5a，通過氨芐青霉素篩選得到有抗性的單菌落，PCR和雙酶切檢測正確后測序，測序工作委托華大基因完成。測序正確的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后連接到入門克隆載體PENTR-2B上，熱激轉(zhuǎn)化DH5a，卡那霉素(Km)篩選得到有抗性的單菌落，雙酶切檢測、測序后擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒獲得入門克隆載體PENTR-2B- AtPrx64。在LR Mix Enzyme作用下，目的載體pK2GW7和入門克隆載體PENTR-2B- AtPrx64和進(jìn)行LR重組反應(yīng)后轉(zhuǎn)化DH5a，經(jīng)壯觀霉素(Spe)篩選檢測后獲得植物表達(dá)載體PK-35S- AtPrx64。
[0014]通過電轉(zhuǎn)化法將pK-35S- AtPrx64轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌pMP90中，Spe篩選獲得陽性克隆菌株，將檢測正確的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后通過葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化野生型煙草，轉(zhuǎn)染后將煙草葉片放在含有Km和頭孢噻肟鈉(Cef)的MS4培養(yǎng)基上誘導(dǎo)外植體發(fā)芽，兩周換一次培養(yǎng)基。待轉(zhuǎn)染的葉片生長出芽后，切下長勢好的芽放入含Cef和Km的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽生根。約I個(gè)月后提取煙草幼苗葉片基因組DNA、RNA和總蛋白，檢測擬南芥AtPrx64在煙草中的整合、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況。
[0015]實(shí)施例3:轉(zhuǎn)基因植株的基因組、mRNA水平、蛋白表達(dá)水平及POD活性的檢測
(1)AtPrx64基因在煙草基因組中的整合情況檢測:用CTAB法從煙草葉片中提取基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測AtPrx64在轉(zhuǎn)基因煙草基因組中的整合情況。取0.1 g煙草的葉片迅速放入液氮中冷凍，在研缽中快速研磨至粉末狀，加入預(yù)熱到65 °C的2 X CTAB緩沖液900 pL(20 mM EDTA，2% CTAB和1.4 M NaCl)，研磨混勻后65 °C水浴15 min，冷卻后加入500 HL氯仿-異戊醇(24:1)混合液上下顛倒搖勻后室溫離心。取上清于EP管后加入等體積的異丙醇和1/10醋酸鈉混勻后置于-20 0C放置20 min，于4 °C離心機(jī)離心20 min。棄上清后，用乙醇清新兩次，真空干燥，最后用RNase的TE緩沖液溶解，37 °C放置20 min后取出用于PCR檢測，有條帶證明有AtPrx64基因的整合，共獲得了 6株整合了擬南芥AtPrx64基因的轉(zhuǎn)基因煙草(如圖1所示)
(2)用RNA提取試劑(TRIzol? Reagent)提取野生型和轉(zhuǎn)基因煙草根的總RNA，提取步驟參照說明書進(jìn)行。取3 Hg的總RNA進(jìn)行RT-PCR，取3 yL總RNA后加入10 yL體系(1.5 yLoligc^P8.5 uL DEPC水)于70°C金屬浴5 min后立即置于冰上，5 min后再加入12 yL的反應(yīng)體系(I pL M-MLVRT、1 pL RNA 酶抑制劑、1.5 pL dNTP、3.5 pL DEPC水、5 pL MLV-byffer)于42 °(:金屬浴，I h后取出于72 °C保溫10 min即獲得煙草的cDNA，放_20°C保存?zhèn)溆?。以反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板進(jìn)行AtPrx64的mRNA表達(dá)分析。有條帶的證明有AtPrx64的mRNA轉(zhuǎn)錄，結(jié)果如圖2所示，野生型煙草無條帶，說明沒有AtPrx64的mRNA轉(zhuǎn)錄，6株轉(zhuǎn)基因煙草均有AtPrx64的mRNA轉(zhuǎn)錄。
[0016](3)轉(zhuǎn)基因煙草中AtPrx64基因的蛋白表達(dá)情況檢測:取0.5 g煙草根，用液氮速凍后充分研磨，加入900 uL蛋白抽提液(100 mM Tris-HCl，pH 8.8,1 mM PMSF、10%甘油及5% PVP和10 mM硫基乙醇)，置于冰上5 min后，4°C，12000 rpm離心5 min后取上清即獲得總蛋白液，Bradf ord法測蛋白含量。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，通過半干式轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF上，5%的脫脂奶粉室溫封閉I h后，用PBS清洗PVDF膜3次，每次5 min;加入1yL的AtPER64 (AtPrx64基因表達(dá)的蛋白)特異性抗體(兔抗，由本實(shí)驗(yàn)室自制)與PVDF膜一起常溫孵育2 h;用PBS清洗PVDF膜3次后，再加入連有辣根過氧化物酶的羊抗兔二抗，常溫孵育Ih;最后加入ECL發(fā)光底物反應(yīng)，凝膠成像系統(tǒng)觀察照相(圖3)。
[0017](4)總過氧化物酶(POD)活性測定(愈創(chuàng)木酚法):總POD活性測定參照Chance等的愈創(chuàng)木酚方法[35]。首先取水培2周的煙草，用0.5 mM CaCl2、ρΗ*4.3的hongland’s營養(yǎng)液預(yù)處理12 h后，再用濃度分別為0、50、100、200、400 μΜ的AlCl3處理12 11后，取0.5 g根用液氮速凍后研磨，加入1.5 mL Tris-HCl (pH 7.0)(內(nèi)含有I mMDTT (二硫蘇糖醇)、20%甘油、I mMGSH (還原型谷胱甘肽)、1 mMASA (抗壞血酸)、1 mM EDTA、5 mM MgCl2)抽提，將抽提液轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，于4 °C、12000 rpm、離心15 min，取上清液待測。反應(yīng)混合液:在50 m L 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)緩沖液中加入28 yL的愈創(chuàng)木酚，于磁力攪拌器上加熱攪拌直至愈創(chuàng)木酷溶解，再加入19 uL的30% H2O2,混合均勻，4 °C保存。酶活測定:取反應(yīng)混合液1.5 mL，加入10 pL的樣品提取液，馬上讀470 nm下的OD值，每個(gè)30 s讀一次，讀3 min。以每分鐘OD值的變化表示酶活的大小。結(jié)果如圖4所示，3個(gè)株系轉(zhuǎn)基因煙草中，AtPrx64-6株系的POD酶活性最高。
[0018]實(shí)施例4:轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)處理的具體步驟如下:
1、實(shí)驗(yàn)材料為轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)組培苗
煙草繼代2周后，挑選大小及根系生長一致的組培苗，在Hongland ’ s營養(yǎng)液中培養(yǎng)兩周后，選擇長勢一致的健壯植株，用含0.5 mM CaCl2的Hongland’s營養(yǎng)液(pH4.3)預(yù)處理過夜，然后添加0、50、100、200、400 μΜ AlCl3處理，收集根尖，液氮速凍，-80 °(:凍存?zhèn)溆?，以對各?xiàng)鋁抗性指標(biāo)進(jìn)行檢測。每個(gè)組做6個(gè)重復(fù)，以未加A1C13(0 μΜ)處理的作為對照組。
[0019]實(shí)施例5:采用實(shí)施例4中水培兩周的煙草，用不同濃度鋁處理24h后的植株，用?財(cái).3的0.5 mM的CaCl2預(yù)處理過夜后，記錄鋁處理前的根長度，然后用不同濃度的0、50、100、200和400 μΜ的AlCl3溶液(含有0.5 mM CaCl2,pH 4.3)分別處理24 h后，記錄鋁處理后的根長度，每個(gè)做6個(gè)重復(fù)。其中以未經(jīng)鋁處理(O μΜ)的煙草作為為對照。相對根生長量(Relative Root Growth: RRG):根相對生長率(RGG) =(鋁處理后的根長-鋁處理前的根長)/(未經(jīng)鋁處理后的根長-未經(jīng)鋁處理前的根長)*100。在鋁脅迫條件下，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的根相對生長量(RRG)均隨著鋁處理濃度的增加而逐漸降低，轉(zhuǎn)基因煙草比野生型降低得少，其中AtPrx64-6最為明顯，結(jié)果如圖5所示，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以AtPrx64-6為材料。
[0020]實(shí)施例6:取實(shí)施例4中用鋁處理24h的煙草，收集煙草根尖0.5 g，立即用液氮研磨速凍研磨，研磨成粉末狀后在立即加入1.5 mL Tris-HCl (pH 7.4)抽提，待研磨成液狀后將抽提液移入2 mL EP管中，4°C，離心機(jī)中離心(12000 rpm),20 min后取出，取上清于新的管子中保存于-20°C備用。
[0021]H2O2含量的測定:根據(jù)Gay和Gebicki的方法，采用二甲酚橙進(jìn)行測定。樣品反應(yīng)體系:82 uL溶液A+820 pL溶液B+150 提取的上清液體，其中，試劑A(200 mL)含0.0872 g(NH4)2S04、0.1835 g FeS047H20、18 M 濃H2SO4 4.58 mL)，試劑B(6 g 山梨醇，0.0234 g二甲酚橙)的比例分別為1:10;將上述體系置于30 °C水浴30 min，用分光光度計(jì)測定560 nm處的吸光度值，空白對照體系:82 uL A溶液+820 pL B溶液+150 pL ddH20。將測得的吸光值帶進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算:y=0.0837x-0.0005 (y為OD值，x為計(jì)算后得到的H2O2濃度(nM))。結(jié)果如圖6所示，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6的H2O2含量隨著鋁濃度的增加而逐漸升高，在轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6中，升高的量顯著低于野生型煙草。
[0022]實(shí)施例7:取實(shí)施例4中用鋁處理24 h的煙草，取2?3 cm根尖，放入含500 pL探針負(fù)載緩沖液(50 mM KCl和10 mM Tris，pH=7.2)中，再加入2 yL H2O2熒光探針染料(H2DCFDA)置于黑暗中20 min，后用激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果如圖7所示，未用鋁處理時(shí)，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6的熒光均很弱，在鋁處理下，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6的熒光亮度明顯高于未用鋁處理的煙草，并且野生型煙草的熒光亮度更強(qiáng)。
[0023]實(shí)施例8:取實(shí)施例4中處理好的根尖0.2g，液氮研磨后加入2 mL蛋白提取緩沖液(100 mM Tris-HClCpH 8.0)，10%甘油，I mM PMSF，10 πιΜβ-巰基乙醇，5% PVP,2 mM EDTA-Na2)，4 °C，12000 rpm離心1 min，取上清，采用Bradf ord法測定蛋白質(zhì)濃度，通過OD595的吸光值，計(jì)算可溶性蛋白濃度。結(jié)果如圖8所示，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6的可溶性蛋白含量隨著鋁處理濃度的增加而逐漸降低，在轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6中，降低的量顯著低于野生型煙草。
[0024]實(shí)施例9:MDA的測定，參照硫代巴比妥(TBA)的方法，硫代巴比妥(TBA)和丙二醛(MDA)在高溫及酸性環(huán)境下會反應(yīng)生成紅棕色物質(zhì)3，5，5-三甲基惡唑2，4-二酮，在532 nm的光下有最大吸收峰。將提取的50 uL樣品加入到400 uL 0.6% TBA溶液中(TBA先在溶解于少許的I M NaOH中溶解后用10%TCA定容至100 mL)，再加入350 pL ddH20混勻，80 °(:水浴10 min，用分光光度計(jì)(島津uvmin1-1240)測532 nm和450 nm處的吸光值，計(jì)算公式:MDA含量(μΜ)=6.450D532-0.560D45o，對照為Tris-HCl。結(jié)果如圖9所示，隨著鋁處理濃度的增大，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6的MDA含量也逐漸升高，但是野生型煙草升高的量顯著高于轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6，以上結(jié)果說明轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6對鋁的耐受性更高。
[0025]實(shí)施例10:取實(shí)施例4中鋁處理2 h后的煙草，稱取根組織0.5 g，用錫箔紙包裹迅速放入液氮中速凍后研磨，研磨成粉末狀加入1.5 mL的反應(yīng)勻楽液，反應(yīng)體系中包含I mMEDTA, I mM MgSO4以及10 mM Tris-HCl、0.25 mM山梨醇，溶解后將研磨液轉(zhuǎn)移到2 mL EP管中，4 °C，11000轉(zhuǎn)離心20 min后取上清，于分光光度計(jì)OD595測蛋白濃度，之后取500 yg質(zhì)膜蛋白在0.5 mL的反應(yīng)體系中以啟動反應(yīng)，(反應(yīng)體系包含0.02% Brij、50 mM KCl,4 mMATP-Na2、l mM (NH4) 2Mo04、50 mM KN03、50 mM BTP/MES、1 mM NaN2 混合而成)。之后將反應(yīng)混合物于30°C水浴30 min后，立即加入I mL反應(yīng)終止液(含5% SDS (w/v)、2% H2SO4 (v/V)和0.7% (順4)2 Μο〇4 (*八))后再加入0.5 mL顯色液，置于室溫條件下。約20 min后，用分光光度計(jì)測定波長為660 nm處的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)膜H+-ATPase的活性。將I單位的質(zhì)膜H+-ATPase活性定義為:30 °C的反應(yīng)條件下，在I分鐘內(nèi)每mg蛋白催化ATP分解釋放無機(jī)磷酸的μΜ數(shù)。結(jié)果如圖10所示，無論有沒有鋁脅迫，在轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6根中質(zhì)膜H+-ATPase活性均比野生型煙草高，并且隨著鋁濃度的增加雖然兩者的H+-ATPase活性均呈下降趨勢，但轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6始終高于野生型煙草，說明轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6能通過提尚氣栗活性來提尚植物對招的耐受性。
[0026]實(shí)施例11:取實(shí)施例4中鋁處理12h后的營養(yǎng)液，收集處理液，過濾后用真空干燥儀抽干后溶于I mL蒸餾水中，用高效液相色譜儀測檸檬酸的分泌量。結(jié)果如圖11所示，無論有沒有鋁脅迫，在轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6中根的檸檬酸分泌量均比野生型煙草高，并且隨著鋁濃度的增加雖然兩者的檸檬酸分泌量均呈下降趨勢，但轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6始終高于野生型煙草，說明轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6可能通過分泌更多的檸檬酸來螯合Al3+阻止鋁進(jìn)入植物根系。
[0027]實(shí)施例12:取實(shí)施例4中鋁處理12h后的煙草根尖烘干至恒重，用灰化爐550 V灰化10 h左右，使用I mL濃硝酸溶解過夜，定容至50 mL，使用ICP法測定鋁的含量(昆明理工大學(xué)分析測試中心進(jìn)行)。結(jié)果如圖12所示，對不同濃度鋁脅迫下的轉(zhuǎn)基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草根中鋁含量的測定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草根中的鋁含量顯著低于野生型煙草。以上結(jié)果說明，轉(zhuǎn)AtPrx64煙草能通過將鋁排出根外來提高煙草對鋁脅迫的耐受性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.AtPrx64基因在提高植物鋁耐受性上的應(yīng)用。
【文檔編號】A01H5/00GK105861459SQ201610324315
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】李昆志, 吳遠(yuǎn)雙, 楊志麗, 陳麗梅, 徐慧妮
【申請人】昆明理工大學(xué)